基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接探討小兒豉翹清熱顆粒治療甲型流感的作用機制

劉嬌，周蓓，易蔚，陳明惠

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

從過去的100 年至今，全世界暴發(fā)了多次全球性的流感大流行[1]。全人群對流感普遍易感，而兒童在流感季節(jié)是重點關(guān)注群體[2]，在每年流行季節(jié)兒童罹患率為20%～30%，特定地區(qū)的兒童流感罹患率可達(dá)到50%左右[3]。甲型流感是春季易流行的常見流感病毒，且甲型流感病毒易變異，流感疫苗預(yù)防接種不能有效預(yù)防變異毒株的感染[4]，西醫(yī)針對甲型流感常用神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋作為首選用藥[5]，但存在甲型流感病毒耐藥的風(fēng)險，小兒豉翹清熱顆粒治療兒童甲型流感有顯著效果[6]，且在流行性感冒診療方案、兒童流感中西醫(yī)結(jié)合等專家共識中作為推薦用藥[7-8]。臨床報道發(fā)現(xiàn)聯(lián)用小兒豉翹清熱顆粒比單用奧司他韋在使癥狀改善、加快病毒轉(zhuǎn)陰等方面，具有明顯療效[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于疾病-靶點-藥物的多層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從系統(tǒng)角度預(yù)測藥物靶點，實現(xiàn)了傳統(tǒng)藥物與現(xiàn)代科學(xué)的接軌，是中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點[10-11]。使中醫(yī)現(xiàn)代化具有潛在的發(fā)展前景。分子對接是研究配體和受體相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[12]，為新型藥物的研發(fā)提供了一個較好的工具[13]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，分析小兒豉翹清熱顆粒治療甲型流感的作用機制，為后續(xù)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫信息

UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmspe.com/tcmsp.php）；GeneCars 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）；OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）；TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd）；PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）；微生信官網(wǎng)（https://www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 篩選藥物及疾病靶點

小兒豉翹清熱顆粒藥物組成有連翹、淡豆豉、薄荷、荊芥、炒梔子、大黃、青蒿、赤芍、檳榔、厚樸、黃芩、半夏、柴胡、甘草，運用中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選藥物活性成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18[14]。利用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢藥物靶點對應(yīng)的基因名。以“H1N1 influenza A virus”“H1N1”“human influenza A virus”“influenza A”為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點，借助GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點，GeneCards 靶點篩選條件Relevance score≥5，將獲取疾病靶點取并集。

1.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選出的藥物活性成分及靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將藥物靶點與疾病靶點取交集作為治療兒童甲型流感的潛在治療靶點，將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，預(yù)測基因靶點之間相互關(guān)聯(lián)，設(shè)置“organisms”為“HomoSapiens”，最低互作閾值設(shè)置為0.400，將預(yù)測結(jié)果PPI網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中可視化。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將交集基因?qū)隓AVID 生物信息數(shù)據(jù)庫中，“SelectIdentifier”選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物種選擇為“Homo_sapiens”，進(jìn)行GO富集分析和KEGG 富集分析，得到生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）及KEGG 通路分析數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)結(jié)果運用微生信在線平臺繪制出GO 富集和KEGG 通路可視化圖。

1.6 分子對接

借助Cytoscape 3.9.1 軟件中“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)信息，將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中，取與交集靶點相連的網(wǎng)絡(luò)成分，新建交集靶點網(wǎng)絡(luò)可視化圖，根據(jù)degree 大小排序得到排名靠前的小分子配體。借助PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 排名，得到排名靠前的大分子受體。利用PubChem 下載小分子配體 3D 結(jié)構(gòu)，并運用OpenBabelGUI 軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化mol2 結(jié)構(gòu)；通過UniProt 數(shù)據(jù)庫及PDB 數(shù)據(jù)庫結(jié)合分析找到大分子受體的蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMol 軟件對大分子蛋白去配體、去水分子等處理，并運用AutoDockTool 軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、活性口袋等處理，借助Autodockgrid 及Autodocktool 計算結(jié)合能，最后運用PyMol 軟件進(jìn)行結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 有效活性成分篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出小兒豉翹清熱顆粒共有245 種藥物活性成分，獲取藥物活性成分信息，根據(jù)OB 排序，前30 個化學(xué)成分見表1，借助UniProt進(jìn)行靶點規(guī)范化，得到269 個藥物靶點。

表1 小兒豉翹清熱顆?；钚曰衔颰able 1 Active components in Xiaoer Chiqiao Qingre Granules

2.2 疾病靶點篩選

通過GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫共同篩選疾病靶點，其中在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選出1 545 個甲型流感相關(guān)基因，OMIM 數(shù)據(jù)庫中篩選出520 個甲型流感相關(guān)基因，TTD 篩選出3 個甲型流感相關(guān)基因，PharmGkb 數(shù)據(jù)庫篩選出9個相關(guān)甲型流感基因，取并集，得到2 045 個疾病靶點。將藥物基因與疾病基因取交集，借助Venny 2.1 繪制韋恩圖，共獲得131 個交集靶點，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease target

2.3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將TCMSP、UniProt 數(shù)據(jù)庫獲得的相關(guān)藥物活性成分及靶點基因數(shù)據(jù)信息，通過Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。通過網(wǎng)絡(luò)分析共獲得484 個節(jié)點和4 474 條邊。根據(jù)“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，將藥物所有小分子的節(jié)點大小用“degree”表示，得到活性小分子得分排序為：槲皮素（731）、豆甾醇（239）、山柰酚（229）、β-谷甾醇（224）、木犀草素（166）、黃芩素（131）、漢黃芩素（82）、柚皮素（70）。這些小分子可能是小兒豉翹清熱顆粒的關(guān)鍵活性成分。

圖2 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of drug-component-target

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將交集基因?qū)隨TRING 蛋白互作分析數(shù)據(jù)庫中，物種選擇為人類，基因靶點之間相互作用關(guān)系以PPI 網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)，將STRING 數(shù)據(jù)庫運算出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 可視化，見圖3。其中，形狀越大、顏色越深代表相互關(guān)聯(lián)作用最強。通過Cytoscape 3.9.1 軟件cytoNCA 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行核心靶點篩選，通過degree 值排序，得出前10 位的核心靶點，見表2。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction networks

表2 核心靶點信息分析Table 2 Analysis of core target information

2.5 GO 富集分析和KEGG 信號通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析得出910 條GO 富集條目及174 條KEGG 信號通路，其中，GO 功能富集結(jié)果包括BP 704 個，CC 72 個，MF 134 個。選取GO 富集分析中每組前10 位繪制條形圖，見圖4。由圖可知，BP 主要與細(xì)胞凋亡過程、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞凋亡過程的正負(fù)調(diào)控、對藥物的反應(yīng)等相關(guān)，CC 主要與膜筏、胞外區(qū)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等相關(guān)。MF 主要與酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等相關(guān)。

圖4 GO 富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of GO enrichment analysis

KEGG 信號通路分析收集排名前20 位的信號通路繪制氣泡圖，見圖5，顏色越深氣泡越大，說明富集程度越大。由圖可知，KEGG 信號通路主要與TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、IL-17 信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、C 型凝集素受體信號通路等通路密切相關(guān)。

圖5 KEGG 信號通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG signaling pathway

2.6 分子對接

新建交集基因可視化網(wǎng)絡(luò)圖按照degree 排名前8位小分子配體分別是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、漢黃芩素、柚皮素。根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖篩選degree 排名前10 的核心靶點是蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、TP53、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-1B、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、胱天蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）。將小分子配體和核心靶點受體進(jìn)行分子對接，結(jié)合能顯示出有良好的結(jié)合性，繪制分子對接結(jié)合能柱狀見圖6。利用PyMol 將蛋白受體與分子配體進(jìn)行分子對接，見圖7。

圖6 分子對接結(jié)合能柱狀圖Fig.6 Bar chart of molecular docking binding energy

圖7 分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram

3 討論

春季風(fēng)正木時，氣候溫暖多風(fēng)，陽氣上升，清代葉天士在《溫?zé)嵴摗吩唬骸按涸率茱L(fēng)，其氣已暖”。甲型流感感染后以發(fā)熱、頭痛、肌痛和全身不適起病，體溫可達(dá)39～40 ℃[1]，具有極強的傳染性，能夠引起大范圍流傳的外感熱病，符合“時行感冒、溫病、瘟疫”范疇[15]。初期常辨證為邪犯肺胃證，具有疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯等功用。小兒豉翹清熱顆粒是由連翹、淡豆豉、薄荷、荊芥、炒梔子、大黃、青蒿、赤芍、檳榔、厚樸、黃芩、半夏、柴胡、甘草14 味中藥組成，源于兒科名家李少川教授50 余年行醫(yī)經(jīng)驗，在銀翹散和達(dá)原飲基礎(chǔ)上化裁而成[16]，選取吳鞠通《溫病條辨》中的“辛涼平劑”銀翹散，主治溫病初起，邪在衛(wèi)分；達(dá)原飲源自《瘟疫論》，用于瘟疫初起，邪伏膜原。在溫病初起階段疏散風(fēng)熱、辟穢化濁，同時兼顧小兒肺脾不足的特點，達(dá)到疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯的作用。

本研究確定了小兒豉翹清熱顆粒的主要成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、漢黃芩素、柚皮素。并獲取了治療甲型流感的關(guān)鍵作用靶點AKT1、TNF、TP53、IL-6、IL-1B、VEGFA、STAT3、CASP3。KEGG 通路主要與Toll樣受體信號通路作為主要通路之一。

3.1 抗炎作用

Toll 受體信號通路（TLRs）是小兒豉翹清熱顆粒作用在甲型流感病毒主要通路之一，TLRs 是先天性免疫的始動環(huán)節(jié)，存在非特異免疫細(xì)胞及某些體細(xì)胞表面的識別受體，通過調(diào)控下游髓分化因子88（MyD88）轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑募集下游白介素1 受體關(guān)聯(lián)激酶1（IRAK1）和IRAK2，使IRAK磷酸化脫離MyD88并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（TRAF6）結(jié)合，從而激活I(lǐng)κB 激酶（IKK 復(fù)合體）并導(dǎo)致NF-κB 信號通路激活，使TNF、IL-6 及IL1B 炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)病毒感染引起的炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究證實，小兒豉翹清熱顆粒的主要成分中山柰酚、β-谷甾醇及漢黃芩素抵抗甲型流感發(fā)揮抗病毒作用可能與TLRs 下游NF-κB 信號通路發(fā)生聯(lián)系[17-19]，且槲皮素和豆甾醇都直接或間接發(fā)揮抗炎作用[20-21]。

3.2 抗病毒作用

木犀草素和黃芩素可通過抑制病毒蛋白的合成從而達(dá)到抗病毒作用，Yan 等[22]發(fā)現(xiàn)木犀草素通過抑制病毒外殼蛋白Ⅰ復(fù)合物的表達(dá)，而黃芩素則是通過抑制甲型H5N1 流感病毒的NP 蛋白的產(chǎn)生[23]；TP53 和STAT3 是甲型流感病毒作用靶點，TP53 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控hGBP1 的表達(dá)發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[24]，流感病毒誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞STAT3 分子早期活化被RIG-I/MAVS 信號通路調(diào)控而達(dá)到抗病毒作用[25]。

3.3 通便作用

小兒豉翹清熱顆粒藥物組成中檳榔、厚樸、大黃有下氣導(dǎo)滯功用，《黃帝內(nèi)經(jīng)》提到肺與大腸相表里，與小兒豉翹清熱顆粒具有疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯相契合，本項研究中槲皮素、山柰酚、木犀草素等具有通便效果，Liu 等[26]提出槲皮素可以通過增加Cajal 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（c-Kit 和SCF）以及水通道蛋白3 的水平來緩解便秘；吳浩等[27]提出槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通過調(diào)節(jié)M 受體及其下游信號通路PKC 蛋白的表達(dá)發(fā)揮潤腸通便的作用。

3.4 細(xì)胞凋亡及氣道水腫

AKT1 及CASP3 抑制流感病毒細(xì)胞凋亡的作用靶點。AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸激酶，它通過多種途徑磷酸化促進(jìn)細(xì)胞生長及抑制細(xì)胞凋亡作用[28]。相關(guān)研究表明通過抑制CASP3 的激活，使裂解的RARP、Caspase-8 和Bax 表達(dá)下調(diào)，從而抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[29]。在減輕氣道水腫方面：VEGFA 屬于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），相關(guān)研究提出炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)VEGF 與其受體的表達(dá)，VEGF 的升高可導(dǎo)致支氣管血管的滲透性增加，引起肺間質(zhì)內(nèi)物質(zhì)改變，造成氣道水腫，增加氣道感染風(fēng)險[30-31]。

綜上所述，本項研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)小兒豉翹清熱顆粒治療甲型流感通過多靶點、多通路、多效應(yīng)發(fā)揮著作用，主要與炎癥反應(yīng)、病毒感染、細(xì)胞凋亡等相關(guān)，并預(yù)測可能與Toll 樣受體信號通路相關(guān)，同時分子對接顯示出活性關(guān)鍵分子與核心靶點受體對接有良好的結(jié)合性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突