高效液相色譜測定大蒜原料及大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的方法研究

◎ 李錦晶，李 凡，易 渡，張沿軍

（康寶萊蕾碩（湖南）天然產物有限公司，湖南 長沙 410100）

大蒜在我國的種植歷史悠久，作為食物、香料，在國內的產銷量一直較高。同時，其作為具有藥用價值的食材，在各種疾病的治療中作為傳統(tǒng)民間藥物使用[1]，其健康益處主要與有機含硫成分有關[2-3]。大蒜中的有機含硫化合物主要是蒜氨酸和大蒜素2種活性成分，通常用來表征大蒜和大蒜相關產品的質量。由于蒜氨酸酶的存在，蒜氨酸是相當不穩(wěn)定的，可以迅速轉化為大蒜素；大蒜素性質極不穩(wěn)定，容易分解，不能長期保存。2種活性成分的極性以及穩(wěn)定性差異較大，導致準確測定大蒜及制品中的蒜氨酸和大蒜素含量的方式也差異較大。其中，蒜氨酸通常用液相色譜測定[4-5]；大蒜素有用氣質聯(lián)用儀[6-7]進行測定， 但更多采用分光光度法[8-9]或者反相色譜[10-11]測定。因此，建立一種同時測定2種物質的方法，可以極大提高分析效率。

在本研究中，我們開發(fā)了一種將蒜氨酸標準品轉化生成大蒜素的方法， 并建立了一種控制其轉化的方法。測定方法的關鍵在于防止蒜氨酸轉化為大蒜素，并在樣品制備和分析中，同時穩(wěn)定蒜氨酸和大蒜素。本研究采用改進的柱前衍生的樣品制備方法，不僅可以減少傳統(tǒng)提取方法中常見的干擾，而且可以同時測定蒜氨酸和大蒜素。

1 材料與方法

1.1 材料

蒜氨酸標準品， USP, 目錄# 1012950; 乙腈，HPLC級；乙酸銨，ACS級； 三水合醋酸鈉，ACS ；鄰苯二甲醛（OPA）試劑，安捷倫# 5061-3335 （打開后可在冰箱中保存不超過2周）; 十水四硼酸鈉，GR級；半鹽酸羧甲氧基胺，ACS級 。

1.2 儀器

Waters 2695液相色譜儀，包括泵、脫氣器、自動進樣器、溫度控制模塊和PDA檢測器；分析天平；旋渦混合器；研磨機；超聲發(fā)生器；振蕩器；離心機。

1.3 溶劑準備

①蒜氨酸酶抑制劑溶液（1 mg·mL-1）：100 mg半鹽酸羧甲氧基胺到100 mL純凈水中。②硼酸緩沖溶液（pH 9.0）: 將1.9 g十水四硼酸鈉溶解在約100 mL的純凈水中，用0.2 mol·L-1硼酸調整pH值為9.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 蒜氨酸測試樣品溶液的制備

稱取100 ～1 000 mg （精確到0.1 mg) 之間的粉末樣品裝入35 mL螺旋蓋試管中，加入蒜氨酸酶抑制劑溶液 （1 mg·mL-1） 20 mL，渦旋30 s。超聲15 min，每隔5 min手動搖5 s。用0.2 μm針式過濾器過濾，丟棄前幾滴濾液，收集約5 mL樣品至一個小燒杯中。

1.4.2 衍生化程序

在小瓶中加入硼酸緩沖液50 μL， 樣品液10 μL，渦旋10～15 s，再加入OPA試劑10 μL，旋渦10～15 s，等待2 min左右加入純水130 μL，將此溶液放入HPLC進樣瓶用于分析。

1.4.3 大蒜素測試樣品溶液的制備

稱取100～1 000 mg （精確到0.1 mg）之間的粉末樣品裝入35 mL螺旋蓋試管中，加入20 mL醋酸鈉緩沖液，渦旋30 s左右。超聲15 min，每隔5 min手動搖動5 s。靜置10 min后，加入半鹽酸羧甲氧基胺 約20 mg，渦旋30 s。用0.2 μm針式過濾器過濾，丟棄前幾滴濾液，放入HPLC進樣瓶用于分析。

1.5 測定蒜氨酸及大蒜素的色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA,150×4.6 mm；檢測波長：254 nm、520 nm；流動相A：20 mmol乙酸銨；流動相B：乙腈/水=90/10（體積比）；梯度洗脫程序見表1；樣品溫度：5 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣體積：20 μL（如表1）。

表1 梯度洗脫程序表

1.6 標準溶液準備

1.6.1 蒜氨酸標準原液

精確稱量約10 mg（精確到0.01 mg）蒜氨酸參考標準倒入10 mL容量瓶中，加入約6 mL水，將溶液超聲處理10 min，用水稀釋至刻度，搖勻備用。

1.6.2 蒜氨酸工作標準溶液

工作標準溶液1：將1 mL蒜氨酸原液標準溶液移至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻。工作標準溶液2：將2.5 mL蒜氨酸原液標準溶液移到5 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻。工作標準溶液3：蒜氨酸原液標準溶液作為工作標準溶液3。每次工作溶液使用時，用0.2 μ注射器過濾器過濾儲存溶液，并遵循衍生化程序進行衍生化。

1.6.3 大蒜素工作標準溶液

取1.0 mL蒜氨酸工作標準溶液2（約0.50 mg·mL-1），加入100 μL粗蒜氨酸酶溶液，室溫靜置10 min。用水稀釋，用0.2 μ注射器過濾器過濾。

其中，162.26: 大蒜素的分子量；354.42: 蒜氨酸分子量的2倍。

2 結果與分析

2.1 衍生化溶液pH值對蒜氨酸產率和穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，蒜氨酸面積隨著緩沖液的pH值增加而增加。當緩沖液的pH值在4.0 ～ 5.5之間時，蒜氨酸的衍生轉化效率較低；當緩沖液pH值為5.5～10.0時，蒜氨酸衍生化反應效率轉化較高且沒有明顯變化。伴隨堿度的增加，蒜氨酸衍生化產物變得更加穩(wěn)定。當pH值在9.0～10.0之間時，降解率不超過5%，蒜氨酸穩(wěn)定時間至少為48 h。

圖1pH 值對蒜氨酸穩(wěn)定性的影響圖

2.2 提取液pH值對大蒜素產率和穩(wěn)定性的影響

考察了不同pH值下大蒜素的得率和穩(wěn)定性。在大蒜素樣品的制備過程中，使用了一系列pH值為4.0 ～8.0的提取液。在5 ℃下保存，分別在0、8、10、15和21 d時評價大蒜素的穩(wěn)定性。

結果如圖2所示，當pH值為4.0時，大蒜素產率很低，且沒有明顯變化。當pH值為4.5 ～8.0時，反映出大蒜素在酸性條件下比在堿性條件下更易分解。當pH值在5.0～8.0之間時，大蒜素保持穩(wěn)定至少10 d。綜合考慮大蒜素得率、穩(wěn)定性和蒜氨酸酶活性[12]，選擇pH 6.0的緩沖液作為提取液。

圖2pH值對大蒜素穩(wěn)定性的影響圖

2.3 溫度對大蒜素溶液的影響

考察了大蒜素在不同貯藏溫度下的穩(wěn)定性。提取后，大蒜素樣品溶液分別在室溫和5 ℃下保存0、2、4、10、16和40 h，0、8、10、15和21 d后進行評價。

從圖3、圖4可以看出，大蒜素在溫度為5 ℃時最為穩(wěn)定，15 d后僅略有下降，降解率不超過5%。在室溫（25 ℃）下，該化合物的分解趨勢更為明顯，但呈漸進式，16 h后分解速率為9%。

圖3 25 ℃大蒜素樣品的穩(wěn)定性圖

圖4 5℃大蒜素樣品的穩(wěn)定性圖

2.4 精密度

每個樣品按試驗方法制備6個重復樣品， 將樣品與新配制的標準溶液進行對比分析。計算了各樣品中蒜氨酸和大蒜素的含量。如表2、表3所示，蒜氨酸和大蒜素6個結果的RSD均不大于2%。

表2 大蒜提取物中蒜氨酸及大蒜素的精密度結果表（大蒜提取物， R11255)

2.5 準確度 （加標回收率）測試

考慮到基體干擾方法的準確度，本研究采用標準加入法，已知量的蒜氨酸和大蒜素原液被添加到樣品溶液中，為方便測定， 根據(jù)各樣品中目標化合物本底值不同，分別以3個水平加標，每個水平做3次重復，測量的加標樣品中每個組分的量相對于樣品中相應組分的加入量被計算為回收率。在此基礎上，以精密度試驗得到的大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的濃度，作為試驗樣品中蒜氨酸和大蒜素的基線含量，分別計算了加標樣品中發(fā)現(xiàn)的蒜氨酸和大蒜素的數(shù)量與預期的蒜氨酸和大蒜素的回收率。

如表4所示，蒜氨酸和大蒜素的加標回收率均在80%～120%之間。原料和片劑這兩種基質的方法學驗證結果差別不大， 6種目標化合物的平均回收率在90%～110%, 說明此方法具有較高的穩(wěn)定性和精密度。

表4 大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸的準確度結果表

3 結論

當前，學界許多研究對于蒜氨酸以及大蒜素的測定都是采用分開的方法，而本研究通過柱前衍生化反應，選取pH 6作為萃取條件，使用安捷倫ZORBAX Eclipse AAA色譜柱為分離柱，同時測定蒜氨酸以及大蒜素。樣品再現(xiàn)性以及加標回收率試驗結果表明，該方法準確可靠、精密度較好，可應用于大蒜原料、大蒜片中的蒜氨酸及大蒜素的測定。