基于譜效關(guān)系和成分敲除探討?yīng)氁晃犊傸S酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分

陳瑞鑫,康點(diǎn)點(diǎn),詹琥珀,蔣桂華,3*,蔣運(yùn)斌*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137;2西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院,重慶 400000;3成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,成都 611137

中藥獨(dú)一味(Lamiophlomis Herba,LH)為唇形科植物獨(dú)一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分,系藏族習(xí)用藥材,也常作中藥使用?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版載其具有活血止血、祛風(fēng)止痛的功效,可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、黃水病[1]。其藏藥名“大巴”“打布巴”,先后記載于藏醫(yī)著作《月王藥診》《四部醫(yī)典》《晶珠本草》等,迄今已有1 200年的應(yīng)用歷史[2];《晶珠本草》中記載“獨(dú)一味,固精髓,引流黃水”[3],表明獨(dú)一味可應(yīng)用于“黃水病”的治療。而根據(jù)臨床表現(xiàn),藏醫(yī)記載的“黃水病”可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,由“痹證”發(fā)展而來的“骨痹”、“歷節(jié)病”等與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)”臨床特征性表現(xiàn)更為貼近[4]。因此,獨(dú)一味具有治療RA的潛力[5],現(xiàn)有研究也表明了獨(dú)一味具有抗RA的藥效[6-8]。

RA是一種以慢性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其病理特點(diǎn)表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞“腫瘤樣”增生以及血管翳的形成,其中成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是其主要的效應(yīng)細(xì)胞[9]。目前,RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確,其發(fā)病率和致殘率均較高,且通常潛伏發(fā)病,疾病晚期可能導(dǎo)致不同程度無法逆轉(zhuǎn)的殘疾,屬世界衛(wèi)生組織規(guī)定的現(xiàn)代難治病[10]。臨床上常用于治療RA的化學(xué)藥物如非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和生物制劑,前3種化學(xué)藥物不良反應(yīng)明顯,而生物制劑昂貴的價(jià)格限制了其長期應(yīng)用[11]。故開發(fā)臨床新型低副作用且療效穩(wěn)定的抗RA藥物顯得尤為必要。

課題組前期首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)獨(dú)一味抗RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味對(duì)RA的治療作用與其23種成分相關(guān),其中黃酮類成分?jǐn)?shù)量占比接近40%,提示黃酮類成分在獨(dú)一味抗RA的過程中發(fā)揮了重要作用,尤其是木犀草素;并提出獨(dú)一味抗RA的主要機(jī)制可能是通過抑制PI3K-Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡[12]。同時(shí),通過大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型對(duì)獨(dú)一味抗RA的作用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明獨(dú)一味總黃酮具有良好的抗RA作用[13]。獨(dú)一味總黃酮可能是其抗RA的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,但獨(dú)一味總黃酮中抗RA的關(guān)鍵藥效成分還不明確,亟待進(jìn)一步研究。因此,本研究擬通過譜效關(guān)系和成分敲除技術(shù),對(duì)獨(dú)一味總黃酮中抗RA的關(guān)鍵成分進(jìn)行探討,旨在為臨床運(yùn)用獨(dú)一味治療RA提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥材及樣品制備

13批不同產(chǎn)地獨(dú)一味藥材樣品信息見表1,所有樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為唇形科植物獨(dú)一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分。

表1 獨(dú)一味樣品信息

獨(dú)一味總黃酮樣品的制備:取獨(dú)一味藥材粉末100 g加入滲漉桶中,加入95%乙醇水沒過粉末,靜置24 h后開始提取。95%乙醇水適當(dāng)流速滲漉,收集滲漉液,于50 °C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,待回收至約30 mL時(shí)將濃縮的滲漉提取液與預(yù)處理的聚酰胺粉拌勻,在50 °C水浴蒸干,上樣于已處理好的聚酰胺色譜柱,放置24 h。先以高純水(3倍柱體積)洗脫至無色,然后用70%乙醇水溶液(14倍柱體積)洗脫,并收集70%乙醇水洗脫液,減壓濃縮,即得獨(dú)一味總黃酮。基于該方法課題組制備得到的13批獨(dú)一味總黃酮純度范圍在55.82%～94.12%,純度平均值為80.62%。

1.1.2 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);KQ-500VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XSP-37XB倒置生物顯微鏡(上海民儀電子有限公司);SYNERGY H1BioTek多功能微孔板檢測儀(安捷倫科技有限公司);ZF-90紫外分析儀(溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠)。

1.1.3 試劑與試藥

色譜純乙腈(美國TEDIA公司);色譜純甲酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司);超純水;分析純甲苯、甲酸乙酯、甲酸、三氯化鋁(成都市科隆化學(xué)品有限公司);二甲基亞砜(河北品科研生物科技有限公司);Fetal Bovine Serum血清(天杭生物有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

對(duì)照品木犀草苷(批號(hào)MUST-21111817)、木犀草素(批號(hào):MUST-21072311)、綠原酸(批號(hào):MUST-21070910)購自成都曼思特生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人滑膜組織由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科肖游君副主任醫(yī)師提供,其取自正在接受膝關(guān)節(jié)滑膜切除術(shù)或全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的活動(dòng)期RA患者(患者年齡在35～68歲之間);中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究中涉及的所有研究方案(No.[2017]-049)。

將取自RA患者的滑膜組織精細(xì)切成小片,用膠原酶(1 mg/mL)在37 ℃消化3 h,終止消化后,分離FLS細(xì)胞,將其置于10% FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜的建立

1.2.1.1 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.2%甲酸水溶液,梯度洗脫(0～15 min,8%→13% A;15～25 min,13% A;25～35 min,13%→17% A;35～55 min,17% A;55～70 min,17%→38% A;70～80 min,38% A);檢測波長為245 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為29 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.1.2 供試品溶液的制備

取13批獨(dú)一味總黃酮樣品各0.1 g,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,混勻,過濾,取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜即得。

1.2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定木犀草苷、木犀草素、綠原酸對(duì)照品3 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇配置成0.3 mg/mL的對(duì)照品溶液,搖勻過0.22 μm濾膜,即得。

1.2.1.4 方法學(xué)考察

精密度考察:取獨(dú)一味總黃酮樣品(S1),按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,并記錄HPLC圖譜。

重復(fù)性試驗(yàn):取獨(dú)一味總黃酮樣品(S1)6份,按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,并記錄HPLC圖譜,考察該方法的重復(fù)性。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取獨(dú)一味總黃酮樣品(S1),按“1.2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法,分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件記錄HPLC圖譜,考察樣品穩(wěn)定性。

1.2.2 獨(dú)一味總黃酮對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響

1.2.2.1 樣品的制備

取不同批次獨(dú)一味總黃酮樣品,使用前溶解于DMSO中,再配制成所需濃度的含藥細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

RA-FLS細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定參照已有研究方法[14,15],設(shè)不含細(xì)胞和藥物的空白組、含細(xì)胞不含藥物的對(duì)照組和不同批次獨(dú)一味總黃酮給藥組(64 μg/mL),采用顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),將生長良好的FLS細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),并采用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,將懸浮好的細(xì)胞,以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。給藥組加入對(duì)應(yīng)濃度的獨(dú)一味總黃酮,空白組和對(duì)照組加入等體積的含DMSO培養(yǎng)液。

1.2.2.3 獨(dú)一味總黃酮對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響

待細(xì)胞生長貼壁,棄去培養(yǎng)基,用0.1% DMSO溶解獨(dú)一味總黃酮,使其在加入細(xì)胞培養(yǎng)孔后的濃度為64 μg/mL,每孔100 μL,孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2 h。使用多功能微孔板檢測儀在450 nm波長測定吸光度,按照公式(1)計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞抑制率=

(A對(duì)照-A試驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)× 100%

(1)

其中,A對(duì)照為細(xì)胞未經(jīng)藥物處理組的吸光度值,A試驗(yàn)為細(xì)胞經(jīng)藥物處理組的吸光度值,A空白為空白組,即無細(xì)胞、無藥物組的吸光度值。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,服從正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA),組間比較采用LSD,當(dāng)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎譜效關(guān)系的建立

將獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜共有峰峰面積和對(duì)應(yīng)FLS細(xì)胞活力抑制率數(shù)據(jù)組成原始數(shù)據(jù)矩陣,進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘回歸分析,建立獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的譜效關(guān)系。

1.2.4 基于成分敲除研究獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分

在基因敲除模式的影響下,成分敲除技術(shù)被逐漸引入到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中,該技術(shù)具有明顯的中醫(yī)藥特色,可將中醫(yī)藥理論的整體觀、系統(tǒng)觀運(yùn)用于實(shí)際,并突顯中醫(yī)藥多成分協(xié)同拮抗的豐富內(nèi)涵[16]。木犀草素為木犀草苷的糖苷元,可能是由于天然黃酮類成分常以苷類形式存在[17],獨(dú)一味總黃酮HPLC圖譜中木犀草苷含量明顯高于木犀草素?；诖?本研究擬采用薄層敲除法對(duì)獨(dú)一味總黃酮中木犀草苷成分進(jìn)行成分敲除,考察木犀草苷是否為獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分。

1.2.4.1 對(duì)照品溶液的制備

取木犀草苷對(duì)照品0.4 mg,精密稱定,以70%乙醇水制備成含木犀草苷0.04 mg/mL的對(duì)照品備用溶液。

1.2.4.2 供試品溶液的制備

取獨(dú)一味總黃酮0.04 g,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇水溶解,搖勻,作為供試品溶液。

1.2.4.3 薄層色譜條件

展開劑選用甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸(2∶4∶1),顯色劑應(yīng)用5%的三氯化鋁乙醇溶液,在紫外光燈(365 nm)下對(duì)木犀草苷予以鑒定。

1.2.4.4 敲除樣品的制備

用注射器吸取適量供試品溶液畫線于活化的硅膠板,另用毛細(xì)管吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于畫線條帶的兩端。將硅膠板放入已用展開劑飽和的層析缸中,展開,取出,晾干。將畫線條帶部分以玻璃板覆蓋,于硅膠板兩端部位噴以顯色劑,加熱1 min后置紫外燈下檢視。

挖取未噴顯色劑的目標(biāo)成分色帶部分(與木犀草苷對(duì)照品顯相同斑點(diǎn)的色帶部分)并合并其他色帶部分得目標(biāo)成分和目標(biāo)陰性成分的硅膠混合物,如圖1。另取硅膠板點(diǎn)樣,展開后刮取全部硅膠,得獨(dú)一味總黃酮的硅膠混合物。

圖1 敲除樣品制備圖Fig.1 Knockout sample preparation chart注:樣品S1及木犀草苷對(duì)照品(左);去除目標(biāo)成分條帶(中);目標(biāo)陰性成分(右)。Note:Sample S1 and luteoloside reference substance (left);Stripes for removing target components (middle);Target negative component (right).

1.2.4.5 敲除樣品的成分表征

在薄層板上挖取并合并足夠量的吸附有目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨(dú)一味總黃酮全成分樣品的硅膠,分別置于具塞錐形瓶中,加入5倍量甲醇,超聲提取3次,每次1 h,合并提取液。將提取液于8 000 r/min離心5 min,合并上清液,濃縮,以甲醇定容至2 mL,過0.22 μm微孔濾膜兩次,即得目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨(dú)一味總黃酮全成分的樣品溶液。采用HPLC對(duì)目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨(dú)一味總黃酮全成分樣品溶液中的成分進(jìn)行表征。HPLC色譜條件同指紋圖譜研究條件,進(jìn)樣量為60 μL。

1.2.4.6 敲除樣品的細(xì)胞藥效學(xué)研究

RA-FLS細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法同“1.2.2”。

1.2.5 等摩爾量木犀草苷和木犀草素對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響

基于譜效關(guān)系結(jié)論,通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[18],本研究擬對(duì)比20 μmol/L的木犀草苷與20 μmol/L木犀草素對(duì)FLS細(xì)胞活力影響的差異,以更好地闡明獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2.5.1 樣品制備

取木犀草苷或木犀草素適量,精密稱定,用0.1% DMSO溶解,使其在加入細(xì)胞培養(yǎng)孔后的濃度為20 μmol/L。

1.2.5.2 細(xì)胞藥效學(xué)研究

基于CCK-8法考察20μmol/L木犀草苷和20 μmol/L木犀草素成分對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響,實(shí)驗(yàn)步驟同“1.2.2”。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜的建立

2.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

方法學(xué)考察結(jié)果顯示重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度RSD均小于3.0%,表明該方法良好,可用于獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜的研究。

2.1.2 指紋圖譜的建立

將13批獨(dú)一味總黃酮的HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.130723》,設(shè)置S3號(hào)樣品為參照?qǐng)D譜,以中位數(shù)為對(duì)照指紋圖譜生成方法,時(shí)間窗口寬度為0.1 min,通過多點(diǎn)校正和自動(dòng)匹配生成了指紋圖譜對(duì)照?qǐng)D譜,確定了8個(gè)共有峰,13批獨(dú)一味總黃酮色譜疊加圖見圖2,樣品圖和對(duì)照品圖見圖3。

圖3 混合對(duì)照品及獨(dú)一味總黃酮樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference substance and total flavonoid sample from LH注:A:混合對(duì)照品;B:獨(dú)一味總黃酮樣品;1:綠原酸;4:木犀草苷;8:木犀草素。Note:A:Mixed reference solution;B:Total flavonoid sample of LH;1:Chlorogenic acid;4:Luteoloside;8:Luteolin

2.1.3 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.130723》對(duì)13批獨(dú)一味總黃酮HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),相似度計(jì)算結(jié)果依次為:0.999、0.996、0.997、0.986、0.998、0.980、0.909、0.974、0.991、0.983、0.988、0.990、0.969,均大于0.9,表明各批次指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜有較好的相似性。

2.2 獨(dú)一味總黃酮對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果,與對(duì)照組比較,各批次獨(dú)一味總黃酮均能顯著抑制FLS細(xì)胞的活力,不同批次獨(dú)一味總黃酮細(xì)胞活力抑制率見表2。

表2 不同批次獨(dú)一味總黃酮對(duì)FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

2.3 獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎譜效關(guān)系的建立

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

將13批獨(dú)一味總黃酮共有峰峰面積及對(duì)應(yīng)FLS細(xì)胞活力抑制率數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSSPRO在線分析平臺(tái)中,以13批獨(dú)一味總黃酮8個(gè)共有峰峰面積為母因素,FLS細(xì)胞活力抑制率為子因素,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式選擇標(biāo)準(zhǔn)化,分辨系數(shù)取0.5,計(jì)算獨(dú)一味總黃酮共有峰峰面積和FLS細(xì)胞活力抑制率的灰色關(guān)聯(lián)度[19],結(jié)果見表3。

表3 共有峰峰面積與細(xì)胞活力抑制率灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果

獨(dú)一味總黃酮共有峰峰面積與FLS細(xì)胞活力抑制率關(guān)聯(lián)度值越大,表明該成分對(duì)于獨(dú)一味總黃酮發(fā)揮治療RA的藥效越重要。由表可知,8個(gè)共有峰與RA-FLS細(xì)胞活力抑制率的關(guān)聯(lián)度均在0.6以上,表明獨(dú)一味總黃酮抗RA活性是多種成分共同作用的結(jié)果,各共有峰對(duì)FLS細(xì)胞活力抑制率的貢獻(xiàn)程度為4號(hào)峰>6號(hào)峰>1號(hào)峰>3號(hào)峰>5號(hào)峰>7號(hào)峰>2號(hào)峰>8號(hào)峰,其中4號(hào)峰為木犀草苷,8號(hào)峰為木犀草素。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析

以標(biāo)準(zhǔn)化處理后的8個(gè)共有峰(記為X1～X8)峰面積為自變量,標(biāo)準(zhǔn)化處理后的不同批次獨(dú)一味總黃酮細(xì)胞活力抑制率為因變量,導(dǎo)入SIMCA 14.1作偏最小二乘回歸分析(PLS)。變量投影重要性(VIP)值和偏回歸系數(shù)分別見圖4和5。

圖4 各共有峰峰面積和細(xì)胞活力抑制率VIP值Fig.4 VIP value of common peak area and cell activity inhibition rate

圖5 各共有峰峰面積和細(xì)胞活力抑制率偏回歸系數(shù)Fig.5 Partial regression coefficient of common peak area and cell activity inhibition rate

由圖可知,獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜中峰3、4、8與FLS細(xì)胞活力抑制率呈正相關(guān);同時(shí)VIP值越大(VIP>1),表示自變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng),以FLS細(xì)胞活力抑制率為指標(biāo),VIP值從大到小的峰號(hào)為峰4、7、8、5、3、2、1、6,其中峰4、7、8VIP值均大于1;根據(jù)PLS分析,4號(hào)峰和8號(hào)峰為獨(dú)一味總黃酮中與FLS細(xì)胞活力抑制率關(guān)聯(lián)較大的化學(xué)成分。

2.3.3 譜效關(guān)系的建立

通過建立獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜,運(yùn)用CCK-8法檢測獨(dú)一味總黃酮對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響,并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析和PLS回歸分析建立了獨(dú)一味總黃酮抗RA的譜效關(guān)系,揭示了獨(dú)一味總黃酮中的化學(xué)成分與抗RA藥效之間的關(guān)系,結(jié)果表明獨(dú)一味總黃酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA藥效中發(fā)揮了主要作用。

2.4 基于成分敲除研究獨(dú)一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分

2.4.1 敲除樣品的成分表征

目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨(dú)一味總黃酮樣品的HPLC色譜圖見圖6。

圖6 敲除樣品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of knockout samples注:A:木犀草苷對(duì)照品;B:目標(biāo)成分樣品;C:目標(biāo)陰性成分樣品;D:薄層制備獨(dú)一味總黃酮全成分樣品。Note:A:Luteoloside reference substance;B:Target component sample;C:Target negative component sample;D:Thin layer preparation of the total flavone sample of LH.

由圖中可知,目標(biāo)陰性成分與獨(dú)一味總黃酮樣品相比,木犀草苷峰面積明顯降低,且除木犀草苷外其他峰均保留較好,表明該方法對(duì)獨(dú)一味總黃酮中木犀草苷成分進(jìn)行了有效敲除。目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨(dú)一味總黃酮樣品中木犀草苷的峰面積分別為:15.633 6、3.657 0和20.497 0,計(jì)算得到木犀草苷敲除率為76.27%,回收率為94.11%。

2.4.2 敲除樣品的細(xì)胞藥效學(xué)研究

細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,獨(dú)一味總黃酮全成分組、目標(biāo)成分組均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力(P<0.01),而目標(biāo)陰性成分組與對(duì)照組之間無顯著抑制效果。表明木犀草苷在獨(dú)一味總黃酮發(fā)揮治療RA藥效的過程中起到了關(guān)鍵作用。

表4 各組樣品對(duì)FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

2.5 等摩爾量木犀草苷和木犀草素對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,木犀草苷組和木犀草素組均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力(P<0.01);木犀草苷組和木犀草素組比較對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但木犀草素抑制率數(shù)值有明顯升高趨勢。

表5 木犀草苷和木犀草素對(duì)FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

3 討論與結(jié)論

基于高效液相色譜-二級(jí)線性陣列檢測器法(high performance liquid chromatography with diode array detector,HPLC-DAD)完成了獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜的初步研究,各批次獨(dú)一味總黃酮樣品指紋圖譜與建立的對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.9,表明不同批次獨(dú)一味總黃酮樣品中含有的化學(xué)成分具有一致性。課題組前期考察了獨(dú)一味總黃酮不同給藥濃度和不同給藥時(shí)間對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響,基于此采用CCK-8法在64 μg/mL給藥濃度處理FLS細(xì)胞48 h條件下,考察了不同批次獨(dú)一味總黃酮樣品對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明13批獨(dú)一味總黃酮樣品均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力?；讵?dú)一味總黃酮指紋圖譜和細(xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘(PLS)回歸分析建立獨(dú)一味總黃酮抗RA的譜效關(guān)系,結(jié)果表明獨(dú)一味總黃酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA藥效中發(fā)揮了主要作用?；诒由V法對(duì)獨(dú)一味總黃酮中含量較高的木犀草苷成分進(jìn)行有效敲除,并結(jié)合CCK-8法測定各樣品對(duì)FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明全成分和目標(biāo)成分樣品能夠顯著抑制FLS細(xì)胞活力,目標(biāo)陰性成分樣品對(duì)FLS細(xì)胞活力無顯著抑制效果。同時(shí)比較了等摩爾量木犀草苷和木犀草素成分對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明木犀草苷和木犀草素均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力,但木犀草素組與木犀草苷組之間無顯著差異。

綜上,本研究結(jié)果表明木犀草苷和木犀草素成分在獨(dú)一味總黃酮抗RA的藥效中發(fā)揮了主要作用,結(jié)合獨(dú)一味總黃酮指紋圖譜研究中木犀草苷的含量明顯高于木犀草素,表明木犀草苷(C21H20O11)為獨(dú)一味總黃酮抗RA的關(guān)鍵成分。能夠?yàn)榕R床運(yùn)用獨(dú)一味總黃酮治療RA提供一定的科學(xué)依據(jù)。木犀草苷廣泛存在于多種藥用植物中,在抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖等方面作用明顯,且毒副作用較小[20]。雖然木犀草苷成分較為常見,但目前關(guān)于木犀草苷抗RA的相關(guān)文獻(xiàn)較為匱乏,本研究采用CCK-8法考察了木犀草苷對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響,明確說明了木犀草苷具有抑制FLS細(xì)胞活力的作用,后續(xù)可進(jìn)一步通過建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行體內(nèi)藥效驗(yàn)證,并對(duì)其作用通路進(jìn)行闡釋,為臨床運(yùn)用獨(dú)一味總黃酮治療RA提供更多的參考和依據(jù)。