微小RNA-21 對膿毒癥小鼠急性肺損傷的改善作用及其機制

葛晨，何聰，劉俊行，付優(yōu)，賈麗靜，龍玲，杜全勝

1 河北省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，石家莊 050000；2 河北省兒童醫(yī)院骨科

膿毒癥患者急性肺損傷 （acute lung injury，ALI）的發(fā)生率可達40%，病死率高達40%～50%。高發(fā)病率和病死率使膿毒癥ALI成為世界范圍內亟待解決的醫(yī)學難題，是導致重癥患者死亡的主要原因之一［1］。膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中炎癥因子釋放及氧化應激會損傷機體細胞、組織和器官，同時炎癥反應和氧化應激相互影響、促進，形成炎癥—氧化應激的惡性循環(huán)，最終導致患者的器官功能障礙和衰竭［2］。近年研究［3］表明，微小RNA（miRNA）在炎癥反應、免疫應答等過程中不可或缺，參與調控膿毒癥、腫瘤、心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展。最新研究［4］發(fā)現(xiàn)，微小RNA-21（miR-21）可抑制血清促炎因子的釋放，同時過表達的miR-21 可通過磷脂酶和張力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PTEN/PI3K/Akt）信號通路拮抗腎臟細胞的凋亡，減輕膿毒癥腎損傷程度。另有研究［5］表明，miR-21-5p 可通過調控PTEN 通路，抑制肺泡上皮細胞的凋亡。本課題組前期研究［6］表明，miR-21 可能通過抑制PTEN，減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應和氧化應激，進而減輕肺損傷。PTEN 是一種雙蛋白脂質磷酸酶，可雙向調節(jié)PI3K/Akt 信號通路［7］。而miR-21是否通過調控PTEN 信號通路，調控下游PI3K/Akt信號通路，從而減輕膿毒癥肺損傷的炎癥反應及氧化應激水平目前相關研究較少。為此，2022 年3—9月，我們觀察了miR-21 對膿毒癥小鼠ALI 的改善作用及肺組織PTEN、Akt 的調控作用，進一步探討miR-21 在膿毒癥ALI 發(fā)生發(fā)展中的具體分子機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康雄性昆明小鼠40 只，體質量25～35 g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，購買后飼養(yǎng)于清潔級動物房，溫度20 ℃左右，濕度40%～60%，自然光照，自由進食、飲水。小鼠腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細胞介素6 （IL-6）ELISA 試劑盒購于杭州聯(lián)科科技公司，小鼠活性氧簇（ROS）、超氧化物歧化酶 （SOD） ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；miR-21 前體腺病毒載體購于美國invitrogen 公司，實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自美國Gene Copoeia 公司，RT-PCR 引物由廣州復能公司設計合成；PI3K/Akt抑制劑LY294002 購于美國MCE 公司，PTEN 抗體和二抗購于美國KPL 公司，磷酸化Akt（p-Akt）抗體和二抗購于美國CST公司。

1.2 小鼠分組及miR-21、LY294002 給予方法 取40 只小鼠，按照隨機數字表法分為miR-21 前體 +ALI 組 （Pre-miR-21 + ALI 組）、miR-21 前體+ LY294002 + ALI 組（Pre-miR-21 + LY + ALI組）、LY294002 + ALI組 （LY + ALI組）、ALI組、假手術組。ALI 組小鼠采用盲腸結扎穿孔術（CLP）造成膿毒癥ALI：術前禁食12 h，予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，固定、備皮、消毒，沿腹正中線行約1 cm切口，分離盲腸，用18號無菌針頭貫穿盲腸，輕微擠壓致少許腸內容物流出，將盲腸還納腹腔后縫合腹壁切口。Pre-miR-21 + ALI 組小鼠先尾靜脈注射miR-21前體腺病毒0.2 mL，4天后采用CLP造成膿毒癥ALI；Pre-miR-21 + LY + ALI 組小鼠先尾靜脈注射miR-21前體腺病毒0.2 mL，4天后尾靜脈注射LY（0.3 mg/g），注射30 min 后進行CLP；LY + ALI組小鼠先尾靜脈注射LY（0.3 mg/g），注射30 min 后進行CLP；假手術組小鼠僅開腹探查盲腸。

1.3 各組小鼠肺損傷程度觀察

1.3.1 各組小鼠氧合指數 （OI） 及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD 檢測 盲腸結扎穿孔術后第24 h時，取各組小鼠，麻醉后開腹取腹主動脈血3 mL，其中1 mL 進行血氣分析，以氧分壓/吸入氧濃度測算OI；另2 mL 低溫離心后取血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD。實驗重復測算3次，取平均值。

1.3.2 各組小鼠右肺組織W/D檢測 “1.3”取腹主動脈血后處死各組小鼠，取右肺上葉，置于4%多聚甲醛中固定，進行石蠟包埋、常規(guī)切片，hematoxylin-eosin， HE染色后顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學變化。另取各組小鼠右肺下葉，吸水紙吸凈后稱重，記錄為肺濕重；再置于70 ℃恒溫箱48 h后復測，記錄為肺干重，測定肺濕重、干重比值為肺組織W/D。

1.4 各組小鼠左肺組織miR-21 檢測 采用RTPCR 法。 取各組小鼠左肺組織，按照RT-PCR 試劑盒說明書提取肺組織RNA，按照miRNA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，以U6 為內參，以2-ΔΔCt代表miR-21 的相對表達量。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，實驗重復測算3次，取平均值。

1.5 各組小鼠左肺組織PTEN、p-Akt蛋白檢測 采用WESTERN Blotting 法。取各組小鼠左肺組織，BCA 法進行蛋白定量，電泳、轉膜、封閉，分別加入PTEN、p-Akt 一抗、二抗孵育、洗膜，化學發(fā)光法顯色，采用Image J 軟件測定目的蛋白的條帶灰度值，以目的蛋白的條帶灰度值與內參GAPDH 灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復測算3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理。通過Shapiro-Wilk 檢驗數據的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠OI 及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD 水平比較 各組小鼠OI及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較見表1。

表1 各組小鼠OI及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較（-x ± s）

2.2 各組小鼠右肺組織病理學變化及W/D 比較假手術組小鼠肺泡結構清晰，肺泡腔內無出血滲出；ALI 組肺泡結構損傷，肺泡腔內可見紅細胞，肺泡間隔增寬，炎性細胞浸潤；Pre-miR-21 + ALI 組肺泡損傷程度、肺泡間隔厚度改善，炎性細胞浸潤減少；Pre-miR-21 + LY + ALI組、LY + ALI組肺泡損傷程度加重，肺泡間隔增厚，炎性細胞浸潤增多，其中LY +ALI 組肺泡損傷程度最重，肺泡間隔增厚、炎性細胞浸潤最明顯。Pre-miR-21 + LY + ALI 組、Pre-miR-21+ ALI組、LY + ALI組、ALI組及假手術組小鼠右肺組織W/D 分別為9.7 ± 1.0、6.1 ± 0.5、12.1 ± 0.9、7.3 ± 0.7、4.0 ± 0.4。與假手術組比較，ALI 組小鼠右肺組織W/D高 （P＜0.05）；與ALI組比較，Pre-miR-21 + ALI 組小鼠右肺組織W/D 低 （P＜0.05），Pre-miR-21 + LY + ALI組、LY + ALI組小鼠右肺組織W/D高 （P均＜0.05）；與Pre-miR-21 + LY + ALI組比較，LY + ALI組小鼠右肺組織W/D高 （P＜0.05）。

2.3 各組小鼠左肺組織miR-21 相對表達量比較Pre-miR-21 + LY + ALI 組、Pre-miR-21 + ALI 組、LY+ ALI組、ALI組及假手術組小鼠左肺組織miR-21相對表達量分別為5.19 ± 0.35、4.29 ± 0.45、2.70 ±0.25、2.26 ± 0.24 及0.96 ± 0.08。與假手術組比較，ALI 組小鼠左肺組織miR-21 相對表達量高 （P＜0.05）；與ALI 組比較，Pre-miR-21 + LY + ALI 組、Pre-miR-21 + ALI 組小鼠左肺組織miR-21 相對表達量高（P均＜0.05）；與Pre-miR-21 + LY + ALI 組比較，LY + ALI 組小鼠左肺組織miR-21 相對表達量低（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠左肺組織PTEN、p-Akt蛋白相對表達量比較 各組小鼠左肺組織PTEN、p-Akt 蛋白相對表達量比較見表2。

表2 各組小鼠左肺組織PTEN、p-Akt蛋白相對表達量比較（-x ± s）

3 討論

ALI是膿毒癥的常見并發(fā)癥，其特征是過度炎癥反應及氧化應激導致細胞凋亡、肺水腫和肺組織功能障礙［8］。首先，膿毒癥會導致大量炎癥因子釋放，其中TNF-α是較早出現(xiàn)的炎癥因子，其能導致炎癥瀑布級聯(lián)反應，激活炎癥細胞促使IL-6等其他炎癥因子大量釋放入血，加重炎癥反應，同時這些炎癥因子能損傷肺泡上皮細胞和肺毛細血管細胞，使肺泡水腫或塌陷，引起肺損傷，導致低氧血癥。其次，炎癥因子還會導致大量活性氧合成和分泌，對穩(wěn)定細胞器和生物膜的蛋白質和脂類產生強氧化作用，使肺組織細胞過度氧化，導致肺組織缺血、水腫，加重肺損傷。

miRNA 能夠與靶基因3’非翻譯區(qū)結合抑制靶基因翻譯，從而調節(jié)蛋白表達，廣泛參與炎癥反應、免疫應答等過程［9］。有研究［4］證實，miR-21 可抑制促炎因子釋放，且miR-21 過表達可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路拮抗腎臟細胞凋亡減輕膿毒癥腎損傷。也有研究［5］指出，miR-21-5p 過表達可通過PTEN 顯著減少肺泡上皮細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，加用miR-21模擬物后肺組織miR-21表達增加，通過外源性加入miR-21 模擬物可使肺組織miR-21 表達上調，且上調miR-21 表達可減輕膿毒癥小鼠炎癥反應和氧化應激反應，進而減輕炎癥因子和氧化應激對肺泡上皮細胞和肺毛細血管細胞的損傷，減輕肺損傷，改善低氧血癥。提示miRNA-21 可能通過與炎癥通路相互作用抑制炎癥反應、減輕氧化應激反應，從而改善肺損傷。

miR-21 通過負向調節(jié)PTEN 進而影響細胞分化、生長、增殖、凋亡進而對各類炎癥性疾病發(fā)揮調控作用［4］。PTEN 是miR-21 的靶基因，miR-21 可通過抑制PTEN 促進腫瘤細胞凋亡［10］。在膿毒癥相關腎損傷中，miR-21 也被證實可通過調控PTEN 減少腎臟細胞凋亡從而減輕腎損傷［4］。PTEN 作為一種雙重特異性磷酸酶，可以雙向調節(jié)PI3K/Akt信號通路［7］。PI3K/Akt 信號通路在調節(jié)炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等過程中起到重要作用［11］。激活PI3K/Akt信號通路，使Akt蛋白磷酸化，可抑制炎癥反應，減少炎癥因子產生，減輕膿毒癥所致的腎損傷及心肌損傷［12］。有研究［13］指出激活PI3K/Akt 信號通路可有效減輕高氧所致的細胞凋亡和氧化應激從而減輕肺損傷。本研究結果發(fā)現(xiàn)miR-21 過表達可抑制 PTEN 蛋白表達，p-Akt蛋白表達增加，促進Akt磷酸化，提示miR-21 可能通過抑制PTEN 導致Akt磷酸化發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。抑制PI3K/Akt通路可加重ALI，而miR-21過表達對ALI中炎癥反應及氧化應激反應的減輕可能與PI3K/Akt 信號通路有關。miR-21預處理后肺組織PTEN蛋白表達下降，p-Akt 蛋白表達增加，促進Akt 磷酸化，而PI3K/Akt 通路抑制劑處理后，p-Akt蛋白表達降低，抑制Akt磷酸化，說明miR-21 在小鼠膿毒癥ALI 中可通過調控PTEN激活PI3K/Akt信號通路。

綜上所述，上調miR-21 表達的膿毒癥小鼠肺組織炎癥反應和氧化應激反應水平低。miR-21 可能通過負向調控PTEN 激活PI3K/Akt通路減輕膿毒癥炎癥反應和氧化應激，從而減輕小鼠膿毒癥ALI。