GeneXpert MTB/RIF和TB-DNA兩種熒光PCR方法檢測(cè)肺外結(jié)核膿液樣本的效能分析

邵燕琴 朱明智 戴玲珊 彭利君 梅賓 方婷婷 蔡龍

肺外結(jié)核的臨床表現(xiàn)不典型,培養(yǎng)是肺外結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn),然而BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“ MGIT 960培養(yǎng)”)至少需要2～3周才能獲得結(jié)果,且敏感度相對(duì)較低。分子檢測(cè)技術(shù)在肺外結(jié)核的早期診斷中得到廣泛應(yīng)用,具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn),為肺外結(jié)核的診斷和治療帶來了新的曙光[1]。

GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)和結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌PCR熒光探針法(簡(jiǎn)稱“TB-DNA”)檢測(cè)均是通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(MTB)的常用分子診斷手段,廣泛應(yīng)用于痰液標(biāo)本的檢測(cè)并在肺結(jié)核的診斷中取得了良好的效果。TB-DNA可以同時(shí)報(bào)告MTB和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的感染情況。雖然Xpert和TB-DNA檢測(cè)技術(shù)已在臨床中廣泛開展[2-4],但在膿液樣本中兩種方法的診斷價(jià)值尚未得到全面評(píng)估。本研究旨在應(yīng)用Xpert和TB-DNA檢測(cè)疑似肺外結(jié)核患者膿液樣本,并與MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,評(píng)估兩種熒光PCR方法檢測(cè)膿液樣本對(duì)肺外結(jié)核的診斷效能。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

采用回顧性研究方法,收集2021年1月至2023年2月期間杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院收治的疑似肺外結(jié)核并在病灶部位獲取膿液樣本的患者530例。排除142例(重復(fù)42例、檢測(cè)結(jié)果不全95例和復(fù)治患者5例),最終共納入388例患者。本研究經(jīng)杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2022-118),所有研究對(duì)象均知情同意。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)初治結(jié)核病患者(尚未開始結(jié)核病治療的患者,或正在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案用藥而未滿療程的患者,或不規(guī)則化療未滿1個(gè)月的患者)[5];(2)同時(shí)進(jìn)行Xpert、TB-DNA和MGIT 960培養(yǎng)檢測(cè)。

2.排除標(biāo)準(zhǔn):(1)重復(fù)病例;(2)診斷不明的病例。

三、研究方法

1.儀器及試劑:GeneXpert MTB/RIF實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀及配套試劑(美國(guó)賽沛公司);結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(成都博奧晶芯生物有限公司);BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)及試劑(美國(guó)BD公司)。

2.標(biāo)本采集和處理:在超聲引導(dǎo)下確定最佳穿刺部位,利用注射器及細(xì)針頭對(duì)病灶部位進(jìn)行抽吸獲得膿液標(biāo)本,或者手術(shù)獲得膿液標(biāo)本,同時(shí)進(jìn)行Xpert、TB-DNA和MGIT 960培養(yǎng)。

3.Xpert:采用美國(guó)賽沛公司生產(chǎn)的Xpert檢測(cè)系統(tǒng)及相應(yīng)試劑盒進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。按試劑說明書操作,在1～2 ml膿液中加入2倍體積的處理液,渦旋振蕩15～30 s并室溫放置10 min,然后再次將混合物渦旋振蕩10 s,室溫下孵育5 min,最后將2 ml處理后的樣本加入Xpert 反應(yīng)盒中。2 h后系統(tǒng)可自動(dòng)判讀MTB檢測(cè)結(jié)果與利福平耐藥情況,MTB報(bào)告“檢出”和“未檢出”,MTB檢出的病例根據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)將細(xì)菌載量分為“高”“中”“低”或“極低”,利福平耐藥報(bào)告為“檢出”“未檢出”和“不確定”。

4.TB-DNA:采用成都博奧晶芯生物有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒,按試劑說明書進(jìn)行操作,將膿液樣本進(jìn)行4%NaOH溶液均質(zhì)化處理,轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的離心管中,離心收集沉淀,緩沖液洗滌1次,最后加入試劑盒中的DNA提取液,在渦旋振蕩器上以最大速率振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,12 000×g離心1 min,取上清待用,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)MTB特異性多拷貝重復(fù)插入序列IS6110和分枝桿菌屬共有基因—hsp65基因,擴(kuò)增曲線呈S型且Ct值<40判定為陽性,擴(kuò)增曲線不呈S型或Ct值≥40(或無任何數(shù)值)則為陰性。hsp65陽性IS6110基因陽性為MTB陽性,hsp65陽性IS6110基因陰性為NTM陽性。

5.MGIT 960培養(yǎng): 嚴(yán)格按照儀器操作說明進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng),液體培養(yǎng)使用BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀,培養(yǎng)42 d內(nèi)儀器檢測(cè)信號(hào)達(dá)到陽性的培養(yǎng)物進(jìn)行抗酸染色確認(rèn),抗酸染色陽性則通過TB-DNA鑒別MTB和NTM。鑒別為MTB記為培養(yǎng)陽性,儀器報(bào)陰或鑒別為NTM或抗酸染色陰性均為陰性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用MedCalc Statistical軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用“構(gòu)成比或百分率(%)”描述。分別以臨床診斷和MGIT 960培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn),分析3種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)肺外結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、ROC曲線下面積 (area under the curve,AUC),一致性分析采用Kappa檢驗(yàn),Kappa值在0～0.20為極低一致性、0.21～0.40為一般一致性、0.41～0.60為中等一致性、0.61～0.80為高度一致性、0.81～1.00為幾乎完全一致。

結(jié) 果

一、陽性檢出情況

納入的388例患者中,男性216例,女性172例,中位年齡為52歲;結(jié)核病組328例,非結(jié)核病組60例。其中,結(jié)核病組均為肺外結(jié)核患者,其膿液樣本分別來源于骨關(guān)節(jié)59例(15.21%)、淋巴結(jié)129例(33.25%)、腔體(腹腔、盆腔、胸腔)113例(29.12%)、其他部位(附睪、臀部、背部)27例(7.00%)。非結(jié)核病組分別來源于化膿性脊柱炎35例、胸壁膿腫15例、腰椎膿腫10例。

二、以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)分析3種方法對(duì)結(jié)核病的診斷效能

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),Xpert、TB-DNA和MGIT960培養(yǎng)的敏感度分別為84.15%、84.45%、30.18%;陰性預(yù)測(cè)值分別為53.57%、54.05%、20.76%;3種方法檢測(cè)的特異度和陽性預(yù)測(cè)值均為100.00%(表1)。一致性分析顯示,TB-DNA和Xpert與臨床診斷高度一致(Kappa值分別為0.62和0.63),MGIT 960培養(yǎng)與臨床診斷為極低一致性(Kappa值為0.12)。TB-DNA和Xpert檢測(cè)的AUC值均為0.92,高于MGIT 960培養(yǎng)的AUC(0.65)。見圖1。

表1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)分析3種方法對(duì)結(jié)核病的診斷效能

注 Xpert:GeneXpert MTB/RIF;TB-DNA:結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌PCR熒光探針;培養(yǎng):BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)圖1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn),3種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)核病的ROC曲線

三、 以MGIT 960培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn),各檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病的診斷效能

以MGIT 960培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn),Xpert和TB-DNA檢測(cè)結(jié)核病的敏感度分別為89.90%和92.93%;陰性預(yù)測(cè)值分別為91.07%和93.69%;陽性預(yù)測(cè)值分別為32.25%和33.21%;特異度分別為35.29%和35.99%,具體見表2。TB-DNA檢測(cè)的AUC值為0.65,Xpert檢測(cè)的AUC值為0.63,具體見圖2。

表2 以MGIT 960液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)分析Xpert和TB-DNA對(duì)結(jié)核病的診斷效能

注 Xpert:GeneXpert MTB/RIF;TB-DNA:結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌PCR熒光探針法圖2 以MGIT 960培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)繪制的2種分子檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)核病的ROC曲線

四、Xpert和TB-DNA的一致性分析

在388例患者樣本中,TB-DNA和Xpert同時(shí)檢測(cè)出MTB陽性262例,兩種方法均未檢出97例,TB-DNA陽性Xpert陰性15例,TB-DNA陰性Xpert陽性14例。29例不一致的患者數(shù)據(jù)見表3。

表3 Xpert和TB-DNA檢測(cè)結(jié)果不一致的患者信息

五、Xpert檢測(cè)對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)結(jié)果

328例肺外結(jié)核患者中,Xpert檢測(cè)MTB陽性276例、利福平耐藥12例,利福平耐藥率為4.35%(12/276)。

討 論

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)時(shí),國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道Xpert檢測(cè)膿液樣本的敏感度為83%～94.6%[2, 6],國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)顯示TB-DNA檢測(cè)膿液樣本的敏感度為58.90%～88.23%[7-8]。本研究以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí),Xpert檢測(cè)的敏感度為 84.15%,TB-DNA檢測(cè)的敏感度為84.45%,一致性分析顯示,TB-DNA和Xpert與臨床診斷高度一致(Kappa值分別為0.62和0.63)。然而,一些研究結(jié)果顯示,在痰液或其他非呼吸道標(biāo)本中,Xpert檢測(cè)的敏感度明顯高于TB-DNA[4, 7, 9]。這可能是由于膿液和痰液的成分有所不同,肺外膿液樣本直接從疾病部位取樣,成分相對(duì)單一,主要包含細(xì)菌和壞死白細(xì)胞,蛋白含量較高;而痰液中含有黏液、異物、病原微生物、炎癥細(xì)胞和脫落的黏膜上皮細(xì)胞等多種成分,干擾PCR反應(yīng)的物質(zhì)較多。Xpert提取核酸的過程中進(jìn)行了純化,但TB-DNA沒有純化這一步,純化能夠減少影響PCR反應(yīng)的干擾物質(zhì),因此,痰液樣本對(duì)TB-DNA的影響可能較大。另外,膿液中變性蛋白含量高,菌體外可能包裹有蛋白質(zhì),細(xì)菌破壁較難。TB-DNA 破壁是通過在液化離心后的沉淀物中加玻璃珠裂解,加入玻璃珠會(huì)使破壁更充分[10],而Xpert是無玻璃珠的情況下通過超聲進(jìn)行裂解。是否是以上兩個(gè)因素還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

以MGIT 960液體培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí),Xpert和TB-DNA也具有同等的檢測(cè)效能,但與臨床診斷相比, Xpert和TB-DNA的特異度(35.29%和35.99%)、陽性預(yù)測(cè)值(32.25%和33.21%)都有所降低。雖然MGIT 960培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但由于培養(yǎng)的敏感度低于分子檢測(cè)技術(shù),許多臨床確診患者培養(yǎng)陰性而分子檢測(cè)陽性。因此,當(dāng)以培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí),兩種分子檢測(cè)方法均會(huì)出現(xiàn)假陽性,導(dǎo)致其特異度較低。由于本研究為回顧性分析,Xpert或TB-DNA檢測(cè)出陽性的患者均診斷為結(jié)核病,因此,以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí),Xpert或TB-DNA特異度均為100.00%。

在本研究388例患者樣本中,TB-DNA和Xpert檢測(cè)結(jié)果不一致的有29例,其中TB-DNA單獨(dú)檢出15例,Xpert單獨(dú)檢出14例。Xpert未檢出TB-DNA檢出陽性的15例患者樣本的取材部位有6例來自骨關(guān)節(jié)、4例來自淋巴結(jié)、5例來自腔體,且大部分樣本的檢測(cè)Ct值在33以上,說明樣本中細(xì)菌的載量較低。另一方面, Xpert檢出但TB-DNA陰性的14例樣本中,1例來自背部、3例來自淋巴結(jié)、10例來自腔體,Xpert檢測(cè)結(jié)果的細(xì)菌載量以低和極低為主。TB-DNA檢測(cè)的是多拷貝的IS6110基因,而Xpert檢測(cè)的是單拷貝的rpoB基因,理論上TB-DNA最低檢出限要低于Xpert,但14例Xpert檢出的樣本而TB-DNA未檢出。這14例樣本中,大部分來自于腔體,可能原因是腔體中成分復(fù)雜(如血紅蛋白等干擾物質(zhì));TB-DNA無對(duì)樣本DNA提純的步驟,干擾物質(zhì)影響了PCR反應(yīng)導(dǎo)致假陰性;另外,也有可能是膿液樣本細(xì)菌分布不均勻造成實(shí)驗(yàn)取材差異引起。值得注意的是,所有來自骨關(guān)節(jié)膿液的樣本中,未發(fā)現(xiàn)Xpert檢出陽性而TB-DNA未檢出的樣本,可能是由于骨關(guān)節(jié)病變部位的少桿菌性質(zhì)引起[11],表明在骨關(guān)節(jié)膿液樣本中,TB-DNA的檢出率可能優(yōu)于Xpert,但需要進(jìn)一步的分析和研究。

目前,Xpert檢測(cè)成本較高[12],而TB-DNA為國(guó)產(chǎn)試劑,成本較低?？紤]到成本效益,對(duì)初治肺外膿液樣本可優(yōu)先選擇TB-DNA進(jìn)行初篩。本研究結(jié)果顯示,初治患者膿液樣本Xpert的利福平耐藥檢出率為4.35%,由于TB-DNA不能檢測(cè)利福平耐藥,因此,TB-DNA初篩陽性樣本如需獲得利福平耐藥信息可以使用Xpert、靶向測(cè)序和熔解曲線等方法進(jìn)行檢測(cè)。

本研究局限性在于非結(jié)核組患者例數(shù)相對(duì)較少,由于杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院為浙江省結(jié)核病診療中心,肺外結(jié)核患者較多,無偏差的連續(xù)納入所有符合條件的病例,可導(dǎo)致兩組樣本數(shù)量的比值相對(duì)較大。

綜上所述, 對(duì)于初治肺外結(jié)核患者,患者獲得膿液樣本后可以先使用TB-DNA進(jìn)行初篩,初篩陽性樣本再通過其他檢測(cè)方法獲得耐藥信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)邵燕琴:文章撰寫和修改;朱明智、戴玲珊、梅賓和方婷婷:文獻(xiàn)查找;彭利君和蔡龍:文章修改和審閱