消痔丸對醋酸致肛門潰瘍模型大鼠的作用機制研究

李新，華永晨，王春芳,，黃澤森,，韓彥琪，趙專友，許浚，劉永姝,，郝泉，姚鵬飛，張鐵軍*，柴國林*

1.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質量控制技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統(tǒng)轉化全國重點實驗室，天津 300462

4.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730000

5.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

痔瘡是一種非常普通的臨床上常見的肛腸疾病，發(fā)病率較高，因其隨時可以發(fā)作，嚴重影響人們的生活與健康。痔瘡的病理特征是肛墊病理性肥大、移位及肛周皮下血管叢血流瘀滯形成的局部腫塊，痔急性發(fā)作常表現(xiàn)為黏膜糜爛、疼痛、便血、紅腫、滲出等，并伴有病變部位的感染。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷或炎癥性因素可使各種細胞因子表達和活性增強，造成微血管壁及內皮細胞的損傷，不僅導致痔血管生成繼續(xù)增加，還導致痔出血、水腫、脫出等臨床癥狀，而增大和脫出的痔更易于發(fā)生創(chuàng)傷和炎癥，從而形成痔發(fā)病中的惡性循環(huán)[1]。目前臨床對早期痔瘡主要治療方法為非手術治療（如內服、熏洗坐浴、外敷、激光等），從止痛、止血、抑制腫脹、促進潰瘍愈合及抗炎等方面著手對痔瘡進行有效治療[2]。

消痔丸出自《瘍醫(yī)大全》，由地榆（炒炭）、牡丹皮、三顆針皮（炒炭）、大黃（酒炒）、黃芪、白及、槐角（蜜炙）、防己、白術（炒）、當歸（酒炒）、火麻仁（炒黃）及動物大腸12 味中藥組成，具有消腫生肌、清熱潤便、補氣固脫、止血、止痛的功效，主要用于痔疾腫痛、便秘出血、脫肛不收及腸風下血、積滯不化等癥，主治痔瘡。本研究采用醋酸建立大鼠肛門潰瘍模型，進一步探討消痔丸對潰瘍愈合、抗炎消腫等方面的影響。

1 材料

1.1 藥物和試劑

消痔丸由蘭州佛慈制藥股份有限公司生產，每100 丸重4 g，批號 210712；柑橘黃酮片由法國施維雅藥廠生產，規(guī)格500 mg（以總黃酮計），批號2 019224；痔炎消片由馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司生產，規(guī)格0.53 g/片，批號220411。

冰醋酸（康科德公司，批號210312）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20220806）；大鼠基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）ELISA 檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號2212261）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（美國Immunoway 公司，批號KL04JH4L0322）；大鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA檢測試劑盒（美國 R&D Systems 公司，批號900101）；轉化生長因子β1（TGFβ1）抗體（Affinity公司，批號20R6523）；誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）抗體（Affinity 公司，批號62Y7896）；血管內皮生長因子A（VEGFA）抗體（Affinity 公司，批號83M8093）；蘇木素染色液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9610）；伊紅染色液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9613）；兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號2228G1129）。

1.2 動物

SPF 級SD 大鼠，5～6 周齡，體質量180～200 g，大鼠由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)在天津天誠新藥評價有限公司實驗動物屏障系統(tǒng)[合格證SYXK（津）2021-0008]，溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風次數(shù)為10～15 次/h 全新風，光照為12 h 明、12 h 暗。自由攝食飲水，適應性喂養(yǎng)1 周。實驗動物的使用經天津天誠新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（IACUC：No.2022122302）。

1.3 儀器

SpectraMaxM5 酶標儀（美國MolecularDevices公司）；Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；WD-2103B 自動洗板機（北京六一生物科技有限公司）；Leica TP-1020 脫水機（徠卡儀器有限公司）；Leica HistoCore MULTICUT病理切片機（徠卡儀器有限公司）；ES500-1 包埋機（金華市華速科技有限公司）；ES500-3H 組織攤片機（金華市華速科技有限公司）；Leica DM750 正置光學顯微鏡（徠卡儀器有限公司）；ICC50W 成像系統(tǒng)（徠卡儀器有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備、分組及給藥

取SD 大鼠80 只，除了對照組10 只，其余大鼠采用浸有冰醋酸的6 mm 濾紙片貼敷肛門，濾紙片需緊密接觸肛門皮膚及黏膜，每只鼠用3 片濾紙片，每片貼30 s。6 h 后觀察潰瘍程度并于24 h 后篩選模型成功的大鼠分為模型組、痔炎消片（0.86 g/kg）組、柑橘黃酮片（0.27 g/kg）組和消痔丸（0.81、1.62、3.24 g/kg）組，每組10 只，每天1 次，連續(xù)ig 給藥10 d。對照組與模型組ig 給予同等體積的0.1% CMC-Na 溶液。

根據(jù)臨床給藥劑量以人體質量70 kg 換算消痔丸大鼠等效劑量，即中劑量1.62 g/kg，據(jù)此分別設置臨床劑量1/2 與2 倍即低劑量組0.81 g/kg 和3.24 g/kg，同時分別根據(jù)陽性藥痔炎消片、柑橘黃酮片臨床給藥劑量換算得出其大鼠給藥劑量分別為0.86 g/kg 和0.27 g/kg。將以上藥物研磨均勻后以0.1%CMC-Na 溶液充分混懸按照10 mL/kg ig 給藥。

2.2 觀察及檢測指標

2.2.1 肛周形態(tài)及肛門潰瘍面積 記錄造模后（造模當天為0 d）第1、3、7、10 d 各組大鼠肛周潰瘍、潮濕、焦瘕、黏液等情況，并采用Image J 軟件對潰瘍面積進行計算。評定標準按照表1 進行[3-4]。

表1 表觀指標分級標準Table 1 Apparent index grading standard

2.2.2 樣品制備 末次給藥1 h 后，以1%戊巴比妥鈉麻醉，肛周脫毛，棉簽置入肛門內作為指引，沿肛周環(huán)形分離肛門，深置直腸5 mm 處，剪斷直腸，移出標本，剔除周圍結締組織，縱剖，用冰冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干表面水分，將肛周及直腸組織分為2 部分，一部分用于組織因子檢測，另一部分組織用于病理學及組化檢測。

2.2.3 肛門組織病理學檢測 取2.2.2 項下1/3 量肛門直腸組織，放入10%甲醛溶液中固定，經脫水、包埋后切片，石蠟切片經脫蠟至水、蘇木素-伊紅染色后脫水封片，經顯微鏡鏡檢后采集圖像進行分級評分：以大鼠肛周組織黏膜上皮和鱗狀上皮細胞排列、增生、缺損，間質或黏膜下充血出血水腫，炎性滲出及壞死，炎細胞浸潤和結締組織增生為觀察指標，依據(jù)病變程度和范圍分為5 個等級，正常0 分，輕微1 分，輕度2 分，中度3 分，重度4 分。

2.2.4 肛門組織中MMP-9、TNF-α、IL-6 含量 取-80 ℃凍存的肛門組織適量，加入適量生理鹽水勻漿至均勻、無明顯組織塊后4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清按照試劑盒要求檢測MMP-9、TNF-α、IL-6 含量。

2.2.5 肛門組織iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白表達收集肛門組織，放入10%甲醛溶液中固定，將組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片處理，按照免疫組化試劑盒操作分別以iNOS、TGF-β1、VEGFA 抗體（1∶200）孵育后，經反應增強液、酶標聚合物、DAB 顯色、蘇木素復染后脫水封片，于顯微鏡下觀察肛門組織中iNOS、TGF-β1、VEGFA 的蛋白表達，iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒。利用Image J 圖像分析軟件進行半定量分析，每組取3 個樣本進行實驗，每張片子隨機取5 個高倍視野，測量每個視野中蛋白陽性染色區(qū)域面積，計算得到陽性染色區(qū)域面與總面積比值，即為iNOS、TGFβ1、VEGFA 蛋白相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示，組間差異性采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 消痔丸對大鼠肛周潰瘍的影響

對照組大鼠肛門回縮，肛內黏膜無損傷，肛周無水腫等異常情況。各組動物貼敷冰醋酸紙片后均出現(xiàn)白色潰瘍面、肛周腫脹、黏液分泌增加、潮濕度顯著增加等癥狀，隨著時間推移，各組大鼠肛周潰瘍會自行愈和，但給藥組大鼠潰瘍愈合速度明顯加快，尤其在造模后第7 d 時與模型組相比，消痔丸表觀評分及潰瘍面積明顯降低（P＜0.05、0.01、0.001），至造模后第10 d 時各給藥組在潰瘍面積和表觀評分的治療效果非常顯著（P＜0.01、0.001），提示各給藥組具有明顯的抗醋酸誘導的肛門潰瘍作用，見表2、3。

表2 消痔丸對大鼠表觀指標的影響（，n=10）Table 2 Effects of Xiaozhi Pills on apparent index in rats (,n=10)

表2 消痔丸對大鼠表觀指標的影響（，n=10）Table 2 Effects of Xiaozhi Pills on apparent index in rats (,n=10)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

表3 消痔丸對大鼠潰瘍面積的影響（，n=10）Table 3 Effects of Xiaozhi Pills on ulcer area in rats (,n=10)

表3 消痔丸對大鼠潰瘍面積的影響（，n=10）Table 3 Effects of Xiaozhi Pills on ulcer area in rats (,n=10)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

3.2 消痔丸對大鼠組織病理的影響

肛門直腸組織的HE 染色病理結果如圖1、表4 所示，對照組大鼠肛周組織黏膜上皮和鱗狀上皮細胞排列整齊，未見增生及缺損，間質或黏膜下層未見水腫，小血管擴張充血或出血，炎細胞不明顯。模型組大鼠肛周黏膜上皮見脫落欠整齊，局部鱗狀上皮層增厚，肛周組織黏膜上皮和鱗狀上皮間見損傷區(qū)，其間上皮組織缺損，大量嗜中性粒細胞浸潤并見炎細胞碎片，侵及黏膜下層或深部肌組織，見炎性滲出物及壞死組織，間質或黏膜下水腫，小血管擴張充血，見散在出血。結締組織增生反應明顯，損傷區(qū)累及周邊組織。與對照組相比，模型組大鼠肛門直腸組織病理學評分顯著提高（P＜0.001）。經消痔丸治療后，大鼠肛周黏膜上皮脫落減少，有的甚至呈現(xiàn)修復完好，局部鱗狀上皮層增厚明顯減輕，肛周組織黏膜上皮和鱗狀上皮見損傷區(qū)，其間上皮組織輕度缺損，缺損范圍較模型組明顯縮小，嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤減少，炎性滲出物，間質或黏膜下水腫和小血管擴張充血程度明顯減輕，結締組織增生也呈現(xiàn)輕中度反應。與模型組相比，消痔丸各給藥組病理學評分顯著降低（P＜0.05、0.001）。

圖1 各組大鼠肛門直腸組織病理結果（HE 染色）Fig.1 Pathological results of anorectal tissue of rats in each group (HE staining)

表4 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型病理形態(tài)學損傷評分的影響（，n=3）Table 4 Effects of Xiaozhi Pills on histopathological damage score of acetic acid induced anal ulceration in rats (,n=3)

表4 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型病理形態(tài)學損傷評分的影響（，n=3）Table 4 Effects of Xiaozhi Pills on histopathological damage score of acetic acid induced anal ulceration in rats (,n=3)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

3.3 消痔丸對大鼠肛門直腸組織中MMP-9、IL-6、TNF-α 的影響

如表5 所示，與對照組比較，模型組肛門直腸組織中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量顯著增高（P＜0.001）。與模型組相比，消痔丸以及各給藥組均可顯著降低肛門組織中的MMP-9、IL-6、TNF-α 含量（P＜0.001）。

表5 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型肛門直腸組織中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量的影響（，n=10）Table 5 Effects of Xiaozhi Pills on anorectal tissue MMP-9,IL-6,and TNF-α on acetic acid induced anal ulceration in rats(,n=10)

表5 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型肛門直腸組織中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量的影響（，n=10）Table 5 Effects of Xiaozhi Pills on anorectal tissue MMP-9,IL-6,and TNF-α on acetic acid induced anal ulceration in rats(,n=10)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：###P＜0.001***P <0.001 vs control group;###P <0.001 vs model group

3.4 消痔丸對大鼠肛門組織中iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白表達的影響

如表6、圖2 所示，與對照組比較，模型組肛門直腸組織中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表達水平均顯著增高（P＜0.001）。與模型組比較，各給藥組可顯著降低iNOS、VEGFA 蛋白表達水平（P＜0.001），消痔丸1.62、3.24 g/kg 組可進一步升高TGFβ1 蛋白表達水平（P＜0.05）。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠肛門組織iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表達（×400）Fig.2 Expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group detected by immunohistochemistry (×400)

表6 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型肛門直腸組織中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表達的影響（，n=10）Table 6 Effects of Xiaozhi Pills on the expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group (,n=10)

表6 消痔丸對醋酸誘導大鼠肛門潰瘍模型肛門直腸組織中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表達的影響（，n=10）Table 6 Effects of Xiaozhi Pills on the expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group (,n=10)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ###P <0.001 vs model group

4 討論

中醫(yī)認為氣血不調，絡脈瘀滯，蘊生濕熱是痔瘡的成因，與飲食起居、久站久行、便秘腹瀉、妊娠分娩、遺傳，以及風、濕、瘀、熱等外因有關?，F(xiàn)代醫(yī)學關于痔的病因及發(fā)病機制研究較多，如肛墊下移學說、靜脈曲張學說、血管增生學說，但尚未取得一致結論。目前對痔組織的研究認為痔組織主要由受損后異常擴張的靜脈血管組成，靜脈內常見血栓形成，此外還常伴有炎性改變（如淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤）、水腫和充血等，造成肛腸黏膜損傷，表面可見潰瘍形成[5]。消痔丸由12 味藥組成，方中地榆炭、白及、大黃等多味中藥具有收斂固澀、消腫生肌等功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷可抑制細胞間黏附分子 1（ICAM）、P-選擇素的表達，降低iNOS 的合成和谷胱甘肽的消耗，起到預防和治療腸道潰瘍性結腸炎的作用[6]；地榆炭涼血止血，研究發(fā)現(xiàn)鞣質和鈣離子的增加可顯著縮短凝血時間并促進血小板聚集，發(fā)揮止血作用[7]；槐角可下調IL-6 水平，抑制一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）釋放，抑制核因子κB（NF-κB）核轉位和細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）磷酸化，表現(xiàn)出良好的抗炎活性；另外還可縮短斷尾小鼠的出血時間和凝血時間，具有明顯的促進止血和凝血作用[8]；酒大黃中沒食子酸、大黃酚等成分可發(fā)揮收斂止血作用，大黃素、蘆薈大黃素等成分可發(fā)揮抗菌消炎作用，是有效對抗黏膜損傷和細菌感染的物質基礎[9]；防己中的粉防己堿可通過抑制磷脂酶A2（PLA2），阻止單核細胞和中性粒細胞中PG 和白三烯的產生，對大鼠潰瘍性結腸炎具有明確的改善作用[10]；白及可通過激活外源性、內源性凝血系統(tǒng)，調節(jié)6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）水平，促進血小板聚集，發(fā)揮止血功能，還可通過下調c-Jun 氨基末端激酶（JNK）及p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）基因和蛋白表達水平，抑制炎癥因子TNFα、IL-1β 等異常分泌發(fā)揮黏膜保護、抗?jié)冏饔?，另外還具有促進創(chuàng)傷愈合和抗菌作用[11]。

醋酸致肛門潰瘍法可致局部紅腫、炎性滲出、潰瘍改變，與痔急性發(fā)作期表現(xiàn)的疼痛、便血、紅腫、滲出、黏膜糜爛等癥狀較為相近，且有維持時間較長、可重復性較好等優(yōu)點[12]，采用該模型可以從保護黏膜損傷、抗炎消腫等多個角度，評價藥物“消腫生肌”的功效。因此，本研究采用醋酸貼敷法誘導大鼠肛周潰瘍模型，對肛周組織的大體觀察發(fā)現(xiàn)消痔丸可顯著加速潰瘍面的愈合，緩解紅腫和炎性滲出。微觀病理上可見大鼠肛周黏膜上皮脫落減少，局部鱗狀上皮層增厚明顯減輕，肛周組織黏膜上皮和鱗狀上皮缺損范圍較模型組明顯縮小，嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤減少，炎性滲出物，間質或黏膜下水腫和小血管擴張充血程度明顯減輕，提示消痔丸對醋酸誘導的肛門潰瘍具有明顯的改善作用。

痔病臨床癥狀多表現(xiàn)為墜脹、便血、疼痛等，這與病變黏膜炎性水腫、血管損傷密切相關，而炎癥因子和炎癥細胞對炎癥過程具有決定作用。TNFα 是致炎作用最強、產生最快的炎癥介質，一方面能夠激活細胞Ca2+內流，釋放血小板活化因子，促進血小板、淋巴細胞、白細胞黏附到腸黏膜的內皮細胞上，誘導iNOS 生成，從而產生大量NO，引起細胞損傷；另一方面TNF-α 與IFN-γ 的共同作用能夠使腸上皮細胞的屏障功能及形態(tài)結構發(fā)生改變，進而增加腸黏膜和血管壁的通透性，最終破壞腸道黏膜的完整性，形成潰瘍[13]。IL-6 通過轉錄激活因子3 途徑激活NF-κB 信號通路而誘導細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的極化表達，ICAM-1 激活信號轉導通路，介導淋巴細胞之間、淋巴細胞與靶細胞之間的黏附，進一步促進炎性細胞的浸潤，加重腸黏膜的組織損傷[14]。炎癥因子能對痔血管壁及血管內皮造成氧化損傷，被氧化損傷的血管壁又不斷產生炎癥因子，形成惡性循環(huán)[15]。另外，局部炎癥可能導致基質支架的扭曲和痔墊的滑動，也可損傷固有層的小動脈，導致排便時糜爛出血[16]。MMPs 能降解細胞外蛋白質，如彈性蛋白、纖維連接蛋白和膠原蛋白，研究發(fā)現(xiàn)IL-1、TNF-α 和脂多糖等促炎細胞因子可特異性誘導MMP-9 的上調，充分激活的MMPs 可破壞毛細血管床，增加肛墊病理性移位和出血的風險[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，消痔丸可顯著降低肛周組織中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量，提示消痔丸可通過抑制炎癥因子釋放，有效減輕局部組織炎癥水腫的發(fā)生。

正常的愈合過程是由多個細胞間信號的整合啟動，包括角質形成細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞、血小板等釋放細胞因子和趨化因子。iNOS 主要在病理狀態(tài)下由中性粒細胞、巨噬細胞產生，研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結腸炎患者炎癥黏膜上皮細胞iNOS 表達率為100%，黏膜固有層約半數(shù)炎性細胞表達iNOS[19]，能催化合成NO，而NO 是調節(jié)血液循環(huán)、血小板活性、神經傳遞、免疫和炎癥過程的關鍵因子，發(fā)揮炎性介質作用。TGF-β1 是重要炎性細胞趨化因子，可趨化成纖維細胞和炎癥細胞向傷口聚集，促進成纖維細胞大量合成膠原蛋白，促進創(chuàng)面底部小血管的內皮細胞的增生、分裂，誘導肉芽組織生長和表皮形成，研究發(fā)現(xiàn)在胃潰瘍愈合過程中，內源性TGF-β1 表達呈由弱到強的表現(xiàn)[20]。VEGF 作用于血管內皮細胞和血管，參與炎癥、損傷的修復，也是考察組織生長和創(chuàng)傷愈合的重要指標。在病理情況下，VEGF 含量增加可使毛細血管后靜脈和小靜脈的通透性增高而致使血液中的血漿蛋白、纖維蛋白、液體等外滲，導致周圍間質水腫[21]。研究發(fā)現(xiàn)，痔組織水腫、出血的風險與VEGF陽性表達的增加呈正相關[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，消痔丸可顯著降低肛周直腸組織中iNOS、VEGFA 陽性表達，升高TGF-β1 陽性表達，提示消痔丸具有抑制炎癥反應，促進潰瘍愈合的作用。

綜上所述，消痔丸通過抑制IL-6、TNF-α、MMP-9 相關細胞因子分泌和iNOS、VEGFA 蛋白表達，升高TGF-β1 表達對醋酸誘導的肛門潰瘍具有保護作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突