響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓果渣白蘭地釀造工藝的研究

何 歡，汪緒珍，陳紹依，劉鴻安，周鴻翔*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州茅臺(tái)（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州貴陽 550025）

藍(lán)莓(Vaccinium uliginosumL.)，杜鵑花科越橘屬植物，外觀呈藍(lán)紫色，果實(shí)小，常有一層白色果粉包裹。藍(lán)莓果實(shí)均重0.5～2.5 g，酸甜可口，不僅可以鮮食，也可以加工成果汁、果酒等其他產(chǎn)品[1]。藍(lán)莓果實(shí)除含有豐富的糖、氨基酸、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)外，還富含多種功能性成分，抗氧化能力比一般的水果強(qiáng)，具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，是人類五大健康食品之一，也是“世界第三代水果”[2-3]。藍(lán)莓種植面積逐年增加，產(chǎn)生了果汁、果酒等衍生加工產(chǎn)業(yè)[4]，企業(yè)加工時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量果渣，如果能對(duì)果渣進(jìn)行合理再利用，不僅可以節(jié)約資源，還可避免環(huán)境污染[5-6]。本研究以藍(lán)莓果渣為原料研究藍(lán)莓果渣白蘭地釀造工藝，內(nèi)容包括菌種的選擇、接種量、不同初始糖含量、發(fā)酵溫度，比較藍(lán)莓果渣白蘭地的理化指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)，確定藍(lán)莓果渣白蘭地的最佳生產(chǎn)工藝，為藍(lán)莓果渣白蘭地的釀造提供可行性的生產(chǎn)技術(shù)方案，利用藍(lán)莓果渣生產(chǎn)白蘭地不僅是一種經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，還解決了藍(lán)莓果渣剩余問題，豐富了國內(nèi)白蘭地市場[7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原料與菌株

藍(lán)莓果渣、濃縮蘋果汁，貴州茅臺(tái)（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司；安琪酵母、F33 酵母，市售；異常維克漢姆酵母K-008，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏；漢遜德巴利酵母，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉，重慶川東化工有限公司；酒石酸鉀鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津永大化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶酚，成都金山化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸氫鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備BSA124S-CW 電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；1000 mL 全玻璃蒸餾器，杭州旌斐儀器科技有限公司；酒精計(jì)，杭州旌斐儀器科技有限公司；HH-21-6 電熱恒溫水浴鍋，上海助藍(lán)儀器科技有限公司；SW-CJ-1FD 超潔凈工作臺(tái)，海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-75S11 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQPL-200立式全溫震蕩培養(yǎng)箱，天津菜玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；500 mL、1000 mL數(shù)顯電熱套，杭州旌斐儀器科技有限公司；BCD-640WAGM冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓果渣白蘭地的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

原料→調(diào)配(加糖、加水)→接種酵母→發(fā)酵→原料酒→蒸餾→原白蘭地

操作要點(diǎn)：

接種：異常威克漢姆酵母K-008、漢遜德巴利酵母活化，將裝有菌株的-80 ℃甘油管劃線于YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，將平板上的單菌落挑至100 mL 滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，30 ℃下120 r/min 培養(yǎng)48 h，使培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×108CFU/mL，備于接種。安琪酵母、F33 酵母活化，稱取適量的活性干酵母，加入含糖5 %的無菌溶液，混勻，于35 ℃水浴鍋中保溫20～30 min，直至產(chǎn)生大量泡沫[8]。

發(fā)酵：在藍(lán)莓果渣中添加濃縮蘋果汁和水進(jìn)行發(fā)酵液調(diào)配，采用1 L 三角瓶作為發(fā)酵容器，水封閥密封，放入恒溫生化培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵[9]。

發(fā)酵液的蒸餾：使用1000 mL電熱套及1000 mL全玻璃蒸餾器進(jìn)行蒸餾，蒸餾時(shí)的溫度控制在90 ℃±2 ℃，只收集45%vol以上的酒精[10-11]。

1.2.2 不同酵母菌株對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

取一定量的藍(lán)莓果渣，加水及濃縮蘋果汁，調(diào)整發(fā)酵液初始糖含量為216 mg/mL。分別按照0.3 g/L 接種量添加活化好的F33、安琪、K-008、漢遜德巴利酵母，搖勻，28 ℃恒溫主發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液的各項(xiàng)理化指標(biāo)，使用全玻璃蒸餾器蒸餾出原白蘭地，綜合比較不同酵母釀造藍(lán)莓果渣白蘭地的出酒率、感官評(píng)分，確定釀造藍(lán)莓果渣白蘭地的最佳酵母。

1.2.3 藍(lán)莓果渣白蘭地釀造工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

在篩選出最佳酵母的基礎(chǔ)上，設(shè)置酵母接種量（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L），發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃），初始加糖量（180 mg/mL、198 mg/mL、216 mg/mL、236 mg/mL、252 mg/mL），測定原白蘭地的出酒率并進(jìn)行感官評(píng)分。以出酒率、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察初始含糖量、接種量、發(fā)酵溫度3因素對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓酒釀造工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取顯著因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，以藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分為優(yōu)化指標(biāo)，對(duì)初始加糖量、接種量、發(fā)酵溫度3 個(gè)影響因素利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)模型開展響應(yīng)面分析，獲取最適發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.5 分析檢測

酒精度、總酸按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[25]中的方法進(jìn)行測定；還原糖測定，3,5-二硝基水楊酸比色法[12]。

藍(lán)莓果渣白蘭地出酒率計(jì)算公式如下[13]：

原料出酒精率(mL/kg)=(初蒸餾液酒精度(%vol)×初蒸餾收集液體積(mL))/原料使用量(kg)

藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)價(jià)參照GB/T 11856—2008《白蘭地》[14]中的方法進(jìn)行，男女各10名具有果酒品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的人員對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的色澤、香氣、滋味、典型性進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果采用均值。感官評(píng)分表見表2。

表2 藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016、SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin9.0 進(jìn)行繪圖，使用Design Expert 8.0.6 軟件繪制回歸模型及響應(yīng)面分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

2.1.1 不同酵母的發(fā)酵性能

觀察并記錄4 種酵母發(fā)酵時(shí)的劇烈程度，發(fā)酵結(jié)束時(shí)測定藍(lán)莓果渣白蘭地原料酒的酒精度、殘?zhí)恰⒖偹幔Y(jié)果見表3。

表3 不同酵母發(fā)酵性能比較

一般來說選擇起酵時(shí)間短、發(fā)酵平穩(wěn)、發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)堑?、產(chǎn)酒率高的酵母作為藍(lán)莓果渣白蘭地原料酒的發(fā)酵菌種[15]。在初始糖度一致的條件下，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的殘?zhí)窃降停f明酵母菌轉(zhuǎn)化還原糖能力越強(qiáng)。比較發(fā)酵液殘?zhí)?、酒精度? 種酵母存在顯著性差異（α=0.05），F(xiàn)33 發(fā)酵樣品的殘?zhí)亲畹颓揖凭茸罡?，顯著優(yōu)于其他3種酵母。

2.1.2 不同酵母對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

圖1 不同菌種對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

不同菌種發(fā)酵藍(lán)莓果渣白蘭地出酒率從高到低依次是F33、安琪、K-008、漢遜德巴利酵母，藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分從高到低依次是F33、K-008、安琪、漢遜德巴利酵母。綜合發(fā)酵性能、產(chǎn)酒率、風(fēng)味影響，F(xiàn)33 最合適作為藍(lán)莓果渣白蘭地的發(fā)酵菌種。

2.2 初始加糖量對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

由圖2 可知，藍(lán)莓果渣白蘭地出酒率隨初始加糖量的增加逐漸升高，可能是隨著加糖量的增多，可用于發(fā)酵的糖的總量增加，發(fā)酵蒸餾后得到的白蘭地酒液也就越多[16]。感官評(píng)分隨初始加糖量的增加先升后降，初始加糖量為180 mg/mL和198 mg/mL 時(shí)發(fā)酵速度較快且發(fā)酵提前結(jié)束，糖大部分轉(zhuǎn)化為酒精，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生香氣成分等物質(zhì)的基質(zhì)不足，造成酒體風(fēng)味寡淡；糖含量合適時(shí)，發(fā)酵液中酵母生長正常，代謝正常，使發(fā)酵過程平穩(wěn)進(jìn)行；初始加糖量為236 mg/mL、252 mg/mL 時(shí)能得到較高的出酒率，但初始加糖量過高會(huì)使殘?zhí)窃黾?，發(fā)酵液的滲透壓增大，抑制酵母菌的生長繁殖，延長了酵母菌的生長適應(yīng)期，增加了雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，不利于香氣物質(zhì)積累[17]。從感官評(píng)價(jià)這一指標(biāo)看，初始糖含量為216 mg/mL 時(shí)的感官評(píng)分最高，初始加糖量太高意味著調(diào)整糖度時(shí)所添加的濃縮蘋果汁增多，藍(lán)莓果香、口感會(huì)受到影響。綜上，藍(lán)莓果渣白蘭地發(fā)酵的初始加糖量應(yīng)該選擇216 mg/mL。

圖2 不同初始加糖量對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

2.3 接種量對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

果酒發(fā)酵是在酵母作用下，經(jīng)EMP 途徑酵解生成丙酮酸，在無氧條件下經(jīng)脫羧酶脫羧轉(zhuǎn)化為乙醛，再由乙醛脫氫酶還原成乙醇的過程，酵母接種量影響發(fā)酵速度[18]。如圖3 所示，出酒率總體上隨著酵母接種量的增加緩慢上升，感官評(píng)分先升高后下降。接種量為0.1 g/L時(shí)無法保證酒精積累，發(fā)酵不完全并且殘?zhí)橇窟^高，發(fā)酵周期較長，雜菌污染的可能性增大[19]；隨著酵母菌含量增加，其生長繁殖速度加快，無氧呼吸產(chǎn)生的酒精增多，出酒率升高，消耗的糖也增多[20]；當(dāng)酵母接種量過多時(shí)，發(fā)酵液中的酵母菌濃度高，代謝副產(chǎn)物逐漸增多，酒香逐漸增加，但“酵母味”也相應(yīng)增加，藍(lán)莓原有的果香味逐漸被掩蓋。綜上，藍(lán)莓果渣白蘭地的最佳酵母接種量為0.3 g/L。

圖3 接種量對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

2.4 溫度對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

溫度通過影響酶的活性、細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性以及物質(zhì)的溶解度等影響酵母菌的正常生長[21]。由圖4 分析可知，出酒率先升后降，低溫時(shí)酵母菌代謝能力不強(qiáng)，糖分利用不完全，出酒率低；溫度升高至26 ℃、28 ℃時(shí)，酶活性增強(qiáng)，消耗糖分增多，出酒率升高；當(dāng)溫度升高到30 ℃時(shí)，溫度過高使得酵母過早的老化，代謝能力下降，導(dǎo)致出酒率降低[22]。隨發(fā)酵溫度的升高，感官評(píng)分呈現(xiàn)下降的趨勢；相同接種量條件下，溫度升高，酒精的發(fā)酵變強(qiáng)，發(fā)酵體系可能產(chǎn)生內(nèi)熱影響酵母的生長繁殖，不利于發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的積累，導(dǎo)致藍(lán)莓果香味不強(qiáng)，并伴隨少量的雜味[23-24]。因此，藍(lán)莓果渣白蘭地發(fā)酵溫度選擇28 ℃為宜。

圖4 不同溫度對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓果渣白蘭地發(fā)酵工藝

2.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酵母接種量（g/L）、初始加糖量（mg/mL）及發(fā)酵溫度（℃）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以藍(lán)莓果渣白蘭地感官品評(píng)得分為響應(yīng)指標(biāo)，采用Design Expert 8.0.6 設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 試驗(yàn)。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5.2 響應(yīng)面模型建立及方差分析

Design-Expert 8.0.6 分析軟件對(duì)表4 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果進(jìn)行了多元回歸擬合分析，得到了藍(lán)莓果渣白蘭地感官品評(píng)(Y)與編碼自變量酵母接種量(A)、初始加糖量(B)及發(fā)酵溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸數(shù)學(xué)模型：

感官評(píng)分（Y）=+78.02+0.74A+0.49B-0.92C+1.90AB+2.68AC+1.83BC-5.38A2-6.73B2-5.01C2

由表5 可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.9955、R2adj=0.9896，模型P 值＜0.01（模型極顯著），失擬項(xiàng)P 值為0.5098＞0.05（不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小，可行性高，能用于本試驗(yàn)的預(yù)測分析。一次項(xiàng)A、B、C 顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AC極顯著（P＜0.01）,AB、BC 顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著（P＜0.01），由F 值可知，對(duì)感官評(píng)分影響的排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度（C）＞酵母接種量（A）＞初始加糖量（B）。各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。由圖5 可知，發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始加糖量之間的交互作用對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分影響的響應(yīng)面均呈現(xiàn)傘狀，有最高點(diǎn)，等高線均呈現(xiàn)橢圓形，說明各因素間交互作用對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的感官評(píng)分影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線

表5 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 分析軟件得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接種量0.3 g/L。為驗(yàn)證此工藝的準(zhǔn)確性，按其參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分為77.63±0.25，與預(yù)測值78.02接近，誤差較小，證明響應(yīng)面模型擬合效果較好，可用于藍(lán)莓果渣白蘭地的實(shí)際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以藍(lán)莓果渣為原料，以F33 酵母作為發(fā)酵菌種，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)藍(lán)莓果渣白蘭地的釀造工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出藍(lán)莓果渣白蘭地的最優(yōu)釀造工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接種量0.3 g/L，此條件下得到的藍(lán)莓果渣白蘭地感官評(píng)分為77.63 分±0.25 分，果香酒香濃郁，風(fēng)味典型。本方法具有良好的應(yīng)用前景，可為藍(lán)莓果渣進(jìn)一步加工利用提供依據(jù)。