光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合制備甲醇的可行性研究

董文錦,鄧 理,宋曉明,陳夫山*

(1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,山東 青島 266042;2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所,中國 蘭州 730000)

甲醇用作氫 (H2) 能量載體的研究引起了廣泛關(guān)注,同時(shí)甲醇作為生產(chǎn)其他有價(jià)值化合物的基礎(chǔ)原材料具有廣泛的用途[1-2]。在2021年中國十大科技進(jìn)展中,CO2到淀粉的合成上榜:馬延和團(tuán)隊(duì)[3]首次報(bào)道了在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中由CO2到淀粉的從頭合成,其中,由大連化學(xué)物理研究所負(fù)責(zé)利用化學(xué)催化劑光電催化CO2加氫生成C1中間體——甲醇,然后由天津工業(yè)生物所建立基于甲醇的10個(gè)酶促反應(yīng),成功將甲醇生物轉(zhuǎn)化為直鏈和支鏈淀粉。然而,傳統(tǒng)的二氧化碳加氫生產(chǎn)甲醇需要高溫高壓的高能耗條件,成本較高。因此,開發(fā)在溫和條件下生產(chǎn)甲醇的體系是亟需解決的難題,其中將CO2酶催化還原制備甲醇的多酶級聯(lián)反應(yīng)是一種很有前景的策略[4]。

在CO2多酶級聯(lián)反應(yīng)制備甲醇的過程中,首先是由甲酸脫氫酶 (FDH) 將CO2或碳酸氫根還原為甲酸,然后通過甲醛脫氫酶 (Fald DH) 將甲酸還原為甲醛,最后經(jīng)醇脫氫酶 (ADH) 將甲醛還原為甲醇。其中,每一步由酶參與的反應(yīng)都需要消耗化學(xué)計(jì)量的煙酰胺輔酶NAD(P)H 才能實(shí)現(xiàn)催化轉(zhuǎn)化,因此,受到了NAD(P)H 高成本和再生效率低的限制,使得將CO2多酶催化轉(zhuǎn)化為甲醇的效率比較低,成本卻非常高[5]。另一方面,甲醛脫氫酶是一種限速酶,它催化逆反應(yīng)(甲醛氧化制備甲酸)的效率比催化正反應(yīng)(甲酸還原制備甲醛)效率高得多,在多酶級聯(lián)反應(yīng)過程中的催化活性非常低[6]。因此,為了提高CO2多酶級聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化中的催化效率,輔酶的原位再生和活性更高的甲醛脫氫酶研究是其中的關(guān)鍵[7]。

在之前的研究中,本課題組借鑒傳統(tǒng)氫轉(zhuǎn)移催化反應(yīng),構(gòu)建了新的光催化輔酶再生體系:以甲酸鹽作為電子給體,釕絡(luò)合物Ru(tpy)(biq)Cl2作為光催化劑,成功實(shí)現(xiàn)了輔酶NADH 的高效再生,量子產(chǎn)率達(dá)7.9×10-3,將這種光催化劑與谷氨酸脫氫酶耦合,實(shí)現(xiàn)了模型反應(yīng)α-酮戊二酸到L-谷氨酸的光控高效轉(zhuǎn)化[8]。

本研究在光催化輔酶再生的基礎(chǔ)上,將甲醛脫氫酶引入再生體系,希望能夠解決甲酸還原這一具有挑戰(zhàn)的反應(yīng),從而以甲酸歧化的方式實(shí)現(xiàn)高價(jià)碳(+2價(jià))向低價(jià)碳(-2價(jià))的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而建立C1分子轉(zhuǎn)化的高效催化體系,為二氧化碳利用提供有力工具,也為有挑戰(zhàn)的羧基還原反應(yīng)提供了新思路。不過需要指出的是,將光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合,未能檢出甲醛或甲醇產(chǎn)物。本研究對成功表達(dá)并分離純化得到的甲醛脫氫酶進(jìn)行了一系列的酶活反應(yīng)實(shí)驗(yàn),依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了深入的探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與酶

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株、質(zhì)粒與酶見表1。

表1 菌株、質(zhì)粒與酶Table 1 Strains,plasmids andenzymes

1.1.2 試劑與儀器

Trans 2K Plus 2 DNA Marker,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;PageRuler Unstained Protein Ladder(10～250 k Da),賽默飛世爾科技公司;質(zhì)粒提取試劑盒Mini Plasmid Kit,美國奧美嘉生物技術(shù)公司;Ta KaRa BCA Protein Assay Kit,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;蛋白胨,英國Oxoid 公司;酵母粉,英國 Oxoid 公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),北京索萊寶科技有限公司;卡那霉素,上海生工生物工程股份有限公司;NADH/NAD+,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;PBS磷酸鹽緩沖液干粉,北京索萊寶科技有限公司。

蒸汽滅菌器,LDZM-80KCS 型,上海申安醫(yī)療器械廠;單人單面凈化工作臺,SW-CJ-1FD 型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;雙層恒溫?fù)u床,ZHWY-1102C型,上海智城分析儀器制造有限公司;隔水式培養(yǎng)箱,GSP-9080MBE 型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;臺式冷凍離心機(jī),Allegra X-22 型,美 國Beckman公司;高壓破碎儀,40KPSI型,廣州艾貝太制藥公司;電熱恒溫水槽,DK-8D 型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Spark 多功能酶標(biāo)儀,瑞士Tecan 公司;氣相色譜儀,Agilent8890型,安捷倫科技有限公司;蛋白純化儀,Bio-Rad NGCTM Chromatography System 型,美國伯樂(Bio-Rad)公司;渦旋振蕩器,Vortex Genie 2型,美國Scientific Industries公司;臺式離心機(jī),1-14型,德國Sigma公司;水相聚醚砜針式濾器,SCAA-102 型,上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 溶液及培養(yǎng)基

1)卡那霉素 (Kan,0.05 g·mL-1):稱取2 g卡那霉素加入50 mL無菌大離心管中,在超凈臺加入40 mL dd H2O,混勻,用濾膜過濾2次,分裝,標(biāo)記Kan-日期,-20℃保存,備用。添加到培養(yǎng)基的終濃度一般為50μg·mL-1。

2)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG,w/V,20%):稱取8 g IPTG 于50 mL 無菌大離心管中,在超凈臺加入40 mL 純水,混勻,鑷子取出幾個(gè)2 mL離心管,用水相濾膜將IPTG 溶液濾入,標(biāo)記IPTG-日期,-20℃保存,備用。

3)LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g·L-1,氯化鈉10 g·L-1,酵母粉5 g·L-1,水,121℃高溫滅菌20 min。

4)LB 固體培養(yǎng)基:LB 液體培養(yǎng)基,瓊脂粉20 g·L-1,121℃滅菌20 min。

5)酶的分離純化緩沖液體系。Bingding Buffer:50 mmol·L-1NaH2PO4,300 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1咪唑,pH=7.0;Washing Buffer:50 mmol·L-1NaH2PO4,300 mmol·L-1NaCl,50 mmol·L-1咪唑,pH=7.0;Elution Buffer:50 mmol·L-1NaH2PO4,300 mmol·L-1NaCl,500 mmol·L-1咪唑,pH=7.0。將溶液過濾膜,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 酶的表達(dá)、分離純化

1.2.1 酶的表達(dá)

1)重提質(zhì)粒:取出培養(yǎng)好的菌液按質(zhì)粒提取試劑盒步驟提取質(zhì)粒,使用超微量分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度分別為120 ng·μL-1(fdh A),106.54 ng·μL-1(fdh A-PA5421),酶切驗(yàn)證后使用。

2)轉(zhuǎn)化:將重組質(zhì)粒用熱擊法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組菌株;

3)表達(dá):使用0.5 mmol·L-1IPTG,16℃誘導(dǎo)20 h;

4)收菌:收集菌體沉淀,Binding Buffer懸浮3次,棄上清,保留菌體沉淀。

1.2.2 酶的分離純化

將菌體懸浮在Binding Buffer中,用高壓細(xì)胞破碎儀破碎收集上清,然后用純化蛋白儀進(jìn)行蛋白純化。純化后的蛋白液用SDS-PAGE、考馬斯藍(lán)R-250染色,以確定該蛋白的純化程度。蛋白液用10 KDa的超濾管濃縮,保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶濃度的測定

利用Ta KaRa BCA Protein Assay Kit進(jìn)行酶濃度的測定,其中,使用牛血清白蛋白 (BSA) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶濃度。蛋白的特征吸收波長為λ=562 nm,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.098 12x+0.112 4,R2=0.997,根據(jù)甲醛脫氫酶在562 nm 處的吸光由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出甲醛脫氫酶的濃度分別為:Fald DH-fdh A,3.52 mg·mL-1;Fald DH-PA5421,0.35 mg·mL-1。需要注意的是,不同批次表達(dá)純化的酶需要標(biāo)定不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用酶標(biāo)儀在特定波長下測定化合物的吸光度Aλ,計(jì)算溶液中該化合物的濃度。其中,NADH 的特征吸收波長為λ=340 nm,由A340對NADH 濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.003 42x+0.015 77,R2=0.998,濃度區(qū)間為0～400μmol·L-1。

甲醛的測定方法為顯色法,具體過程:體積比為1∶1的甲醛溶液與Nash試劑,40℃孵育1 h后取200μL,用酶標(biāo)儀測定溶液在412 nm 處的吸光度(A412),由A412對甲醛濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.003 79x+0.064 44,R2=0.998,濃度區(qū)間為10～100μmol·L-1。

甲醇用氣相色譜儀定量,出峰時(shí)間為2.89 min,由峰面積對甲醇濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=207.661 88x+20.866 55,R2=0.998,濃度區(qū)間為0.1～20 mmol·L-1。(儀器:安捷倫8890,氫火焰檢測器FID,色譜柱:HP-PLOT Q)。

1.4 光催化輔酶再生體系與酶催化反應(yīng)的耦合

1.4.1 與谷氨酸脫氫酶耦合

為驗(yàn)證構(gòu)建的NADH 再生體系可以與酶催化反應(yīng)相容,選擇相對成熟的谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸合成L-谷氨酸的反應(yīng)與構(gòu)建的NADH 再生體系進(jìn)行耦合。反應(yīng)條件:將含有1 mmol·L-1NAD+、50μmol·L-1光催化劑Ru(tpy)(biq)Cl2、2 U 谷氨酸脫氫酶 (GDH)、0.5 mol·L-1HCOONa、0.05 mol·L-1(NH4)2SO4和10 mmol·L-1α-酮戊二酸的4 mL 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH=7.4) 溶液,添加到配有橡膠塞采樣注射器和磁子的Schelenk管中,然后用氬氣吹掃管,將其置于綠色光源 (100 W,525 nm) 前照射。通過風(fēng)扇降溫讓反應(yīng)溫度低于40℃。照射1.5 h 后,再加入10 mmol·L-1α-酮戊二酸,再照射1 h。期間進(jìn)行黑暗/光照交替實(shí)驗(yàn)。

照射一定時(shí)間后,對反應(yīng)混合物進(jìn)行采樣,并按照以下步驟測定L-谷氨酸:向每個(gè)稀釋的樣品(200μL) 中各加入100μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的異硫氰酸苯酯的乙腈溶液和100μL 1 mol·L-1的三乙胺的乙腈溶液。將混合物在室溫下孵育1 h,然后用600μL正己烷萃取未反應(yīng)的異硫氰酸苯酯。收集底層的200μL乙腈溶液,加入800μL 水中,過濾膜進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。在配有C18色譜柱和UV-Vis檢測器的島津Prominence 20高效液相色譜儀上對衍生的L-谷氨酸樣品進(jìn)行分析,用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量:y=2 562.32x+8 299.82,R2=0.999 97。

1.4.2 與甲醛脫氫酶耦合

1)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-fdh A) 耦合。

用自制核磁管適配器,在氬氣條件下,將含有0.1 mg· mL-1FaldDH-fdh A、2 mmol· L-1NAD+、50μmol·L-1Ru(tpy)(biq)Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa、100 mmol·L-1PBS的0.5 mL重水溶液加入核磁管中,密封,測核磁氫譜,記為0 h,然后將核磁管放置在綠色光源 (50 W,525 nm) 前照射,用風(fēng)扇冷卻將反應(yīng)溫度保持在低于40℃。通過核磁氫譜的特征峰變化來驗(yàn)證是否有NADH 生成,反應(yīng)結(jié)束后用Nash試劑顯色法檢測甲醛。

2)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-PA5421) 耦合。

用自制核磁管適配器,在氬氣條件下,將含有0.1 mg·mL-1Fald DH-PA5421、2 mmol·L-1NAD+、50μmol·L-1Ru(tpy)(biq)Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa、100 mmol·L-1PBS的0.5 mL重水溶液加入核磁管中,密封,然后將核磁管放置在綠色光源 (50 W,525 nm) 前照射,用風(fēng)扇冷卻將反應(yīng)溫度保持在低于40℃。通過核磁氫譜的特征峰變化來驗(yàn)證是否有NADH 生成,反應(yīng)結(jié)束后用Nash試劑顯色法檢測甲醛。

3)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-sale) 耦合。

Schelenk管中,加入含有2 U·mL-1FaldDHsale、2 mmol·L-1NAD+、50μmol·L-1Ru·(tpy)(biq)Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa、100 mmol·L-1PBS的2 mL重水溶液,密封,然后將核磁管放置在綠色光源(50 W,525 nm)前照射,反應(yīng)0、3、6、17 h后,各取115μL 溶液加入115μL Nash試劑,37℃孵育1 h,取200μL 溶液檢測在412 nm 處的吸光度驗(yàn)證是否有甲醛生成。

4)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-sale)、乙醇脫氫酶(ADH) 耦合。

Schelenk管中,加入含有2 U·mL-1FaldDHsale、30 U·mL-1ADH、2 mmol·L-1NAD+、50 μmol·L-1Ru(tpy)(biq)Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa、100 mmol·L-1PBS 的2 mL重水溶液,密封,然后將核磁管放置在綠色光源 (50 W,525 nm) 前照射,反應(yīng)結(jié)束后用乙腈萃取,用氣相檢測甲醇。

5)選取其它成熟的光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合。

25μmol·L-1Eosin Y(光催化劑),0.1 mmol·L-1M([RhCp*(bpy)H]+,電子介體),5 mmol·L-1HCOONa,5 mmol·L-1NADH,1 U·mL-1Fald DH-sale,100 mmol·L-1TEOA(電子給體),0.5 mL PBS(pH=7.4),綠色光源(525 nm,50 W)照射。反應(yīng)0、3、6、17 h后,各取115μL加入115μL Nash 試劑,40℃孵育1 h,檢測溶液在412 nm 處的吸光度。

1.5 甲醛脫氫酶催化甲酸還原

1.5.1 酶活反應(yīng)

反應(yīng)條件:32℃下,3種甲醛脫氫酶 (Fald DH,1μmol·L-1),NADH 或NAD+(0.2 mmol·L-1)和甲酸鈉或甲醛 (5 mmol·L-1) 在磷酸鹽緩沖液 (100 mmol·L-1;pH=7.4) 中,通過酶標(biāo)儀檢測NADH 在340 nm 處吸光度的變化來確定酶活性。

1.5.2 酶FaldDH-fdh A 的反應(yīng)驗(yàn)證

1)Fald DH 在不同pH 緩沖液下的催化反應(yīng)。反應(yīng)條件:32℃下,將Fald DH-fdh A、0.2 mmol·L-1NADH 和5 mmol·L-1HCOONa加入不同pH 的PBS緩沖液 (100 mmol·L-1) 中,進(jìn)行酶活測試。

2)無氧條件下酶活測試。反應(yīng)條件:32℃下,在Schelenk 管中,Ar 氛圍下,Fald DH-fdh A、0.5 mmol·L-1NADH 和5 mmol·L-1HCOONa在PBS緩沖液 (100 mmol·L-1;pH 7.4) 中,進(jìn)行酶活測試。對照組不加HCOONa。

1.5.3 酶Fald DH-sale催化的平衡反應(yīng)

1號實(shí)驗(yàn)組:將含有2 U·mL-1Fald DH-sale、1 mmol·L-1NADH、0.1 mmol·L-1NAD+、5 mmol· L-1HCOONa 和0.5 mmol· L-1HCHO 的PBS(100 mmol·L-1;pH 7.4) 緩沖液,在32℃搖床中進(jìn)行反應(yīng)。2號對照組:不含酶,將含有1 mmol·L-1NADH、0.1 mmol·L-1NAD+、5 mmol·L-1HCOONa 和0.5 mmol·L-1HCHO 的PBS(100 mmol·L-1;pH 7.4) 緩沖液,在32℃搖床中進(jìn)行反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的表達(dá)、分離與純化

圖1分別是兩種酶表達(dá)的SDS-PAGE 圖。結(jié)果表明:通過全蛋白的上清、沉淀泳道,可以看出蛋白表達(dá)量較好,并且蛋白可溶,純化后 (Lane 3/Lane 6～8) 目的蛋白雜蛋白較少,說明純化效果較好。

圖1 甲醛脫氫酶的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of Fald DH

2.2 光催化輔酶再生體系與酶催化反應(yīng)的耦合

2.2.1 谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸合成L-谷氨酸

谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸合成L-谷氨酸的反應(yīng)與構(gòu)建的NADH 再生體系進(jìn)行耦合結(jié)果見圖2。從圖可以看出,L-谷氨酸的合成是光控的,在黑暗條件下生成幾乎可以忽略的L-谷氨酸,在0.5 h照射后,得到約4.03 mmol·L-1L-谷氨酸,TOF值為161 h-1,在照射1.5 h后,加入的10 mmol·L-1α-酮戊二酸被完全轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸。隨后再加入10 mmol·L-1α-酮戊二酸,在1 h內(nèi)完成完全轉(zhuǎn)化。基于光催化劑和NAD+的TON 分別為380和19。結(jié)果表明在谷氨酸脫氫酶 (GDH) 的存在下,光催化劑沒有發(fā)生明顯的失活,進(jìn)一步表明構(gòu)建的NADH 再生體系與酶催化反應(yīng)的相容性。

圖2 L-谷氨酸的合成Fig.2 The synthesis of L-glutamate

2.2.2 光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶的耦合

1)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-fdh A) 耦合。

光催化NADH 再生體系與FaldDH-fdh A 耦合反應(yīng)4.5 h后核磁氫譜見圖3。從圖3可以看出,1號與3號(有甲醛脫氫酶存在或沒有甲醛脫氫酶時(shí))均未有NADH 生成,2號光催化NADH 再生體系中NAD+基本完全轉(zhuǎn)化為NADH。另外,未檢測到甲醛生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,光催化NADH 再生體系可行,與酶Fald DH-fdh A 耦合后未生成NADH或生成的NADH 被消耗。

圖3 光催化NADH 再生體系與FaldDH-fdh A耦合的核磁氫譜Fig.3 1H NMR spectrum of NADH regeneration coupling system with FaldDH-fdh A

2)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-PA5421) 耦合。

光催化NADH 再生體系與Fald DH-PA5421耦合7 h 后核磁氫譜見圖4,圖4(a)為①號樣品(HCOONa,NAD+,Ru(tpy)(biq)Cl2,FaldDHPA5421),圖4(b)為②號樣品 (HCOONa,NAD+,Ru(tpy)(biq)Cl2)。從圖中可以看出,①號樣品反應(yīng)后有NADH 生成,但是未檢測到甲醛;②號樣品在2 h后NAD+基本完全轉(zhuǎn)化為NADH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:光催化NADH 再生體系效率高,但與酶Fald DH-PA5421耦合后未檢測到甲醛。

圖4 光催化NADH 再生體系與FaldDH-PA5421耦合的核磁氫譜Fig.4 1H NMR spectra of NADH regeneration system coupling with FaldDH-PA5421

3)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-sale) 耦合。

1 U·mL-1Fald DH-sale、2 mmol· L-1NAD+、50μmol·L-1Ru(tpy)(biq)Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa在100 mmol·L-1PBS中反應(yīng)0、3、6、17 h后取樣,均未檢測到甲醛。

4)與甲醛脫氫酶 (Fald DH-sale)、乙醇脫氫酶(ADH) 耦合。

2 U·mL-1Fald DH-sale、30 U·mL-1ADH、2 mmol·L-1NAD+、50μmol·L-1Ru(tpy)(biq)·Cl2、0.5 mol·L-1HCOONa 在100 mmol·L-1PBS中反應(yīng)后,未檢測到甲醇?？赡茉?①在反應(yīng)過程中沒有甲醛生成,因此未生成甲醇;②反應(yīng)過程中生成甲醛的速率過慢且生成的甲醛量較少,導(dǎo)致生成的甲醇濃度低于檢測限。

5)其它成熟的光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合。

25μmol·L-1Eosin Y、0.1 mmol·L-1M、5 mmol·L-1HCOONa、5 mmol·L-1NADH、1 U·mL-1FaldDH-sale、100 mmol·L-1TEOA在PBS中反應(yīng)0、3、6、17 h后,均未檢測到甲醛。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合后,未檢測到甲醛的生成,但是單獨(dú)的光催化NADH 再生體系是能夠生成NADH的,且谷氨酸脫氫酶與NADH 再生體系耦合成功催化α-酮戊二酸合成L-谷氨酸的實(shí)驗(yàn)證明了構(gòu)建的NADH 再生體系與模型酶催化反應(yīng)的相容。另外,由ADH 催化甲醛制備甲醇的反應(yīng)是可行且迅速的。因此,選擇對甲醛脫氫酶催化的甲酸還原制備甲醛進(jìn)行酶活反應(yīng)測試,探索實(shí)驗(yàn)影響因素。

2.3 甲醛脫氫酶在甲酸還原反應(yīng)中的測試

2.3.1 酶活反應(yīng)

3種甲醛脫氫酶催化甲酸鹽還原或甲醛氧化的反應(yīng)結(jié)果如圖5所示,其中,圖5(a)、(b)、(c)、(d)為多批次的酶FaldDH-fdh A,圖5(e)為酶FaldDHPA5421,圖5(f)為酶Fald DH-sale。

圖5 Fald DH 催化的甲酸鹽還原反應(yīng)Fig.5 Reduction of formate catalyzed by F ald DH

從圖中可以看出,3種酶均可以催化甲醛制備甲酸的逆向反應(yīng),NADH 的A340很快達(dá)到飽和,說明反應(yīng)速率很快;而當(dāng)催化甲酸制備甲醛的正向反應(yīng)時(shí),3種酶具有不同的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象:對于酶Fald DHfdh A (圖5(a)～(d)),在 沒有底物HCOONa 時(shí)A340也是下降的,且與存在HCOONa時(shí)下降趨勢一致,即無HCOONa時(shí)NADH 也在消耗,但未檢測到甲醛生成。對于酶Fald DH-PA5421(圖5(e))和酶FaldDH-sale (圖5(f)),有HCOONa 和 無HCOONa時(shí),A340都不變,且未檢測到甲醛生成。

2.3.2 不同濃度酶Fald DH-fdh A 與NADH 消耗速率關(guān)系

根據(jù)酶活反應(yīng)測試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,假設(shè)NADH充做反應(yīng)底物,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究甲醛脫氫酶Fald DHfdh A 的濃度與NADH 下降速率的關(guān)系,得到了如圖6所示的關(guān)系曲線。選取第3 min到30 min之間的ΔA,以ΔA對FaldDH-fdh A 濃度作圖,如圖7所示:ΔA 與Fald DH-fdh A 濃度線性相關(guān),也就是說,NADH 的消耗速率與酶FaldDH-fdh A 的濃度成正比。這進(jìn)一步表明,NADH 與酶Fald DH-fdh A進(jìn)行了反應(yīng),NADH 充作了反應(yīng)底物。

圖6 不同濃度FaldDH-fdh A與A340 的關(guān)系曲線Fig.6 Elationship curve between different concentrations of Fald DH-fdh A and A340

圖7 NADH 吸光度A340 的變化與酶FaldDH-fdhA濃度的關(guān)系Fig.7 Relationship between the change of NADH absorbance (A340)and the concentration of FaldDH-fdh A

針對這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可能有兩種原因:1)溶液pH 對反應(yīng)產(chǎn)生影響;2)氧氣與NADH 進(jìn)行反應(yīng)。為了驗(yàn)證以上兩種可能,又進(jìn)行了反應(yīng)驗(yàn)證。分別在不同pH 的PBS緩沖液 (pH=7.0,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0) 或在氬氣保護(hù)條件下對酶Fald-DH-fdh A 進(jìn)行酶活測試,部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。從圖8可以看出,反應(yīng)結(jié)果與先前一致:加入甲酸鈉和不加甲酸鈉時(shí)的A340的變化趨勢相同,即NADH作為反應(yīng)底物與酶反應(yīng),且未檢測到甲醛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在酶Fald DH-fdh A 催化甲酸還原反應(yīng)過程中,酶Fald DH-fdh A 中可能存在某些物質(zhì)會消耗NADH,與HCOONa競爭,使HCOONa不參與反應(yīng)。該機(jī)制還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖8 不同pH 緩沖液下Fald DH-fdhA催化的甲酸還原反應(yīng)Fig.8 Reduction of formate catalyzed by Fald DH-fdh A under different pH PBS buffer

2.3.3 利用酶Fald DH-sale催化的可逆估算反應(yīng)平衡常數(shù)

針對酶Fald DH-sale在2.3.1 中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(催化甲酸制備甲醛時(shí)NADH 的吸光度A340不變),有兩種可能原因:1)酶Fald DH-sale在NADH存在下,不會催化甲酸還原;2)反應(yīng)平衡向正向反應(yīng)的驅(qū)動力不足。因此,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)利用酶Fald DHsale催化的可逆來估算反應(yīng)平衡常數(shù)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組(1號,含酶Fald DH-sale)與對照組(2號,不含酶)在412 nm 處的吸光度,由甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對應(yīng)的甲醛濃度 (cHCHO),得到甲醛濃度隨時(shí)間的變化曲線(見圖9)。從圖9可以看出,在1號實(shí)驗(yàn)組中,甲醛一直在消耗;2號對照組中,甲醛濃度基本不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在初始NADH與NAD+比值為10時(shí),Fald DH-sale一直在催化由甲醛到甲酸的逆向反應(yīng),即Fald DH-sale催化逆反應(yīng)的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于催化正反應(yīng),這與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致。在22 h時(shí)酶FaldDH-sale催化反應(yīng)中甲醛濃度變化趨勢仍未趨緩,即反應(yīng)未達(dá)平衡。考慮到酶的活性及反應(yīng)中NADH 自身降解等因素,未繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間。通過22 h時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算方程式兩邊濃度比例關(guān)系,可知反應(yīng)的平衡常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1×10-4。那么在酶活反應(yīng)中,即使Fald DH 能夠催化甲酸還原制備甲醛,即使FaldDH 能夠催化甲酸還原制備甲醛,5 mmol·L-1HCOONa、0.2 mmol·L-1NADH 最多只能生成0.01 mmol·L-1的甲醛,這低于Nash顯色法的檢測限,因此,之前的實(shí)驗(yàn)未檢測到甲醛。該結(jié)果為將來的工作提供了思路:可以加大HCOONa的濃度使反應(yīng)平衡向右移動,即甲醛脫氫酶催化甲酸還原需要一定的甲酸閾值濃度。

圖9 甲醛濃度隨時(shí)間的變化Fig.9 Formaldehyde concentration as a function of time

2.4 文獻(xiàn)分析與討論

通過多酶級聯(lián)反應(yīng)催化CO2還原制備甲醇已有許多報(bào)道,部分文獻(xiàn)見表2。其中,PARK 等[4]基于BLAST 的序列比較和系統(tǒng)序列分析篩選出來自洋蔥假單胞菌甲醛脫氫酶 (Pc Fald DH),并對其進(jìn)行酶活研究,在NADH 存在下,PcFaldDH 可以將HCOO-還原生成HCHO。IMAE 等[9]在含F(xiàn)DH的薄膜上檢測到446 mg·(L·g)-1甲酸,在含F(xiàn)DH-Fald DH 的薄膜上檢測到218 mg·(L·g)-1甲醛,在含F(xiàn)DH-FaldDH-ADH 的薄膜上檢測到203 mg·(L·g)-1甲醇。LEE 等[7]基于BLAST的序列比較和系統(tǒng)序列分析篩選得到來自多食伯克霍爾德菌的甲醛脫氫酶 (Bm Fald DH)。

表2 多酶級聯(lián)反應(yīng)還原CO2 制備甲醇Table 2 Reduction of CO2 to methanol throughmultienzyme cascade

在以上研究中認(rèn)為:NADH 作為還原劑,為每個(gè)反應(yīng)步驟提供電子。雖然有些研究報(bào)道了分步反應(yīng)的酶活研究,但是在整個(gè)多酶級聯(lián)反應(yīng)過程中,未有檢測中間體甲酸鹽或甲醛的報(bào)道。令人驚訝的是,2018年,AMAO 課題組[17]研究有了新發(fā)現(xiàn),如式7所示:在天然輔酶NADH 存在下,Fald DH 不能催化甲酸生成甲醛(這與在2.2.2 中對酶Fald-DH-sale的研究結(jié)果一致),但在NAD+存在下,Fald DH 可以催化甲醛生成甲酸;他們還提出,在甲基紫精氧化形式 (MV2+) 存在下,FaldDH 不能催化甲醛生成甲酸,但是在甲基紫精還原形式(MV·) 存在下,Fald DH 可以催化甲酸制備甲醛。該研究進(jìn)一步表明甲醛脫氫酶極有可能不依賴NAD(P)H 催化甲酸的還原。

綜合以上研究發(fā)現(xiàn),在天然輔酶NADH 存在下,Fald DH 是否可以催化甲酸生成甲醛取決于以下幾點(diǎn):1)甲酸濃度,Fald DH 催化甲酸還原需要一定的甲酸閾值濃度;2)FaldDH 活性,來自不同菌屬的甲醛脫氫酶對甲酸還原具有不同的活性,可以通過篩選、構(gòu)建或突變等方法找到活性較好的甲醛脫氫酶用于反應(yīng);3)NADH 與NAD+的比值,對于酶催化的可逆氧化還原反應(yīng),NADH 與NAD+需要有適當(dāng)?shù)谋戎?以推動反應(yīng)朝正反應(yīng)方向進(jìn)行;4)構(gòu)建合理可靠的甲醛、甲醇定量方法,不能低于定量方法的檢測限。

3 結(jié)語

1)基于兩種甲醛脫氫酶的質(zhì)粒,成功表達(dá)并分離純化得到高純度的甲醛脫氫酶 (Fald DH-fdh A,Fald DH-PA5421)。

2)建立了NADH、甲醛和甲醇的定量檢測方法,并指出了檢測方法的適用條件。

3)將光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶及醇脫氫酶耦合,雖然未檢測到甲醛或甲醇,但對其影響因素進(jìn)行了對比考察。根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),即使Fald DH能夠催化甲酸還原制備甲醛,推測反應(yīng)熱力學(xué)限制可能是生成的甲醛濃度低于檢測限的原因。

4)給出了在光催化輔酶再生體系與甲醛脫氫酶耦合反應(yīng)過程中需要注意的問題,指出甲醛脫氫酶極有可能不依賴NAD(P)H 催化甲酸的還原。