超聲法與閃式提取法提取刺五加中綠原酸的工藝對(duì)比研究

■ 關(guān) 皎 丁思宇 胡子君 季玲玲 王軍民 朱鶴云 韓麗琴*

（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林吉林 132013）

刺五加又稱五加參、一百針，主要用藥部位為干燥根、莖及根莖[1-2]。我國(guó)東北和華北以北地區(qū)具有適宜刺五加植物的生長(zhǎng)環(huán)境，是刺五加藥材的主要產(chǎn)地，其中黑龍江、吉林、遼寧三省地區(qū)的刺五加藥材產(chǎn)量較高[3]。刺五加性溫、味苦、微甜，益氣健脾，補(bǔ)腎安神[4-6]，在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用刺五加及其提取物可以提高生長(zhǎng)性能，促進(jìn)腸道健康，改善屠宰性能和肉品質(zhì)[7-8]。

刺五加中含有多種化學(xué)成分，主要活性成分為苷類(lèi)化合物，但也有研究表明，刺五加中苯丙素類(lèi)化合物，特別是綠原酸的含量較高[9-11]。綠原酸是由奎尼酸的羥基和咖啡因的羧基縮合而成的縮酚酸，是植物細(xì)胞通過(guò)莽草酸途徑合成的一種苯丙素類(lèi)物質(zhì)，其含有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚等分子結(jié)構(gòu)，具有抗菌[12]、抗氧化[13]、抗疲勞[14]、降血壓[15]、抗血糖和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[16-17]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域[18]。

綠原酸的提取分離方法有水提醇沉法、乙醇回流法、超聲法、閃式提取法等[19-21]，超聲法為提取藥材中有效成分的常用方法；閃式提取法是中藥提取領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，該方法能充分保留植物的有效成分，受熱影響小，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)較短，效率高。本研究將超聲法和閃式提取法應(yīng)用于刺五加中綠原酸的提取工藝研究，對(duì)比分析兩種方法提取綠原酸的效果，優(yōu)化并選擇刺五加中綠原酸的最佳提取工藝，為刺五加藥材的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；微型萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW80，永康市久品工貿(mào)有限公司）；閃式提取器（JHBE-50S，河南金鼐科技發(fā)展有限公司）；三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（KQ-500GVDV，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

刺五加藥材為道地藥材（產(chǎn)地：遼寧；鑒定人：吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授），綠原酸對(duì)照品（純度＞99.40%；批號(hào)：MUST-220700918；購(gòu)自成都曼斯特科技有限公司）的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。無(wú)水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；甲醇（美國(guó)Fisher 公司，色譜純）；乙腈（美國(guó)Fisher 公司，色譜純）；磷酸（沈陽(yáng)市華東試劑廠，分析純）。

圖1 綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 試驗(yàn)方法

2.1 綠原酸含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件

色譜條件見(jiàn)表1。

表1 色譜條件

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，甲醇溶解，配制1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末1.0 g，加入具塞錐形瓶（容積50 mL）中，加入30 mL 體積比為 50%的乙醇溶液，稱重，超聲提取45 min（功率200 W），冷卻至室溫，加入體積比為50%的乙醇溶液補(bǔ)足損失量，過(guò)濾。取10 mL續(xù)濾液，加于蒸發(fā)皿上，水浴蒸干，流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過(guò)濾，備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制20、40、100、200、500、1 000 μg/mL系列甲醇溶液，橫坐標(biāo)（X）為濃度，縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取200 μg/mL 刺五加對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取刺五加樣品溶液，放置0、2、4、6、8、12、24 h 后進(jìn)樣分析。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次刺五加藥材，制備樣品溶液6 份，計(jì)算峰面積的RSD。

2.1.8 回收率試驗(yàn)取刺五加藥材適量（已知綠原酸含量），分別加入對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率和峰面積的RSD。

2.2 超聲法和閃式提取法的單因素考察

采用不同的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察分析各因素的不同水平對(duì)綠原酸提取率的影響，因素見(jiàn)表2。

表2 主要提取方法、考察的因素及水平、固定因素

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選刺五加中的綠原酸的超聲提取、閃式提取工藝

2.3.1 超聲提取試驗(yàn)方案

選擇4 個(gè)考察因素（A：乙醇體積分?jǐn)?shù)；B：超聲時(shí)間；C：料液比；D：超聲功率），每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平，開(kāi)展正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表3。

表3 超聲法正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2 閃式提取試驗(yàn)方案

選擇3個(gè)考察因素（E：乙醇體積分?jǐn)?shù)；F：料液比；G：閃提時(shí)間），開(kāi)展正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表4。

表4 閃式提取法因素水平

2.4 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液平行測(cè)定3 次，計(jì)算供試品中綠原酸的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 綠原酸含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

綠原酸對(duì)照品與刺五加樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 綠原酸對(duì)照品（A）和刺五加樣品（B）的高效液相色譜圖

綠原酸的線性回歸方程為Y=3.308×104X+3.582×105（r=0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸在20～1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示峰面積的RSD=1.7%，表明HPLC 精密度符合要求。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示不同時(shí)刻測(cè)定的峰面積的RSD 值為1.5%，即樣品在24 h 穩(wěn)定性良好，符合要求。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果峰面積的RSD=2.2%，即方法的重復(fù)性良好，符合要求。平均回收率為98.7%（RSD=1.1%），即方法回收率較好，符合要求。

3.2 超聲法和閃式提取法的單因素考察結(jié)果與分析

3.2.1 超聲法單因素考察結(jié)果

由圖3 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加綠原酸的提取率增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30% 時(shí)提取率最高，超聲時(shí)間增加綠原酸的提取率升高，60 min 后趨于穩(wěn)定，故1 h為最佳超聲時(shí)間。綠原酸的提取率隨溶劑體積的增加而減小，當(dāng)料液比為1∶5（g/mL）時(shí)綠原酸的提取率達(dá)到最大值，超聲功率提高，綠原酸的提取率增大。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇30%乙醇、料液比為1∶5，250 W功率，提取60 min。

3.2.2 閃式提取法的單因素考察結(jié)果

閃式提取綠原酸單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。乙醇體積分?jǐn)?shù)增加綠原酸的提取率增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)提取率最高，故選擇70%乙醇為最佳提取溶劑濃度。提取時(shí)間增長(zhǎng)，綠原酸的提取率反而降低。當(dāng)提取時(shí)間為1 min時(shí)綠原酸的提取率達(dá)到最大值，因此，適宜的提取時(shí)間為1 min。綠原酸的提取率隨溶劑體積的增大而減小，當(dāng)料液為1∶30（g/mL）時(shí)綠原酸的提取率達(dá)到最大值，因此，提取的適宜料液比為1∶30（g/mL）。

圖4 閃式提取法的單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選刺五加中的綠原酸的提取工藝 結(jié)果

3.3.1 超聲法的正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果

由表5、表6 結(jié)果可知，超聲法中各因素不會(huì)顯著影響提取工藝，各因素對(duì)綠原酸提取率的影響順序?yàn)镃＞A＞D＞B。篩選得到的超聲法最佳工藝為A3B2C1D3，即50%乙醇，提取1 h，料液比1∶5（g/mL），功率250 W，與正式試驗(yàn)方案8一致，無(wú)須驗(yàn)證。

表5 超聲法正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 超聲法方差分析結(jié)果

3.3.2 閃式提取法正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果

由表7、表8 結(jié)果可知，各因素對(duì)提取效率沒(méi)有顯著影響，因素影響順序?yàn)镚＞E＞F。從而確定超聲法最佳工藝為E2F1G1，即70%乙醇，料液比1∶30（g/mL），提取1 min。供試品驗(yàn)證得綠原酸平均提取率為1.008 mg/g，高于正交試驗(yàn)的最高提取率0.964 mg/g。

表7 閃式提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 閃式提取法方差分析結(jié)果

3.4 超聲法與閃式提取法比較

由表9 可知超聲法與閃式提取法提取綠原酸的最佳工藝對(duì)比。超聲法提取綠原酸的提取率是閃式提取法的5倍，更適合于刺五加中綠原酸的提取。

表9 不同方法提取綠原酸的提取率

4 討論

超聲提取法主要原理為超聲波振動(dòng)產(chǎn)生空化、粉碎等作用，破壞植物細(xì)胞壁，能夠加速中草藥多糖成分溶于溶劑中[22]，廣泛應(yīng)用于黃酮、有機(jī)酸、多糖等成分的提取。閃式提取法最早應(yīng)用是為實(shí)現(xiàn)生物組織的破碎，它通過(guò)高效機(jī)械剪切力和超快速分子滲濾技術(shù)，在室溫條件下將組織物料破碎至細(xì)微顆粒，使有效成分與溶劑接觸，達(dá)到提取的目的，具有效率高、能耗低等顯著特點(diǎn)[23-24]。與傳統(tǒng)的提取方式相比，超聲和閃式提取均具有提取時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)，在提取刺五加藥材的綠原酸過(guò)程中，從提取效率因素看，超聲法明顯高于閃式提取法，但如果考慮時(shí)間和能耗，則可選擇閃式提取。

5 結(jié)論

采用超聲法和閃式提取法提取刺五加中綠原酸均獲得較好效果，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可知，優(yōu)化后的閃式提取法最佳工藝：70%乙醇，1∶30料液比，提取1 min，獲得1.008 mg/g 的提取率。優(yōu)化后超聲法最佳工藝則為50%乙醇，提取時(shí)間60 min，料液比1∶5，功率250 W，獲得5.639 mg/g 的提取率，明顯高于閃式提取法。