柚皮苷通過(guò)減輕氧化應(yīng)激降低急性肺損傷小鼠內(nèi)皮通透性的研究

楊學(xué)敏，張歡歡，宋立強(qiáng)

中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032

急性肺損傷是肺內(nèi)外因素致肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成的急性低氧性呼吸衰竭以及彌漫性肺水腫，嚴(yán)重時(shí)發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。病毒、細(xì)菌引發(fā)的肺炎，哮喘、急性期慢阻肺，或者休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷等全身性疾病都有可能引發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征[1]，如爆發(fā)的流感病毒[2]以及影響全球的新型冠狀病毒肺炎[3]，均有大量患者進(jìn)展為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征。急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征是一種發(fā)病率高、病死率高，但無(wú)特效藥物的嚴(yán)重肺部疾病。

中醫(yī)藥在治療急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)以及理論基礎(chǔ)。中草藥和天然產(chǎn)物因具有抑制肺泡炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激以及保護(hù)血管內(nèi)皮等多重療效在亞洲尤其是中國(guó)備受關(guān)注[4]。柚皮苷是存在于葡萄柚等多種橘類植物的天然黃酮類化合物。大量臨床前研究表明，柚皮苷對(duì)肺部疾病具有鎮(zhèn)咳[5]、祛痰[6]、抗炎[7]、抗肺纖維化[8]等藥理作用，對(duì)其他疾病還能夠抗氧化應(yīng)激，保護(hù)血管內(nèi)皮屏障[9]。

本研究通過(guò)建立脂多糖（LPS）滴鼻誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠模型，并給予柚皮苷ig 治療，明確柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠血管內(nèi)皮通透性及氣道炎癥的改善效果，拓展了柚皮苷防治急性肺損傷的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量22～25 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)屏障系統(tǒng)，恒溫恒濕，所有飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，使用許可證號(hào)：SYXK（陜）2019-001，實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)單位為空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心福利與倫理委員會(huì)，倫理批號(hào)：IACUC-20230096。

1.2 藥物及試劑

柚皮苷（貨號(hào)10236-47-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；醋酸地塞米松片（國(guó)藥準(zhǔn)字H12020686，規(guī)格0.75 mg/片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；LPS[貨號(hào)L2880-100MG，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號(hào)70-EK201B、70-EK206、70-EK282，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)KGP902，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；微量丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（TBA法）、總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（WST-1 法）（貨號(hào)A003-2-2、A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 定量試劑（貨號(hào)19211ES60、11121ES60、11198ES08，上海翌圣生物科技有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

RC2 氣體麻醉系統(tǒng)（美國(guó)VETEQUIP 公司）；OPT Clairvivo 小動(dòng)物近紅外深層熒光成像系統(tǒng)（日本島津制作所）；TEK8500 全自動(dòng)五分類血液分析儀（江西特康科技有限公司）；MD-M4 酶標(biāo)儀（MOLECULAR DEVICES）；5804R 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；CFX96 熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）。

1.4 動(dòng)物分組及模型建立

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松5 mg/kg 組及柚皮苷40、80、120 mg/kg 組，每組11 只小鼠。對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)；模型組和給藥組小鼠麻醉后給予LPS 滴鼻，每只小鼠滴鼻50 μL（含600 μg LPS）。柚皮苷40、80、120 mg/kg 組和地塞米松5 mg/kg 組在LPS 滴鼻前分別ig 相應(yīng)劑量的柚皮苷和地塞米松，連續(xù)給藥5 d[10]，滴鼻后繼續(xù)ig 相應(yīng)劑量的柚皮苷和地塞米松，連續(xù)給藥2 d。對(duì)照組和模型組同時(shí)間ig 0.2 mL 生理鹽水。小鼠滴鼻2 d 后，每組各取8 只小鼠眼眶取血，結(jié)扎左肺，灌洗右肺獲得肺泡灌洗液（BALF），未沖洗的肺組織一部分固定于福爾馬林，一部分-80 ℃凍存。

1.5 肺組織病理分析

肺組織固定48 h 后，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋并切成5 μm 厚度的切片。將切片溫水中展開(kāi)并轉(zhuǎn)移到載玻片上進(jìn)行脫蠟處理，依次進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，中性樹(shù)膠封片。將制好的HE 染色片，在顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理變化。

1.6 伊文思藍(lán)成像及滲出率計(jì)算

每組取3 只小鼠尾iv 5 mg/mL 伊文思藍(lán)溶液0.2 mL，30 min 后打開(kāi)小鼠胸腹腔，暴露肺臟和心臟，利用微型泵沖洗小鼠全身血液。取出全部肺臟組織，生理鹽水清洗，并吸去表面所有液體，然后用小動(dòng)物近紅外深層熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)肺部伊文思藍(lán)熒光強(qiáng)度，設(shè)定參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)658 nm，發(fā)射波長(zhǎng)719 nm，曝光時(shí)間100 ms。熒光強(qiáng)度由成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行分析。成像后，將全部肺組織完全浸泡在甲酰胺中，37 ℃放置24 h 后在620 nm 測(cè)定吸光度（A）值。

1.7 炎癥指標(biāo)檢測(cè)

將BALF 和室溫靜置0.5 h 以上的血液在1 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，BALF 上清和血清分別轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管。BALF 沉淀細(xì)胞用灌洗緩沖液重懸。BALF 上清用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。BALF 重懸液和全血用血液分析儀檢測(cè)指標(biāo)淋巴細(xì)胞（Lymph）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、白細(xì)胞（WBC）、血小板數(shù)量。

1.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

將-80℃凍存的血清室溫解凍，ELISA 試劑盒檢測(cè)一氧化氮（NO）、MDA、SOD、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平，操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 緊密連接蛋白和水通道蛋白表達(dá)檢測(cè)

取部分凍存肺組織樣品，按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)緊密連接蛋白-1（ZO-1）、密封蛋白（OCLN）、血管內(nèi)皮鈣黏素（VE-cadherin）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）以及水通道蛋白AQP1和AQP5mRNA 表達(dá)水平，所用引物見(jiàn)表1。

表1 定量引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR assays

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，各組之間兩兩比較用t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺實(shí)質(zhì)部分肺泡完整，排布均勻，肺泡壁未見(jiàn)增厚，腔內(nèi)無(wú)分泌物，極少炎性細(xì)胞；與對(duì)照組相比，模型組小鼠多處肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，泡內(nèi)充滿液體和炎癥細(xì)胞，肺泡壁增厚，具有顯著的病理變化；柚皮苷各劑量組顯著改善了肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)病變及炎癥浸潤(rùn)情況，尤其以柚皮苷120 mg/kg 組效果最佳，表明柚皮苷能夠減輕LPS 誘導(dǎo)的肺泡病理?yè)p傷，并且具有劑量相關(guān)性，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果（×100）Fig.1 HE results of lung tissues in each group（×100）

2.2 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠肺泡-血管通透性的影響

肺組織伊文思藍(lán)成像結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組熒光值顯著升高；柚皮苷各劑量組能夠顯著降低伊文思藍(lán)熒光值，并具有濃度梯度相關(guān)性，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，模型組伊文思藍(lán)滲出量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組能夠降低滲出量，且以柚皮苷120 mg/kg 組最顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 各組小鼠肺組織伊文思藍(lán)成像結(jié)果Fig.2 Evans Blue imaging results of lung tissue of mice in each group

圖3 各組小鼠肺組織伊文思藍(lán)滲出量（，n=3）Fig.3 Evans Blue exudation in lung tissue of mice in each group (,n=3)

如圖4 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量和PLT 數(shù)量顯著增加（P＜0.05），柚皮苷120 mg/kg 組總蛋白含量和PLT 數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，柚皮苷能夠顯著降低LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障高通透性。

圖4 各組小鼠BALF 中總蛋白含量和PLT 數(shù)量（，n=3）Fig.4 Total protein content and PLT quantity in BALF of mice in each group (,n=3)

2.3 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠氣道炎癥的影響

與對(duì)照組相比，模型組BALF中Lymph、NEUT、WBC 數(shù)量均顯著性增加（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組能夠不同程度地顯著減少肺泡中炎癥細(xì)胞的數(shù)量，尤其是柚皮苷120 mg/kg 組小鼠各種炎癥細(xì)胞數(shù)量最少（P＜0.05）。ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組BALF 的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；而柚皮苷各劑量組均能夠顯著減少BALF 炎癥因子含量（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，柚皮苷能夠顯著降低LPS 誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠BALF 炎癥細(xì)胞及炎癥因子變化（，n=8）Fig.5 Changes of BALF inflammatory cells and inflammatory factors in each group (,n=8)

2.4 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠血液細(xì)胞的影響

與對(duì)照組相比，模型組血液中的Lymph、NEUT、WBC、PLT 數(shù)量均顯著降低（P＜0.05）；柚皮苷120 mg/kg 組Lymph、NEUT、PLT 數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，柚皮苷120 mg/kg 組能夠顯著改善LPS 誘導(dǎo)的血液細(xì)胞流失，見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠血液炎癥細(xì)胞數(shù)變化（，n=8）Fig.6 Changes in the number of blood inflammatory cells of mice in each group (,n=8)

2.5 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清ET-1 和MDA顯著升高，NO 和SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組血清ET-1 和MDA 有所下降，NO和SOD 有所升高，柚皮苷120 mg/kg 組的生化指標(biāo)變化具有顯著性差異（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（，n=8）Fig.7 Changes of blood oxidative stress indexes in each group (,n=8)

2.6 柚皮苷對(duì)急性肺損傷小鼠內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接及水通道的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠VE-cadherin、βcatenin、ZO-1、OCLN、AQP1、AQP5mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），而柚皮苷各劑量組能不同程度升高緊密連接蛋白和水通道蛋白mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），尤其以柚皮苷120 mg/kg 組效果最明顯，見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠肺組織緊密連接蛋白和水通道蛋白mRNA 表達(dá)變化（，n=8）Fig.8 Changes of mRNA expression of tight-junction protein and aquaporin in lung tissue of mice in each group (,n=8)

3 討論

急性呼吸窘迫綜合征是臨床上發(fā)病率和致死率較高的呼吸疾病，目前多采用氧療改善低氧狀態(tài)結(jié)合控制原發(fā)疾病的方法治療，但因其發(fā)病機(jī)理的復(fù)雜性，盡管針對(duì)低氧和炎癥開(kāi)發(fā)的藥物種類眾多，仍沒(méi)有取得理想的治療效果。中草藥及其天然產(chǎn)物在治療急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中也發(fā)揮了重要作用[11]。柚皮苷是近年來(lái)研究較多的黃酮類化合物，已被證實(shí)對(duì)呼吸系統(tǒng)[12]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[13]、骨再生[14]、代謝性疾病[15]具有顯著治療效果。值得注意的是，在肺部疾病的研究中，柚皮苷具有化痰止咳、減輕炎癥反應(yīng)以及抗氧化應(yīng)激的藥理作用[12]。Liu 等[16]發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過(guò)核因子-κB（NF-κB）通路降低LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)以及TNF-α 炎癥因子實(shí)現(xiàn)抗炎效果。本研究也證實(shí)了柚皮苷能夠顯著改善急性肺損傷小鼠模型彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，減少了肺泡及氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量和炎癥因子含量，具有顯著的抗炎效果。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，使得血管內(nèi)的各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子擴(kuò)散到肺泡，并參與其中的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)積存大量富含蛋白的液體、沉積的膠原和各種炎癥細(xì)胞，包括血液來(lái)源的多核中性粒細(xì)胞、血細(xì)胞、血小板等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷模型小鼠肺組織滲入大量的伊文思藍(lán)染料，并且肺泡灌洗液中含有大量蛋白和血小板，表明LPS 能夠誘導(dǎo)小鼠肺組織肺泡-血管通透性增加。值得注意的是，急性肺損傷小鼠模型的肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著升高，而血液內(nèi)炎癥細(xì)胞大量減少，驗(yàn)證了急性肺損傷的肺泡-血管通透性增加將促使血液內(nèi)的炎癥細(xì)胞進(jìn)入氣道和肺泡。柚皮苷不僅能夠減輕伊文思藍(lán)染料滲入肺組織，同時(shí)減少肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、總蛋白含量，減緩血液內(nèi)炎癥細(xì)胞的極速流失，證實(shí)柚皮苷治療能夠顯著降低血管通透性。

血管內(nèi)皮通透性由內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成的屏障系統(tǒng)以及內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性所決定。內(nèi)皮屏障系統(tǒng)是由ZO-1、OCLN 構(gòu)成的緊密連接以及由VE-cadherin 和β-catenin 等蛋白構(gòu)成的黏合連接，最終這些蛋白聚合物再與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合[18]。水通道蛋白對(duì)肺泡-內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性具有重要的維持作用，其中AQP1 表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，AQP5 表達(dá)與肺泡I 型上皮細(xì)胞，是調(diào)控肺泡-內(nèi)皮滲透性的重要參與者[19]。在急性肺損傷狀態(tài)下，活化的中性粒細(xì)胞（PMN）、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放過(guò)量的活性氧（ROS）[20]，啟動(dòng)鈣離子信號(hào)通路調(diào)控與肌動(dòng)蛋白相連的VE-cadherin/catenin 緊密連接復(fù)合物，破壞內(nèi)皮細(xì)胞間連接[21]，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間通透性增加。此外，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征疾病狀態(tài)下水通道蛋白和離子通道蛋白表達(dá)顯著降低，致使肺泡-內(nèi)皮滲透性降低，肺泡內(nèi)大量的水分、離子、蛋白等無(wú)法無(wú)法排出，加劇急性肺損傷肺水腫等病理?yè)p傷[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)緊密連接蛋白和水通道蛋白表達(dá)水平降低，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的VE-cadherin[23]以及在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的AQP1 蛋白表達(dá)顯著降低。于此同時(shí)，LPS 引發(fā)了血管內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，表現(xiàn)為細(xì)胞氧化損傷加重和過(guò)氧化物清除水平降低，氧化/還原失衡。柚皮苷顯著提高了SOD 含量，增加過(guò)氧化物清除效率，減少了MDA 含量，減輕內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，升高了緊密連接蛋白表達(dá)，穩(wěn)定內(nèi)皮屏障系統(tǒng)，并增強(qiáng)水通道蛋白表達(dá)，減輕肺泡水腫。

柚皮苷作為多種中藥材的黃酮類藥效成分，對(duì)肺部疾病的藥效藥理有多篇臨床前報(bào)道，具有非常明確的抗炎、抗氧化作用。但柚皮苷在血管相關(guān)的疾病，包括心血管疾病、高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、骨再生、糖尿病等的血管保護(hù)作用并未延伸到肺部疾病。急性肺損傷不僅氣管、肺泡、肺間質(zhì)發(fā)生病變，血管通透性也是病理進(jìn)展的關(guān)鍵一環(huán)，因此本研究對(duì)柚皮苷降低急性肺損傷血管內(nèi)皮通透性方面的藥理作用探索具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突