鹿茸菇子實體新纖溶酶的高效分離純化

陳嘉欣,鄧永平, 2*,李冠龍, 2,劉曉蘭, 2*,肖 凱

1齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院;2黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室,齊齊哈爾 161006

血栓栓塞性疾病致殘、致死率極高[1]。血纖維蛋白是構(gòu)成血栓的主要成分,因此,促進血纖維蛋白降解是預(yù)防和治療血栓性疾病的常見手段[2]。外源纖溶酶,如尿激酶(UK)、鏈激酶(SK),因其能夠間接或直接水解纖維蛋白而被廣泛應(yīng)用于血栓栓塞性疾病的臨床治療中。雖然它們具有顯著的溶栓療效,但也有一定的應(yīng)用局限性如半衰期短、副作用較大等[3]。因此,尋找專一性強、安全性好、副作用低的新型纖溶酶成為目前的研究熱點。

食用菌富含蛋白質(zhì)、多糖、萜類、氨基酸、甾醇類、核苷類等物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種生理功能[4,5]。目前食用菌來源的纖溶酶及其功能性質(zhì)的研究受到廣泛關(guān)注。已有報道從多種食用菌中分離提取到了纖溶酶,如香菇(Lentinusedodes)[6]、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)[7]、茶樹菇(Agrocybeaegerita)[8]、黃綠口蘑(Tricholomasejunctum)[9]、紫丁香蘑(Lepistanuda)[10]、阿魏菇(Pleurotusferulae)[11]等。

鹿茸菇是一種木腐型食藥兼用菌,廣泛分布于北半球溫帶地區(qū),具有抗氧化、提高免疫功能、抑制腫瘤、降血脂等生理功能[12]。在前期的實驗中發(fā)現(xiàn),鹿茸菇子實體浸提液中含高活力纖溶酶,顯著高于現(xiàn)有報道的其他食用菌來源的纖溶酶。本文介紹了鹿茸菇子實體中纖溶酶的分離純化方法,并對該酶進行了初步鑒定,目前本課題組尚未見與鹿茸菇纖溶酶相關(guān)的其他報道。本文的研究可為開展鹿茸菇纖溶酶的溶栓抗栓功能性試驗提供基礎(chǔ),也可為其用于開發(fā)功能性食品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿茸菇子實體(批號:6951370171033,古田縣天鮮農(nóng)產(chǎn)品有限公司);Octyl-Sepharose Fast Flow(Octyl-Sepharose FF)疏水相互作用層析介質(zhì)(批號:10012531,GE Life Sciences);SP-Sepharose High Performance(SP-Sepharose HP)強陽離子交換層析介質(zhì)(批號:10020356,GE Life Sciences);Source 15PHE疏水相互作用層析介質(zhì)(批號:10070744,GE Life Sciences);牛血清白蛋白(批號:20200508,含量:97%,上海生工生物工程公司);(NH4)2SO4(色譜純)(批號:1919BA0020,上海生工生物工程公司);NaCl(色譜純)(批號:1429BA0015,上海生工生物工程公司);SDS-PAGE電泳標準蛋白(批號:BC02DA0005,上海生工生物工程公司);纖維蛋白原(批號:B20220901,上海經(jīng)科生物有限公司);凝血酶(批號:720220502,上海經(jīng)科生物有限公司);其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

低壓色譜柱 XK 16/20(批號:512377,GE Life Sciences);低壓色譜柱 HR 16/10 CR21G(批號:10012158,GE Life Sciences);高速冷凍離心機(CR22N型,日本日立公司);TU1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);AKTA prime蛋白純化系統(tǒng)(GE Life Sciences)。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)濃度和纖溶酶酶活力測定

采用Folin-酚法[13]測定蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白為標準蛋白,測定640 nm下吸光值;采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力,具體方法見文獻[13]。

1.3.2 鹿茸菇纖溶酶的分離純化

1.3.2.1 粗酶液的制備

鹿茸菇子實體晾干粉碎,取45 g子實體粉末以1∶10(m/V)比例加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(0.02 mol/L、pH 7.4),4 ℃下浸提4 h,4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min,取上清液置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2.2 鹽析條件的確定

將粗酶液分裝至10 mL的離心管中,每管2 mL,按照硫酸銨飽和度表(0 ℃)分別向各管中添加不同質(zhì)量的(NH4)2SO4,使其中(NH4)2SO4飽和度分別為0%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和100%,置于4 ℃冰箱中鹽析24 h,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min得上清液和沉淀,沉淀用2 mL的0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4)溶解,分別測定不同(NH4)2SO4飽和度的上清液以及沉淀復(fù)溶樣品的纖溶酶酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量,繪制(NH4)2SO4鹽析曲線。

1.3.2.3 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析條件優(yōu)化

將鹽析后的粗酶液中硫酸銨飽和度分別調(diào)整至30%和25%,進行Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離,確定樣品的適宜初始鹽濃度。柱型:Φ1.6 cm×20 cm,柱床高度15 cm,蛋白質(zhì)濃度4.85 mg/mL,上樣量100 mL,起始緩沖溶液為含有硫酸銨飽和度30%的0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4);洗脫液為0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4);流速2 mL/min,線性梯度洗脫8倍柱床體積,收集活性組分,測定纖溶酶酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.4 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析預(yù)裝柱優(yōu)化分離條件

將疏水相互作用層析收集的活性組分用Sephadex G-25凝膠層析進行脫鹽并交換緩沖溶液,然后進行強陽離子交換層析法分離。柱型:1 mL預(yù)裝柱,蛋白濃度0.47 mg/mL,上樣量84 mL。起始緩沖溶液為0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 6.0、pH 5.2);洗脫液為含有1 mol/L NaCl的0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 6.0、pH 5.2);流速1 mL/min,線性梯度洗脫8倍柱床體積,收集活性組分,測定纖溶酶酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.5 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析條件放大優(yōu)化

將疏水相互作用層析收集的活性組分用Sephadex G-25凝膠層析進行脫鹽并交換緩沖溶液,研究強陽離子交換層析法的放大實驗條件。柱型:Φ1.6 cm×20 cm,柱床高度15 cm,蛋白濃度0.47 mg/mL,上樣量84 mL。起始緩沖溶液為0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 5.2);洗脫液為含有0.3 mol/L NaCl的0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 5.2);流速2 mL/min,線性梯度洗脫8倍柱床體積,收集活性組分,測定纖溶酶酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.6 Source 15PHE疏水相互作用層析條件優(yōu)化

將離子交換層析收集到的活性組分調(diào)整硫酸銨進行Source 15PHE疏水相互作用層析分離,柱型:Φ1.6 cm×10 cm,柱床高度5 cm,蛋白濃度1.2 mg/mL,上樣量5 mL,起始緩沖溶液為含有硫酸銨飽和度25%、10%的0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4);洗脫液為0.02 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4);流速2 mL/min,線性梯度洗脫8倍柱床體積,收集活性組分,測定纖溶酶酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 纖溶酶的純度和相對分子質(zhì)量的測定

參考Liu等[7]的方法,采用Native-PAGE電泳,觀察樣品是否為單一條帶判斷纖溶酶純度;采用SDS-PAGE電泳法測定纖溶酶的相對分子質(zhì)量[7]。

1.3.4 纖溶酶的N-端序列測定

采用Edman降解法測定纖溶酶的N-端序列。將纖溶酶溶液滴在PVDF膜上,放置到PPSQ33A全自動蛋白質(zhì)/多肽測序儀反應(yīng)器中,通過軟件PPSQ-30 Analysis設(shè)置參數(shù)進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹿茸菇纖溶酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析條件的確定

鹽析是對蛋白質(zhì)分離純化研究中常用的粗分離方法,具有操作條件較溫和,蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點。經(jīng)過鹽析可以使粗酶液由大體積轉(zhuǎn)入小體積操作,有利于后續(xù)的純化操作,還能夠去除一部分雜質(zhì)。不同的蛋白質(zhì)由于含有的疏水性氨基酸數(shù)量往往不同,因此表現(xiàn)出不同的鹽析性質(zhì),因此,在對未知蛋白質(zhì)鹽析時需要測定其鹽析曲線。鹿茸菇纖溶酶鹽析曲線見圖1。

圖1 纖溶酶鹽析曲線圖譜Fig.1 Salting out curve of the fibrinolytic enzyme

如圖1所示,上清液中纖溶酶比活力隨著硫酸銨飽和度的增加而逐漸降低,沉淀中纖溶酶比活力隨著硫酸銨飽和度的增加而逐漸升高,在硫酸銨飽和度為75%時達到最大值,在此條件下上清液中的酶活力接近于0,說明當(dāng)硫酸銨飽和度為75%時,可以使纖溶酶可逆沉淀,并去除可溶性的雜質(zhì),使粗酶液濃縮,減小了純化體系,易于后續(xù)分離操作。

2.1.2 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離條件的優(yōu)化

鹽析后的樣品復(fù)溶液中還殘留少量硫酸銨,因此選擇Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析對酶進行分離,省去了脫鹽的步驟,減少了酶活力的損失。該介質(zhì)表面帶有低密度辛基疏水基團,平均膠粒直徑90 μm,載量大且不易造成蛋白質(zhì)的變性失活,適用于粗分離階段使用。由于鹽濃度對疏水相互作用層析的分離效果影響顯著,因此,研究了樣品硫酸銨飽和度分別為30%和25%時的分離效果,分離圖譜見圖2和圖3。

圖2 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析洗脫曲線Fig.2 Elution curves of Octyl-Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography

圖3 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析洗脫曲線Fig.3 Elution curves of Octyl-Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography

如圖2所示,在硫酸銨飽和度為30%時,部分疏水性較弱的雜蛋白(峰1)在衡洗階段被去除,但是一部分雜蛋白的疏水性(峰2、峰4)與目標組分纖溶酶(峰3)疏水性相似,在梯度洗脫中后期同時被洗脫出柱。鹽濃度是影響蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)疏水配基之間的結(jié)合能力的主要因素,當(dāng)鹽濃度過高時,蛋白質(zhì)暴露的疏水性基團增加,就會增加蛋白與介質(zhì)的結(jié)合能力,適度降低緩沖液中的鹽濃度會使疏水性相對弱的雜蛋白(峰2)與填料的結(jié)合能力降低,從而在衡洗階段被洗出柱,實現(xiàn)與目標組分的分離。

調(diào)整樣品和緩沖液硫酸銨飽和度為25%進行層析分離,洗脫曲線見圖3。

由圖3可以看出將硫酸銨飽和度降低至25%時,圖2中的峰2疏水性顯著下降,在衡洗階段被洗脫出柱,目標組分纖溶酶與疏水配基作用依然較強,在洗脫中后期與疏水性更強的雜蛋白先后被洗脫出柱。由此可以看出,鹿茸菇纖溶酶的疏水性較根霉纖溶酶強,當(dāng)硫酸銨飽和度從30%降至25%時,根霉纖溶酶的疏水性減弱明顯,不能與介質(zhì)疏水配基發(fā)生作用。這說明目的蛋白的疏水基團裸露構(gòu)象是線性的漸變過程[14]。

經(jīng)過Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離去除了樣品中的部分雜蛋白,但是由圖3看出,蛋白吸收峰和活性峰沒有很好對應(yīng),而且目標組分與部分雜蛋白疏水性相似,不能實現(xiàn)完全分離,因此,下一步擬采用離子交換層析進一步分離。

2.1.3 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析分離條件的優(yōu)化

SP-Sepharose HP強陽離子交換層析介質(zhì)平均膠粒直徑為34 μm,分辨率較高,常用于純化的中間步驟,緩沖液pH值和洗脫液離子強度是影響其分離效果的主要因素。

采用SP-Sepharose HP強陽離子交換層析預(yù)裝柱(柱體積1 mL)對緩沖液pH值進行優(yōu)化。Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離后的樣品經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾脫鹽和交換緩沖液(pH 6.0),進行SP-Sepharose HP強陽離子交換層析,洗脫曲線見圖4。

圖4 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析洗脫曲線Fig.4 Elution curve of SP-Sepharose HP Strong-cation exchange chromatography

如圖4所示,目標組分纖溶酶在衡洗階段出現(xiàn),說明當(dāng)緩沖液pH為6.0時,與該酶等電點差異不大,酶分子不能與層析介質(zhì)吸附,因此考慮降低緩沖液pH至5.2進行實驗,得到洗脫曲線見圖5。

圖5 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析洗脫曲線Fig.5 Elution curve of SP-Sepharose HP Strong-cation exchange chromatography

如圖5所示,當(dāng)緩沖溶液pH為5.2時,目標組分纖溶酶帶正電荷,能夠與層析介質(zhì)進行吸附,結(jié)合效果較好,該酶在洗脫初始階段即從介質(zhì)上解吸附,因此,確定緩沖溶液pH為5.2。

將上述分離條件進行放大研究,同時將梯度洗脫的鹽濃度范圍由0～1 mol/L縮小至0～0.3 mol/L,以期將其與其后的雜蛋白分離,得到的洗脫曲線見圖6。

圖6 SP-Sepharose HP強陽離子交換層析洗脫曲線Fig.6 Elution curve of SP-Sepharose HP strong-cation exchange chromatography

由圖6所示,經(jīng)過縮小洗脫溶液的鹽濃度范圍后,纖溶酶組分與雜蛋白得到了較好的分離,活性峰與蛋白峰對應(yīng),獲得了較好的分離效果。

2.1.4 Source 15PHE疏水相互作用層析條件優(yōu)化

將經(jīng)過離子交換層析(緩沖液pH 5.2,洗脫液鹽濃度0.3 mol/L)分離得到的活性組分進行Source 15PHE疏水相互作用層析分離。疏水層析要求樣品為高鹽濃度,所以疏水層析常常用于鹽析后或進行離子交換層析分離后。Source 15PHE填料的膠粒直徑為15 μm,配基密度更強,適用于精細分離。

調(diào)整活性組分溶液中硫酸銨飽和度為25%進行Source 15PHE疏水相互作用層析,洗脫圖譜見圖7。

圖7 Source 15PHE疏水相互作用層析洗脫曲線Fig.7 Elution curves of Source 15PHE hydrophobic interaction chromatography

從圖7中可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)溶液中硫酸銨飽和度為25%時,目的酶疏水性較強,在洗脫結(jié)束以后才出現(xiàn),因此,考慮降低溶液中硫酸銨飽和度至10%,以減弱疏水相互作用,得到的洗脫曲線見圖8。

如圖8所示,目標組分纖溶酶在梯度洗脫末期從層析柱中被洗脫出來,蛋白峰與活性峰完全對應(yīng),峰形對稱,說明該酶經(jīng)過此步驟分離后純度進一步提高。

從分離步驟中的細節(jié)優(yōu)化可以發(fā)現(xiàn),有些雜質(zhì)與目標蛋白性質(zhì)極為接近,在每一步純化過程中都盡可能地除去與目標蛋白性質(zhì)相接近的雜質(zhì)。嘗試改變?nèi)芤褐械柠}濃度會使雜質(zhì)與目標蛋白之間的差異明顯化。除了蛋白質(zhì)和疏水性配基本身的疏水性之外,鹽濃度對疏水相互作用的影響最大,在疏水層析分離過程中,鹽濃度高會使疏水相互作用增強,導(dǎo)致蛋白難于洗脫,而且雜蛋白也容易吸附,影響蛋白的分離。但如果鹽濃度太低,目標蛋白會與介質(zhì)吸附不完全[15];在本實驗中,將硫酸銨濃度降低至25%時,恰好使雜蛋白吸附減少并且使目的蛋白在洗脫中期被分離出,達到了較好的分離效果;有利于對蛋白的分離并提高分離效率。

綜上所述,鹿茸菇子實體中的纖溶酶依次經(jīng)過硫酸銨鹽析、Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析、SP-Sepharose HP強陽離子交換層析和Source 15PHE疏水相互作用層析分離純化后,獲得了較好的純化效果。鹿茸菇子實體纖溶酶的活力回收率和純化情況統(tǒng)計如表1所示。

表1 鹿茸菇子實體纖溶酶活力純化表

由表1可知,經(jīng)多步提純后的鹿茸菇纖溶酶比活力由19.92 U/mg提高到4 105.78 U/mg,純化倍數(shù)為206.09,回收率為30.91%,與冬蟲夏草[16]、白靈側(cè)耳[17]等相比回收率較高,目的纖溶酶已經(jīng)達到較好的分離狀態(tài)。

2.1.5 鹿茸菇纖溶酶的純度檢驗和相對分子質(zhì)量確定

利用Native-PAGE檢驗了經(jīng)過純化后鹿茸菇纖溶酶的純度情況,結(jié)果如圖9所示。鹿茸菇纖溶酶在Native-PAGE電泳中呈現(xiàn)出單一條帶,表明樣品已經(jīng)達到了電泳純,并且將條帶位置切下放置在血纖維蛋白平板上面,在37 ℃環(huán)境下保溫孵育,發(fā)現(xiàn)在血纖維蛋白平板上放置膠條的位置出現(xiàn)了透明溶圈,結(jié)果如圖10所示,說明該條帶具有纖溶活性,為目標蛋白。

圖10 纖溶酶活性驗證結(jié)果Fig.10 Verification result of the fibrinolytic enzyme activity

鹿茸菇纖溶酶的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖11所示。

圖11 SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.11 SDS-PAGE electrophoresis pattern注:泳道1為樣品;泳道2為標準蛋白Marker。Note:Lane 1 is the sample;Lane 2 is the standard protein marker.

由圖11可以看出,鹿茸菇纖溶酶在變性電泳中顯示為單一條帶(泳道1),結(jié)合圖9結(jié)果分析,可確定鹿茸菇纖溶酶是由單亞基組成,與標準蛋白Marker(泳道2)對比,可判斷該纖溶酶分子量約為30.9 kDa。

目前已報道的纖溶酶分子質(zhì)量分布范圍較廣。Liu等[7]從蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中分離出兩種纖溶酶,分子質(zhì)量分別為28 kDa和24.5 kDa;Duan等[18]從粗糙脈孢菌分離出的纖溶酶相對分子質(zhì)量約為32 kDa;Li等[8]從茶樹菇子實體分離出的纖溶酶分子量分別為31.4 kDa和21.2 kDa。Deng等[19]從脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)物中提取的纖溶酶為二聚體蛋白,分子質(zhì)量分別為30 kDa和17.5 kDa。很多微生物來源的纖溶酶與本實驗分離出的鹿茸菇纖溶酶分子量接近;但與Shen等[20]從同為離褶傘屬中分離出的纖溶酶分子量差距較大,榆干離褶傘纖溶酶的分子量為50 kDa。小分子量的纖溶酶更易被人體吸收利用,減弱免疫排斥反應(yīng)。

2.1.6 鹿茸菇纖溶酶的N-端序列分析

經(jīng)過Edman法對該酶的N-端氨基酸序列進行測定,其N-端12個氨基酸分別為Gly-Ala-Val-Thr-Gln-Cys-Asn-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(如表2所示),發(fā)現(xiàn)從鹿茸菇子實體中提取到的纖溶酶為一種新型纖溶酶。

表2 鹿茸菇纖溶酶N-端序列與NCBI已知酶的對比情況

3 結(jié)論

本研究采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)從鹿茸菇子實體中分離純化得到了一種纖溶酶,該纖溶酶的N端十二個氨基酸序列為:Gly-Ala-Val-Thr-Gln-Cys-Asn-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu,經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對,該纖溶酶為一種新纖溶酶。該纖溶酶比活力為4 105.78 U/mg,純化倍數(shù)為206.09,活力回收率為30.91%。經(jīng)Native-PAGE電泳和SDS-PAGE電泳檢測,發(fā)現(xiàn)該纖溶酶相對分子量為30.9 kDa。以上結(jié)果表明,來源于鹿茸菇子實體的新纖溶酶具有良好的溶栓潛質(zhì),可用于降低血栓傾向功能食品的開發(fā)。