美洲大蠊多肽的藥理作用研究進(jìn)展

陳雅婷 ，蘭昱，鄧子賢，張?jiān)魄?，武世勛，黃亞冰，沈秉正*

1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430060

2. 武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430060

3. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院 病理科，湖北 武漢 430060

美洲大蠊別名蟑螂，屬蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，在中醫(yī)學(xué)中是一味重要的動(dòng)物類(lèi)中藥，含有豐富的氨基酸、多糖、細(xì)胞色素、各種酶類(lèi)，還含有多種礦物元素、維生素、脂肪和脂肪酸等成分。美洲大蠊中的藥用成分主要有多肽、蛋白、多元醇類(lèi)、黏糖氨酸等[1]。目前為止，在國(guó)際權(quán)威多肽與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt 中，共收錄美洲大蠊多肽、蛋白序列1 407 條，其中由1～200 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽和小蛋白序列有495 條，占比35.2%。

以往對(duì)美洲大蠊藥理活性的研究主要集中于提取物，主要的制備過(guò)程為：用水進(jìn)行煎煮，然后用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇去除雜質(zhì)，最后進(jìn)行精制，以精制物中多肽、蛋白的總量作為主要指標(biāo)。藥理學(xué)研究表明，美洲大蠊中提取的多肽精制物的活性廣泛，具有清除自由基、改善抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛以及促細(xì)胞增殖、遷移等作用，且在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性[2-4]。另外，學(xué)者在研究美洲大蠊多肽防治酒精所致小鼠急性胃潰瘍時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予相對(duì)分子質(zhì)量1 000～5 000的美洲大蠊多肽可降低丙二醛、一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的水平，同時(shí)增強(qiáng)超氧化物歧化酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，亦能減少氧自由基和NO 自由基含量，從而防治小鼠急性胃部潰瘍[5]。

隨著中藥現(xiàn)代化工作的推進(jìn)和研究技術(shù)的不斷完善和成熟，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程等先進(jìn)的技術(shù)方法從美洲大蠊中獲得了許多單組分的活性多肽，其具有成分單一、純度高、質(zhì)量可控等諸多優(yōu)點(diǎn)，該方法也是對(duì)傳統(tǒng)中藥進(jìn)行深入研究的有效手段。近年來(lái)，相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于美洲大蠊具有抗微生物、抗腫瘤、促傷口愈合以及神經(jīng)肽等單組分活性多肽，如periplanetasin-2、periplanetasin-4、美洲大蠊防御素（PaDefensins）、periplanetasin-5、Pa-THY1、短神經(jīng)肽（sNPF）。本文對(duì)美洲大蠊多肽的抗微生物、抗腫瘤、促傷口愈合和神經(jīng)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了綜述，以期為美洲大蠊多肽類(lèi)藥物的篩選、結(jié)構(gòu)改造以及新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 抗微生物作用

1.1 抗菌

來(lái)源于美洲大蠊的多肽periplanetasin-2 對(duì)真菌有很強(qiáng)的抗菌作用[6]。periplanetasin-2 對(duì)于白念珠菌、近平滑念珠菌、白色毛孢子菌、糠秕馬拉色菌、黃曲霉以及煙曲霉均具有較好的抗菌作用，最小抑菌濃度（MIC）分別為10、5、5、5、10、10 μmol/L，同時(shí)其在濃度高達(dá)80 μmol/L 時(shí)，溶血作用極低，結(jié)果表明其安全性較好?？咕鷻C(jī)制的研究表明，periplanetasin-2 作用于白色念珠菌后，可觀察到線粒體去極化和鈣積累，細(xì)胞膜谷胱甘肽減少以及線粒體中產(chǎn)生大量活性氧（ROS）。由于線粒體功能障礙，細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的半胱天冬酶caspase 被激活[7-8]。因此，periplanetasin-2 通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化使菌體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。還能通過(guò)磷脂酰絲氨酸暴露和DNA 斷裂導(dǎo)致菌體凋亡，且具有劑量相關(guān)性。除了抗真菌活性外，periplanetasin-2 肽亦具有抗細(xì)菌作用[9]。與目前發(fā)現(xiàn)的許多抗菌肽的抗菌活性主要集中于革蘭陽(yáng)性菌不同[10]，除了對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效之外，periplanetasin-2 對(duì)革蘭陰性菌如大腸桿菌在內(nèi)的多種病原細(xì)菌具有強(qiáng)效抗菌作用。具體而言，periplanetasin-2抑制革蘭陽(yáng)性菌糞腸球菌E.faeciumATCC 19434、糞腸球菌E.faeciumATCC 29212、表皮葡萄球菌、變形鏈球菌，最小抑菌濃度（MIC）值為2.5～5 μmol/L；抑制革蘭陰性菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌的MIC 值為5～10 μmol/L。以大腸桿菌為對(duì)象，periplanetasin-2 對(duì)其抗細(xì)菌作用機(jī)制的研究表明，與大多數(shù)的抗菌肽作用于菌體的膜結(jié)構(gòu)不同，periplanetasin-2 可使菌株膜去極化、DNA 斷裂、類(lèi)caspase 蛋白激活和磷脂酰絲氨酸外化。但使用ROS清除劑進(jìn)行預(yù)處理后，上述這些變化會(huì)減弱。此外，菌體凋亡還受到SOS 反應(yīng)所需成分的影響，在缺乏該反應(yīng)必需蛋白R(shí)ecA 的情況下，大腸桿菌不會(huì)發(fā)生凋亡。SOS 反應(yīng)是一種基因組修復(fù)機(jī)制，僅在細(xì)胞基因組受到廣泛損傷時(shí)激活[11-12]。因此，periplanetasin-2 的抗菌機(jī)制為ROS 誘導(dǎo)的類(lèi)凋亡，需要RecA 蛋白來(lái)介導(dǎo)。

periplanetasin-4 是從美洲大蠊中提取的一種含有13 個(gè)氨基酸殘基的多肽[13]，對(duì)念珠菌屬、孢子菌屬、霉菌的MIC 值在2.5～10 μmol/L。人紅細(xì)胞溶血活性和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)表明，periplanetasin-4 在濃度為1.3～80 μmol/L 時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯的溶血活性和LDH 的釋放，表明該多肽的安全性較好。作用機(jī)制研究表明，periplanetasin-4 一方面可提高菌體內(nèi)過(guò)氧化氫酶和總谷胱甘肽的含量，導(dǎo)致氧化損傷，但對(duì)DNA 無(wú)損傷作用；另一方面可使菌株線粒體對(duì)鈣離子的吸收增加。因此，其誘導(dǎo)的菌株死亡與過(guò)氧化氫自由基的產(chǎn)生和液泡的紊亂（如通透性增加和堿化）有關(guān)。在鈣離子從液泡向線粒體移動(dòng)的同時(shí)，相關(guān)細(xì)胞器的固有功能也受到了損害[14-16]。總之，periplanetasin-4 在干擾、破壞線粒體等細(xì)胞器功能的同時(shí)，還刺激了超氧化物信號(hào)，導(dǎo)致了氧化損傷。Lee 等[17]研究了periplanetasin-4 及其類(lèi)似物的抗細(xì)菌作用，結(jié)果表明野生型天然序列對(duì)革蘭陽(yáng)性菌，如腸球菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬均具有顯著的抑制作用，MIC值為2.5 μmol/L；對(duì)革蘭陽(yáng)性菌，如腸桿菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬亦具有較好的抑制作用，MIC值為2.5～5 μmol/L。通過(guò)對(duì)天然序列第3 位組氨酸H，第8 位酪氨酸Y 和第9 位半胱氨酸C 均逐一全部替換為強(qiáng)堿性氨基酸精氨酸R，得到了3 個(gè)periplanetasin-4 的類(lèi)似物，3 個(gè)類(lèi)似物對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的活性均低于periplanetasin-4。這些類(lèi)似物抗革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌的活性均低于periplanetasin-4。膜電位測(cè)定和膜滲透性變化的研究以及膜流動(dòng)性試驗(yàn)表明，與periplanetasin-4 相比，3 個(gè)類(lèi)似物對(duì)膜完整性的破壞較小。用類(lèi)似物處理人工膜的研究中，大于鈣黃蛋白標(biāo)記右旋糖酐（FD4，相對(duì)分子質(zhì)量4 000）的分子很難通過(guò)。因此，在形成靜電相互作用之前，與質(zhì)膜的疏水相互作用的減弱，導(dǎo)致改造后的多肽在膜上的積累減少，從而導(dǎo)致類(lèi)似物的抗菌活性減弱。

1.2 抗病毒

由于缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，美洲大蠊只能依靠先天性免疫機(jī)制來(lái)對(duì)抗病原體感染。美洲大蠊通過(guò)調(diào)節(jié)抗菌肽（AMP）基因的表達(dá)來(lái)完成抗病原微生物反應(yīng)。除了上述線性的抗微生物短肽，還有一類(lèi)AMP 因富含半胱氨酸，也被稱(chēng)為宿主防御肽（防御素）。昆蟲(chóng)防御素一般為相對(duì)分子質(zhì)量4 000～6 000的陽(yáng)離子AMP 家族，大多含有6 個(gè)半胱氨酸殘基，除了抗細(xì)菌、真菌外，部分防御素亦具有抗病毒作用[20-22]。Li 等[23]研究表明，美洲大蠊基因組編碼多個(gè)抗菌肽基因，基于這些數(shù)據(jù)，該研究團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè)了5 種新的PaDefensin，并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了它們的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，推測(cè)PaDefensin 具有抗微生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PaDefensin5 具有抗病毒活性，該分子的全長(zhǎng)序列由57 個(gè)氨基酸殘基組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲的比例分別為42.11%、19.30%、14.04%、24.56%，含有3 對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。

研究表明，0.01 mg/mL PaDefensin5 多肽體內(nèi)外均表現(xiàn)出有較好的抗果蠅C 病毒的作用。果蠅Kc細(xì)胞在感染果蠅C 病毒后24 h 發(fā)生凋亡，而單獨(dú)使用PaDefensin5 處理并不影響細(xì)胞凋亡。與果蠅C 病毒感染的細(xì)胞相比，經(jīng)PaDefensin5 處理的果蠅C 病毒感染細(xì)胞明顯抑制了細(xì)胞凋亡和壞死，包括早期凋亡、晚期凋亡和壞死的比例均有所降低。

2 抗腫瘤作用

Kim 等[24]研究了periplanetasin-5 的抗腫瘤作用及其機(jī)制，結(jié)果表明，periplanetasin-5 對(duì)人慢性髓原白血病腫瘤細(xì)胞K562 具有較好的抑制作用，當(dāng)periplanetasin-5 的質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)無(wú)明顯抗腫瘤活性，而當(dāng)質(zhì)量濃度增加至30～70 μg/mL 時(shí)，其對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷的比例大于60.0%。吖啶橙（AO）/溴乙錠（EB）活死染結(jié)果表明，當(dāng)0～30 μg/mL 濃度下，細(xì)胞狀態(tài)尚可，且能觀察到許多綠色熒光細(xì)胞（活細(xì)胞），當(dāng)periplanetasin-5 質(zhì)量濃度升高至50 μg/mL 及以上時(shí)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死，細(xì)胞呈現(xiàn)出橙紅色、紅色熒光。通過(guò)流式細(xì)胞儀定量研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Periplanetasin-5 70 μg/mL 處理后K562 細(xì)胞群中晚期細(xì)胞凋亡增加約12%，壞死增加了33%。結(jié)果提示較高濃度的periplanetasin-5 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞K562 死亡。

DNA 斷裂也是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要特征，核小體間DNA 的降解是細(xì)胞凋亡的最后階段[25]，核內(nèi)切酶的激活而出現(xiàn)的DNA 的斷裂是大多數(shù)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。經(jīng)50～70 μg/mL perplanetasin-5 處理后，K562 細(xì)胞的染色體DNA 呈階梯狀破碎，其誘導(dǎo)的促凋亡作用可降低腫瘤細(xì)胞K562 的活力。細(xì)胞凋亡的機(jī)制總體而言可分為內(nèi)源性（線粒體介導(dǎo)）和外源性（死亡受體介導(dǎo)）的途徑[26-27]，對(duì)凋亡機(jī)制的研究表明caspase-3、caspase-8、caspase-9 和PARP蛋白的表達(dá)量隨著periplanetasin-5 劑量的增加而增加，同時(shí)凋亡因子細(xì)胞色素C 和Fas 的表達(dá)亦增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)降低。因此，perplanetasin-5 誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞K562 的凋亡是通過(guò)激活caspase 介導(dǎo)的。

3 促傷口愈合作用

以往對(duì)美洲大蠊促傷口愈合的研究主要集中在其提取物或精制后的多肽混合物[28-29]。Jing 等[30]利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)美洲大蠊基因組和轉(zhuǎn)錄組中胸腺肽β4 同源物的DNA 序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了3 個(gè)來(lái)源于美洲大蠊的胸腺肽β4 同源物（Pa-THYs，命名為Pa-THY1、Pa-THY2、Pa-THY3）在促傷口愈合中的作用。通過(guò)原核表達(dá)獲得上述3 個(gè)美洲大蠊的胸腺肽β4 同源物，并進(jìn)行了純化，0.1 μg/mL Pa-THY3 能加速成纖維細(xì)胞NIH-3T3 的遷移速度，而Pa-THY1、Pa-THY2則需要較高的質(zhì)量濃度（1 μg/mL）才能對(duì)細(xì)胞遷移產(chǎn)生較強(qiáng)的影響。但0.01～10 μg/mL Pa-THYs 對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的作用。小鼠背部建立全層皮膚創(chuàng)面模型后，治療組每天用Pa-THYs 蛋白處理，相較于對(duì)照組（PBS 處理），治療組能顯著加快傷口愈合的速度，并且在治療過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量無(wú)明顯變化，且未見(jiàn)明顯行為異常和毒性。

作用機(jī)制的研究表明，在給藥第5 天，相較于PBS 組，Pa-THYs 治療組可形成大量肉芽組織，而在治療第7 天，治療組的炎癥反應(yīng)也明顯較對(duì)照組輕。其次，血管新生是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵過(guò)程[31]，免疫組織化學(xué)研究表明Pa-THYs 治療幾天后，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31（又被稱(chēng)為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子）的表達(dá)量比PBS 組明顯增多，且能觀察到條狀血管新生。另外，膠原蛋白是重建創(chuàng)面真皮組織的重要成分，通過(guò)馬松三色染色研究膠原的沉積，結(jié)果表明，Pa-THYs 治療第3、5 天，可觀察到創(chuàng)面底部膠原纖維明顯堆積，第10 天時(shí)膠原蛋白逐漸充滿整個(gè)創(chuàng)面組織，而PBS 組膠原分布稀疏，說(shuō)明Pa-THYs 可促進(jìn)傷口愈合過(guò)程中膠原的沉積。最后，對(duì)創(chuàng)面愈合中相關(guān)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)的研究表明，與PBS 組相比，Pa-THY1 在一定程度上能刺激b-FGF、MMP-2、TGF-β 和PDGF-BB的表達(dá)；Pa-THY2 能使MMP-2、TGF-β 和PDGFBB 的表達(dá)上調(diào)，特別是在第5、10 天TGF-β 有極顯著的升高。結(jié)果提示Pa-THY3 主要刺激MMP-2和PDGF-BB 的表達(dá)從而加速創(chuàng)面愈合。

4 神經(jīng)調(diào)節(jié)作用

Zeng 等[32]采用基于基因組學(xué)和多肽組學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)美洲大蠊神經(jīng)肽進(jìn)行了鑒定。通過(guò)對(duì)美洲大蠊基因組和轉(zhuǎn)錄組的組學(xué)分析，預(yù)測(cè)了67 個(gè)保守的神經(jīng)肽或神經(jīng)激素前體基因。通過(guò)對(duì)4 個(gè)不同組織（中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心包膜和心包膜復(fù)合體、中腸和雄性附屬腺）的多肽進(jìn)行肽組學(xué)分析，預(yù)測(cè)了35 種保守的神經(jīng)肽，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了1 種新的sNPF。進(jìn)一步研究揭示了兩種保守神經(jīng)肽allatostatin B、sNPF 的組織分布、性別差異和發(fā)育模式。研究者使用了神經(jīng)肽的質(zhì)譜成像的方法，該技術(shù)能夠?qū)⒚庖呓M織化學(xué)的空間分辨信息與質(zhì)譜分析的肽組學(xué)信息相結(jié)合。對(duì)sNPF 的深入研究發(fā)現(xiàn)，其與之前在中腸中發(fā)現(xiàn)的sNPF 一致，sNPF 及其受體sNPFR的時(shí)空分布表明，該神經(jīng)肽在中腸中的作用對(duì)于雌性比雄性更重要。研究者用RNAi 敲除sNPF 和sNPFR 基因的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有獲得成功。盡管如此，神經(jīng)肽和詳細(xì)的時(shí)空分布模式可為未來(lái)研究美洲大蠊神經(jīng)肽的功能提供基礎(chǔ)。采用基因組學(xué)和多肽區(qū)為基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)策略，可以大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)美洲蠊中保守的神經(jīng)肽和新的神經(jīng)肽，可為研究美洲大蠊神經(jīng)肽提供新的認(rèn)識(shí)，并為理解神經(jīng)肽的作用機(jī)制提供重要參考。

來(lái)源于美洲大蠊的活性多肽的序列、功能等情況見(jiàn)表1。

表1 來(lái)源于美洲大蠊的活性多肽Table 1 Active peptides from P.americana

5 結(jié)語(yǔ)

活性多肽是美洲大蠊中主要的藥用成分，也是其提取物中的主要藥理活性成分。通過(guò)現(xiàn)代研究技術(shù)所發(fā)現(xiàn)的單一組分的美洲大蠊活性多肽具有功能確切、易于制備、質(zhì)量可控、批次間質(zhì)量均一穩(wěn)定、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，而且能避免雜質(zhì)多肽和雜蛋白所導(dǎo)致的不良反應(yīng)或免疫原性，亦能為后續(xù)新藥開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。另一方面，近幾年發(fā)現(xiàn)的單組分多肽藥理活性廣泛，涉及抗菌、抗病毒、抗腫瘤、促傷口愈合等諸多方面。因此，美洲大蠊單組分活性多肽亦可作為模板分子，用于結(jié)構(gòu)修飾或改造，以獲得更好的成藥性，從而為治療微生物感染、癌癥、創(chuàng)傷等領(lǐng)域的新藥研究與開(kāi)發(fā)提供新的思路，提高研發(fā)的成功率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突