不同附生基質金釵石斛根際微生物的比較研究

王 鵬,劉宇瑤,陳 林,陳鴻平,王 福,胡 媛,劉友平

成都中醫(yī)藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都 611137

石斛始載于《神農本草經》[1],藥用歷史悠久。金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)始載于《本草衍義》[2],現(xiàn)今使用的金釵石斛為《本草綱目》[3]所載“石斛叢生石上。其根糾結甚繁,干則白軟。其莖葉生皆青色,干則黃色,開紅花……石斛短而中實,木斛長而中虛,甚易分別。處處有之,以蜀中者為勝”。為《中國藥典》2020年版石斛來源之一,以新鮮或干燥莖入藥,具益胃生津,滋陰清熱之功效?！缎滦薇静荨穂4]載:“(石斛)生石上者為勝”?！侗静輬D經》[5]載“亦有生櫟木上者,名木斛,不堪用”?？梢姎v代本草所載石斛的附生基質主要有石質基質和木質基質兩種,且以莖粗壯、節(jié)短、石上生者為質優(yōu)。

金釵石斛主要含生物堿類、多糖類、酚類、黃酮類等化合物[6-8],具有抗氧化、抗腫瘤、抗白內障等藥理作用[6,9,10]。金釵石斛在自然條件下繁殖能力低,生長緩慢及野生石斛的過度開發(fā)破壞,其自然資源幾乎枯竭。近年來隨著人工栽培技術推廣,大棚栽培(附生基質為段木、粗沙石、粗木屑等)和林下仿野生栽培(附生基質為林下石塊、樹木)[11]已成為石斛藥材主要栽培模式,對不同附生基質金釵石斛研究表明附石品質優(yōu)于附樹[12,13]。本課題組報道了兩種附生基質金釵石斛代謝產物及抗氧化活性差異[14],附石栽培金釵石斛代謝產物數(shù)量和相對含量顯著高于附木栽培;附石栽培金釵石斛抗氧化能力高于附木栽培。但由于附生基質與藥材品質相關性研究不深入,且木質基質金釵石斛花、莖等外觀性狀較好,觀賞性強, 致使大量“木斛”流通于市場,影響臨床療效發(fā)揮。

微生物與中藥栽培、品質等密切相關[15]。根際微生物是定殖于植物根部周圍的微生物群落,是植物與環(huán)境進行物質交換的重要媒介[16],根際微生物的多樣性與植物生長環(huán)境存在一定相關性。如北京無喙蘭所在種群的喬木多樣性與其根際微生物多樣性存在一定的相關性[17]。對毛唇芋蘭根際和根內真菌的研究發(fā)現(xiàn),不同部位及不同區(qū)域之間真菌組成、結構及相對豐度存在差異,與生長環(huán)境如濕度、營養(yǎng)條件等密切相關[18]。已有研究表明,蘭科根系微生物(根際微生物和菌根真菌)與蘭科植物生長密切相關(如種子萌發(fā),成分積累、抗病和抗逆性等)[19,20]。對霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛等中藥石斛品種的菌根真菌研究發(fā)現(xiàn)[21-23],其根中廣泛分布子囊菌門,擔子菌門真菌等;不同石斛屬植物菌根真菌的組成與宿主栽培環(huán)境存在一定的相關性[24]。對鐵皮石斛、金釵石斛等石斛屬藥用植物的內生細菌研究表明[20,25],內生細菌的數(shù)量和種類因生境而異,與菌根真菌的定植程度等密切相關。但尚未見到不同附生基質金釵石斛根際微生物多樣性和差異性比較研究的報道,亦未見金釵石斛根際微生物與其菌根真菌相關性的研究報道。

本文運用高通量測序技術,對2類(石質和木質)5種附生基質金釵石斛的根際微生物多樣性和差異性進行了比較研究,以明確不同附生基質金釵石斛根際微生物的分布特點,為金釵石斛為基質-根際微生物-菌根真菌的相關性及其生長發(fā)育、次生代謝產物積累規(guī)律研究奠定基礎,為石斛“生石上者勝”、金釵石斛附生基質的合理選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以2年生金釵石斛的根際微生物為研究對象(選擇不同附生基質上生長正常且無病害的植株(見圖1),挖取根系,置于無菌管中,液氮速凍后轉移至-20 ℃冰箱保存)。所有樣品均采集于貴州省遵義市赤水市天臺鎮(zhèn)赤水信天斛滿堂有限公司實驗大棚,采集時間為2021年4月15日。方法為Z字形采樣,樣品經成都中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定系嚴鑄云教授鑒定為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.),樣品基本信息見表1。

表1 樣品信息表

圖1 不同栽培基質金釵石斛Fig.1 D.nobile cultivated in different substrates 注:左:丹霞石塊栽培;右:段木栽培。Note:Left:Danxia stone cultivation;Right:Segment wood cultivation

1.2 實驗儀器與試劑

Bio-rad T100梯度PCR儀(美國BIO-Rad公司);NovaSeq 6000(美國Illumina 公司);CTAB,Nobleryder(北京諾博萊德科技有限公司);Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(M0531S,New England Biolabs,美國);產物純化試劑盒Universal DNA(天根生化科技有限公司);建庫試劑盒NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit(北京NEB公司)。

1.3 實驗方法

使用無菌棉簽擦拭樣品表面,剪下棉簽部分,采用CTAB法提取樣品總DNA,脂糖凝膠電泳檢測提取出的DNA純度和濃度(無準確數(shù)值),隨后取適量DNA于離心管中,用無菌水稀釋至1 ng/μL,用于PCR擴增并對產物濃度進行等量混樣和純化。使用文庫構建試劑盒構建文庫進行安捷倫5400檢測和Q-PCR定量,文庫合格后,使用NovaSeq 6000進行上機測序。

1.4 數(shù)據處理

對Illumina NovaSeq測序得到的下機數(shù)據(Raw PE)進行拼接和質控,得到Clean Tags,再進行嵌合體過濾,得到用于分析的有效數(shù)據(Effective Tags)。對所有樣本的Effective Tags,以97%的一致性(identity)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,然后對OTUs進行物種注釋;并對OTUs進行物種相對豐富、Alpha Diversity以及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 OTU分析結果

為研究各樣本的物種組成,對Illumina NovaSeq測序得到的下機數(shù)據(Raw PE)進行拼接和質控,得到Clean Tags,再進行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(Effective Tags)。對所有樣本的Effective Tags,以97%的一致性(identity)進行OTU(operational taxonomic units)聚類,然后對OTUs的序列進行物種注釋。不同附生基質金釵石斛根系微生物“屬”水平物種分布見圖2、圖3。

圖2 細菌屬水平物種分布圖Fig.2 Distribution map of horizontal genus of bacteria

圖3 真菌屬水平物種分布圖Fig.3 Distribution map of horizontal genus of bacteria fungi注:一種顏色代表一個物種,色塊長度表示物種所占相對豐度比例;為使視圖效果最佳,只顯示豐度水平前10的物種,其他物種合并為Others在圖中顯示,Unclassified前綴表示未分類注釋的物種。Note:A color represents a species,and the color block length represents the relative abundance ratio of the species;For the best view effect,only the species with the top 10 abundance levels are displayed,while other species are combined as Others and shown in the figure.The Unclassified prefix indicates species that are not classified and annotated.

由圖2可知,在屬水平,不同附生基質金釵石斛細菌種類相同,總體豐度前十的細菌屬有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、埃希菌屬(Escherichia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、蔓生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),變形菌屬(Proteobacteria)、顆粒菌屬(Granulicella)、毛螺菌屬(Lachnospira)、Acidipila菌屬以及unidentified_Chloroplast菌屬。其中,糞大腸桿菌在JMK中豐度最低,僅占0.56%,在DMZP中豐富最高,達到6.2%。CSS中前十細菌屬的相對豐度占比最低,DMZP與DXSK中前十細菌屬的相對豐度占比相近(DMZP:28.7%;DXSK:28.8%)。除JMK組外,其余各組均有1至3個顯著的優(yōu)勢菌屬;與其余4組相比,CSS優(yōu)勢菌屬并未顯示出突出的優(yōu)勢。此外,各組內前十細菌屬的相對豐度占比亦存在差異,可能為樣本采集誤差。

由圖3可知,在屬水平,不同附生基質金釵石斛的真菌種類存在差異,總體相對豐度前十的真菌屬為粉褶菌屬(Entoloma)、枝孢屬(Cladosporium)、枝頂孢屬(Acremonium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、子囊菌屬(Ascomycetes),以及unidentified_Cantharellales_sp菌屬、unidentified_Sebacinales_sp菌屬、Sistotrema菌屬、Stereocaulon菌屬、Zasmidium菌屬。其中,unidentified_Cantharellales_sp菌屬(擔子菌門)在五種不同栽培基質上相對豐度占比均是最高的,為最顯著的優(yōu)勢菌屬。除DXSK、CSS組外,其余三組均有除unidentified_Cantharellales_sp菌屬的1至2個優(yōu)勢菌屬;DXSK、CSS組除unidentified_Cantharellales_sp菌屬外各菌屬相對豐度占比較平衡。SPK組中粉褶菌屬相對豐度占比達15.9%,其余四組相對豐度占比極低。DXSK組中,unidentified_Cantharellales_sp菌屬(擔子菌門)相對豐度占比達64.4%,較其余菌屬為極顯著的優(yōu)勢菌屬(總相對豐度占比為2.7%)。各組內前十真菌屬的相對豐度占比亦存在差異,考慮個體差異所致。

2.2 Alpha多樣性分析結果

五組樣品的Alpha多樣性(Alpha diversity)指數(shù)如表2所示。Alpha多樣性分析可以反映樣本內微生物群落的豐富度和多樣性。由表2和表3可知,五組樣品的真菌與細菌的OUT覆蓋率均在0.992以上,表明本次測序結果能較準確地反映樣本中微生物的真實情況。以Chao1指數(shù)評估物種豐富度,各組物種豐富度大小順序為:DXSK>SPK>DMZP>CSS>JMX(細菌);SPK >JMX>CSS>DMZP>DXSK(真菌)。以ACE指數(shù)評價物種豐富度,各組物種豐富度大小順序為:DXSK>SPK>DMZP>CSS>JMX(細菌);JMX>SPK>DMZP>CSS>DXSK(真菌)。綜合上述兩個指標,細菌物種類型豐富度在DXSK、SPK、DMZP基質中較高;真菌物種類型豐富度在JMX和SPK基質中較高;DXSK基質中細菌物種豐富度最高而真菌物種豐富度最低。

表2 細菌Alpha多樣性指數(shù)表

表3 真菌Alpha多樣性指數(shù)表

以Simpson指數(shù)為指標評價物種多樣性,各組的多樣性大小順序為:CSS>SPK>DXSK>DMZP= JMX(細菌);DMZP>SPK>CSS>JMX>DXSK(真菌)。以Shannon指數(shù)為指標,各組的多樣性大小順序為:SPK>CSS>DXSK>DMZP>JMX(細菌);DMZP>SPK>JMX>CSS>DXSK(真菌)。綜合Simpson和Shannon兩個指標,SPK、CSS細菌多樣性較大;DMZP、SPK真菌多樣性較大。DXSK基質真菌物種多樣性較差,即物種均一性較差,說明DXSK基質上優(yōu)勢菌群更為突出。不同基質細菌物種多樣性較好,物種均一性較好,說明不同附生基質金釵石斛根系細菌趨向一種相互制約平衡的狀態(tài), 這與真菌形成顯著優(yōu)勢菌群的情況存在差異。

2.3 主成分分析結果

應用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法基于不同樣品OTU水平的PCA分析結果見圖4。由細菌的主成分分析圖(見圖4A)可知,兩大主成分之和大于30%,PC1和PC2分別解釋不同細菌群落16.35%和14.25%的信息,占比相似。基于兩大主成分的結果,不同附生基質金釵石斛樣品可分為四類:DMZP為一類,SPK為一類,CSS和DXSK為一類,JMX為一類。

圖4 細菌和真菌的主成分分析圖Fig.4 The PCA plot of bacteria and fungi 注:每種顏色代表一組樣品,點代表各個樣品。橫、縱坐標分別表示第一主成分、第二主成分,百分比表示對樣品差異的貢獻值;左:細菌;右:真菌。Note:Each color represents a set of samples,and dots represent each sample.The horizontal and vertical coordinates represent the first principal component and the second principal component,respectively,and the percentage represents the contribution value to the sample difference;Left:Bacteria;Right:Fungi.

由真菌的主成分分析圖(見圖4B)可知,兩大主成分之和大于33%,PC1和PC2分別解釋不同真菌20.21%和13.25%的信息。根據分析結果,可將不同樣品分為3組:CSS為一組,JMX為一組,DXSK、SPK、DMZP為一組。

2.4 細菌群落分布特征

通過16S rRNA高通量測序得到序列數(shù)據, 運用OUT分析、Alpha多樣性分析與主成分分析可知細菌在不同附生基質中的分布規(guī)律。基于OUTs分析結果,共得到56個門,112個綱,275個目,377個科,621個屬。在門水平,主要為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota),占金釵石斛根系細菌50%以上。在屬水平,細菌優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、糞桿菌屬,分別為DXSK、DMZP與SPK、DXSK、DMZP的優(yōu)勢菌屬;以及各組相對占比較高的unidentified_Chloroplast菌屬。由于優(yōu)勢菌屬的制約,導致DXSK、DMZP、SPK中雖物種豐富度較高,但均一性相對較差。

2.5 真菌群落分布特征

通過ITS高通量測序得到序列數(shù)據, 結合OUT分析、Alpha多樣性分析與主成分分析結果,共得到13個門,47個綱,123個目,273個科,503個屬。在門水平,主要為擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota),相對豐度占比70%以上。在屬水平,各組unidentified_Cantharellales_sp菌屬相對占比較高;粉褶菌屬、枝孢菌屬分別為SPK、CSS中的優(yōu)勢菌屬。unidentified_Cantharellales_sp菌屬為DXSK中的絕對優(yōu)勢菌屬,這可能與DXSK為石質基質,真菌生長所需的營養(yǎng)含量少,生存條件惡劣導致抗逆性強的真菌相對豐度逐漸增加,成為絕對的優(yōu)勢菌屬。優(yōu)勢菌屬的制約,導致真菌物種均一性較差,與細菌物種趨向一種相互制約平衡的狀態(tài)存在差異。

2.6 細菌及真菌功能預測分析

使用FAPROTAX和FunGuild軟件分別推測細菌和真菌的功能。并對5組不同附生基質金釵石斛樣本中豐度排名前25的子功能注釋構建聚類熱圖,結果見圖5。5組樣本功能注釋結果類似,但相對豐度存在差異。細菌方面主要為化學異養(yǎng)型、參與硝酸鹽呼吸、亞硝酸鹽呼吸等;真菌方面主要為動植物病原體、腐生生物和寄生或共生真菌等。在細菌方面木質基質(SPK、JMX、DMZP)中,化學異養(yǎng)型及參與硝酸鹽呼吸、亞硝酸鹽呼吸的相對豐度較高;而在石質基質(CSS、DXSK)中光能自養(yǎng)型的相對豐度較高。在真菌方面,木質基質中腐生生物、動植物病原體的相對豐度較高,而石質基質中的寄生或共生真菌相對豐度較高。

圖5 細菌(A)和真菌(B)的功能預測分析圖Fig.5 Functional prediction analysis diagram of bacteria (A) and fungi (B)

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn),不同附生基質根際微生物群落組成不同,說明附生基質是影響金釵石斛根際微生物物種多樣性和相對豐度的因素。在門水平,優(yōu)勢細菌為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門;優(yōu)勢真菌主要為擔子菌門和子囊菌門,這與李和劉等[21,22]菌根真菌的研究結果一致,說明擔子菌門和子囊菌門與石斛屬植物生長發(fā)育密切相關。在屬水平,石質基質真菌優(yōu)勢菌屬為unidentified_Cantharellales_sp菌屬,細菌優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、糞桿菌屬、unidentified_Chloroplast菌屬;木質基質真菌優(yōu)勢菌屬為unidentified_Cantha-rellales_sp菌屬、粉褶菌屬,細菌優(yōu)勢菌屬為糞桿菌屬。

本研究首次報道金釵石斛根際真菌在石質基質(CSS、DXSK)上優(yōu)勢菌屬更為明顯,這可能與環(huán)境脅迫有關。附生基質是附生植物根系吸收營養(yǎng)和水分的重要介質,其生長發(fā)育受附生基質理化性質如營養(yǎng)條件、水分、pH等影響[26];石質基質較木質基質在營養(yǎng)條件、水分等更為惡劣,導致石質基質上抗逆性強或能光能自養(yǎng)或能與寄主共生的菌屬相對豐度逐漸增加,形成優(yōu)勢菌屬。植物生長環(huán)境與微生物組成相關,如在干旱環(huán)境下的沙漠玫瑰、醉蝶花、蘆薈等3種植物的根際微生物組成表現(xiàn)出高度的一致性[27],與本文研究結果相似;對水稻的根際、根表面和根內部的微生物組研究發(fā)現(xiàn)在根際未定殖的微生物在根內部也未定殖[28];表明根際微生物組成會影響植物內生菌的種類和豐度。不同附生基質根際真菌差異可能會影響其菌根真菌的形成,進而影響金釵石斛生長發(fā)育、次生代謝產物的積累,導致金釵石斛品質差異,但三者之間的關聯(lián)性有待進一步研究。功能預測分析結果表明,不同附生基質細菌和真菌功能基因相對豐度存在差異,木質基質上富集了更多對植物有害的致病及寄生功能基因,石質基質則富集了更多光能自養(yǎng)和共生功能基因。表明附生基質是影響金釵石斛根際微生物群落功能的關鍵因素。研究結果表明,附生基質對根際真菌的影響更為明顯。

本研究基于高通量測序技術,比較了不同附生基質的金釵石斛根際微生物的組成、分布等特點,從菌根真菌以外的一個方面來研究不同附生基質金釵石斛品質存在差異的原因,證明了根際真菌在不同附生基質上相對豐度存在差異,填補了金釵石斛根際微生物研究的空白,為本草所載石斛“生石上者勝”、進一步研究根際真菌與菌根真菌的關聯(lián)性奠定基礎,為金釵石斛品質差異形成機制研究以及實際生產中附生基質的合理選擇提供依據。