膽固醇7α-羥化酶在畢赤酵母中的異源表達

趙昕 杜玉瑤 殷子揚 毛淑紅

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）又稱細胞色素P450 7A1酶，是肝臟特異性微粒體細胞色素P450家族7亞家族A成員［1］。在肝臟中，CYP7A1催化膽固醇轉化為7α-羥基膽固醇，從而促進膽汁酸的分解，CYP7A1為該反應的限速酶［2］，對維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡起到關鍵的作用，其在保障膽固醇正常攝取、運輸和轉化方面有極其重要的作用。在體內(nèi)，若膽固醇代謝異常易造成血管內(nèi)壁的膽固醇沉積，形成動脈粥樣硬化、膽結石等疾病，還可導致膽囊癌、結直腸癌等疾病的發(fā)生［3-4］。

22例攜帶GJB3基因c.538 C>T受檢者電話隨訪中，針對聽力情況特別是尖叫等高頻區(qū)域是否受損進行問詢，所有攜帶c.538的受檢者均表示聽力正常但未行耳鼻喉科專業(yè)檢查，其中包含1例c.538 C>T純合。GJB3基因c.538 C>T早期研究認為是常染色體顯性遺傳模式的高頻率聽力損失[7]，但后期對于GJB3基因變異是否致病尚存在爭議[8]，結合本次報道臨床對于GJB3基因c.538C>T的咨詢建議應謹慎。

CYP7A1依賴于氧化酶和還原酶之間特定的電子傳遞鏈進行7位羥基化反應［5］。CYP7A1電子傳遞機制如圖1，NADPH提供的兩個電子轉移到CPR的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）區(qū)域，F(xiàn)AD接受電子會引起CPR的構象變化，使FAD接近黃素單核苷酸（FMN）區(qū)域，之后FAD處的電子轉移到FMN；隨后CPR分子恢復到原來的構象，允許FMN與CYP7A1分子電荷結合位點相互作用［6-9］，然后電子流向CYP7A1的血紅素鐵區(qū)域，通過Fe=O機制介導膽固醇羥基化反應［10］，CYP7A1催化反應可表示為：NADPH+H++O2+膽固醇→NADP++H2O+7α-羥基膽固醇。

圖1 膽固醇7α-羥化酶的電子傳遞機理Fig. 1 Electron transport mechanism of cholesterol 7α-hydroxylase

7α-羥基膽固醇不僅是一種膽固醇代謝產(chǎn)物，而且對膽汁酸合成、炎癥和腫瘤等方面的治療都有重要的作用。7α-羥基膽固醇在肝臟中被轉化為膽汁酸，從而促進膽汁酸的合成和分泌［11］。此外，7α-羥基膽固醇可以減少炎性細胞浸潤，降低炎癥水平，從而起到抗炎作用［12］。最后，7α-羥基膽固醇可以抑制癌細胞的增殖和轉移，具有一定的抗腫瘤作用［13］。因此構建一株利用CYP7A1高效生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的菌株具有極大的醫(yī)學價值和工業(yè)生產(chǎn)價值。

在構建表達膽固醇7α-羥化酶的畢赤酵母基因工程菌株的基礎上，對7α-羥化酶進行理性設計與分子改造，對篩選獲得的高活性7α-羥化酶適配不同來源CPR，并在畢赤酵母中共表達，從而為7α-羥基膽固醇高效生產(chǎn)奠定基礎。

氣相色譜-質譜法（GC?MS）分析條件：升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升到270℃，保持0 min，再以2.5℃/min升到290℃，保持0 min；再以10℃/min升到310℃，保持4 min，不分流進樣，流速1 mL/min。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶（BamH I、EcoR I、Sal I和Sac I）、Goldstar best DNA聚合酶、Solution I連接酶、DNA提取純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品，膽固醇為Diamond公司產(chǎn)品，7α-羥基膽固醇為Genewiz公司產(chǎn)品。

1.2.5 膽固醇的轉化 在YPD培養(yǎng)基上選取構建成功的重組菌株的單菌落，接種到30 mL YPG培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)24 h；按培養(yǎng)基2%接種量接種到50 mL BMGY培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，30℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)18 h，轉接到BMMY培養(yǎng)基，于30℃、220 r/min的搖床繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入0.01%底物膽固醇及1%誘導劑甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，期間每24 h添加甲醇至1%的濃度。取發(fā)酵液10 mL，并加入等體積乙酸乙酯輕微振蕩萃取，離心后取上層有機相，濃縮至500 μL，使用薄層色譜（TLC）、氣相色譜-質譜法（GC?MS）及蒸發(fā)光分析產(chǎn)物的生成情況。

蒸發(fā)光檢測分析條件：流動相為純甲醇，進樣量10 μL，載氣流速2.2 mL/min，載氣溫度90℃。

只有肯在泥濘的小路上摸爬滾打，才有機會踏上鋪滿鮮花的大道。今年33歲的王振東，現(xiàn)任哈佳項目部總工程師。對于一個80后青年來說，這已經(jīng)是值得稱傲的成就了，但是踏遍工程現(xiàn)場的艱辛腳印向我們展示了他的成功當之無愧。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）的構建 以合成的CYP7A1（WT）基因為模板，通過特異性引物（表1）PCR擴增克隆出WT基因及突變基因H111A、I114A、V281A、W284A和G485A，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對以上片段和pPIC3.5K質粒進行雙酶切，切膠回收產(chǎn)物經(jīng)Solution I連接酶過夜連接，將連接的產(chǎn)物化轉至大腸桿菌E. coli JM 109，以卡那霉素抗性篩選重組轉化子并測序。得到E. coli JM 109/pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）。

表1 CYP7A1基因野生型及突變型引物Table 1 Wild-type and mutant primers of CYP7A1 gene

1.2.2 畢赤酵母/pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）菌株的構建 將測序正確的重組質粒pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）用Sal I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化；電轉至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，使用含0.5 mg/mL G418的YPD和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

1.2.3 不同來源CPR與CYP7A1共表達畢赤酵母菌株的構建 將實驗室保存的5種含不同來源CPR的質粒pPICZX?CPR用Sac I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化后電轉至含CYP7A1（WT）基因的畢赤酵母感受態(tài)細胞中；5種CPR分別為人源氧化還原蛋白（hCPR）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來源氧化還原蛋白（ScCPR）、黑曲霉（Aspergillus nige）來源氧化還原蛋白（AnCPR）、大鼠來源氧化還原蛋白（RatCPR）及羅漢果來源氧化還原蛋白（SgCPR）；使用含300 μg/mL博來霉素的YPDS和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

1.2.4 G485A與SgCPR共表達畢赤酵菌株的構建 將重組質粒pPICZX?SgCPR用Sac I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化，將線性化的質粒加入含CYP7A1（G485A）基因的畢赤酵母感受態(tài)細胞中，使用含300 μg/mL博來霉素YPDS和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

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薄層色譜分析條件：展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，用含10%濃硫酸的無水乙醇噴灑TLC板，高溫加熱顯色后，可清晰分辨膽固醇及產(chǎn)物7α-羥基膽固醇所在的位置。

師：同學們，老師覺得作者很了不起，廣玉蘭樹形比較高大，我們平時看它只看到葉子，四季常青，感到冬季給我們帶來生機。但是陳荒煤卻不這樣認為，他覺得藏在葉子里面的花更有生機。因此他著意來描寫它。一株樹上的花數(shù)世同堂，生生不息。有四種形態(tài)，其實作者也是有所側重，寫出了別人看不到，想不到的地方。你覺得他想突出哪種形態(tài)是最有生命力？

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得全長人源CYP7A1基因（GenBank: NP_000771.2），由金唯智生物技術有限公司按照畢赤酵母密碼子偏愛性進行優(yōu)化合成。質粒pPIC3.5K（含有卡那霉素抗性基因）、pPICZX（含有博來霉素抗性基因）、大腸桿菌Escherichia coli JM 109、畢赤酵母GS115均由本實驗室保存。

2 結果

2.1 重組畢赤酵母/pPIC3.5K?CYP7A1對7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

通常，根據(jù)測量方法來劃分，可以將地面三維激光掃描技術分成兩種，分別是移動式及固定式激光掃描系統(tǒng)。[2]其中，固定式激光掃描系統(tǒng)，與傳統(tǒng)測量中的全站儀是十分相似的，由內(nèi)置數(shù)碼相機、控制系統(tǒng)及激光掃描儀等多個部分組成。但是相對于全站儀來說，固定式激光掃描儀收集的是整個系列的“點云”數(shù)據(jù)信息，而不是分散的單點三維坐標，其主要特征是掃描面積大、速度較快、精準度較高以及具備良好的野外操作性。而移動式激光掃描系統(tǒng)，是以車載平臺為基礎，由慣性導航系統(tǒng)、全球定位系統(tǒng)與固定式三維激光掃描系統(tǒng)相結合而組成的。

薄層色譜定性分析結果（圖2）顯示，圖中藍色的樣品點為7α-羥基膽固醇，粉色的樣品點為膽固醇。畢赤酵母GS115即使在投底物膽固醇的情況下，也不會將膽固醇轉化為7α-羥基膽固醇，而重組菌株具有催化膽固醇生成目的產(chǎn)物7α-羥基膽固醇的能力。

ADP受體拮抗劑噻吩并吡啶抑制ADP誘導的血小板聚集和活化，通過與P2Y型特殊巰基受體結合，抑制ADP受體的激活，常用于臨床的有氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷，有關專家在相關章節(jié)已經(jīng)闡述。需要指出的是正在服用氯吡格雷患者，如準備進行CABG，除非血運重建緊急程度大于出血風險，擬行擇期冠狀動脈旁路移植術的患者，建議擇期手術前停用氯吡格雷5天～7天。

圖2 重組畢赤酵母催化膽固醇TLC結果圖Fig. 2 TLC analysis of biotransformation result of cholesterol catalyzed by recombinant P. pastoris

氣相色譜-質譜法（GC?MS）定性分析結果顯示，圖3?A為7α-羥基膽固醇標品的質譜圖，特征峰出現(xiàn)在m/z 456（分子離子峰）、129、95、73和57的位置。圖3?B為重組菌株轉化產(chǎn)物的質譜圖，特征峰與7α-羥基膽固醇標品的質譜圖的特征峰相同，證明重組菌株生成的產(chǎn)物為7α-羥基膽固醇。

圖3 重組畢赤酵母催化生成7α-羥基膽固醇的GC-MS分析圖Fig. 3 GC-MS analysis of the 7α-hydroxycholesterol catalyzed by recombinant P. pastoris

2.2 CYP7A1的分子改造對7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

將利用分子生物學改造獲得的5株突變株，進行催化膽固醇能力分析，轉化產(chǎn)物經(jīng)TLC分析（圖2）、蒸發(fā)光檢測（圖4），與野生型相比發(fā)現(xiàn)，對111、114和284位點突變后酶的活性消失，說明這些位點對CYP7A1的活性有關鍵作用。對281和485的位點突變后，CYP7A1仍然具有活性，其中281位點的纈氨酸突變?yōu)楸彼岷螅钚陨杂薪档?，為突變前?7.86%，而485位點的甘氨酸突變?yōu)楸彼岷?，活性提高，是野生型?08.71%，之后選取突變體G485A進行后續(xù)研究。

圖4 突變畢赤酵母產(chǎn)率比較圖Fig. 4 Production abilities of the mutants when compared with the wild type

2.3 不同來源CPR對重組畢赤酵母7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

將不同來源CPR與CYP7A1共表達，轉化結果如圖5所示，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR和SgCPR都能與CYP7A1適配，所獲得的重組菌株催化膽固醇的能力均有提高，其中CYP7A1與SgCPR共表達使7α-羥基膽固醇的產(chǎn)率與CYP7A1野生型菌株相比提高了82.26%，但與人源CYP7A1同源的hCPR在共表達過程中適配性沒有SgCPR顯著。突變體G485A與SgCPR共表達畢赤酵母催化膽固醇的能力顯著提高，與CYP7A1野生型菌株相比，產(chǎn)物產(chǎn)率提高了133.79%，產(chǎn)量為0.25 mg/L。

將全長的人源CYP7A1基因在畢赤酵母中進行表達，將畢赤酵母全細胞催化的發(fā)酵液進行萃取濃縮，用于薄層色譜（TLC）和氣相色譜-質譜法（GC?MS）分析，檢測后確定發(fā)酵液中含有的產(chǎn)物為7α-羥基膽固醇。

圖5 CYP7A1與不同來源CPR共表達畢赤酵母對膽固醇轉化能力的影響Fig. 5 Effects of P. pastoris co-expressed with CYP7A1 and CPR from different sources on cholesterol conversion

3 討論

目前報道的膽固醇7α-羥化酶主要是在大腸桿菌中異源表達，但CYP7A1為膜蛋白，存在純化步驟復雜、純化蛋白濃度低、不能翻譯修飾蛋白等問題。而且為了實現(xiàn)羥化酶在大腸桿菌中的高效表達，需要將N末端跨膜錨定結構域（氨基酸2-24）的氨基酸序列優(yōu)化為MAKKT［14］，并且為了在層析過程中溶解膜并保持蛋白質解聚，需要在純化過程中添加表面活性劑，如Triton X?100、Emulgen 913等［15］。不僅如此，還需要使用辛基氨基瓊脂糖4B柱和陽離子交換層析等對蛋白進行進一步純化［16］。為避免復雜的蛋白純化步驟，實驗選取畢赤酵母為表達宿主，它能識別真核基因，幫助其進行轉錄翻譯后修飾，并且可以通過高密度發(fā)酵提高CYP7A1表達量和催化效率［17］。

3.1 突變體提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量的分析

目前對CYP7A1分子對接的研究主要集中在酶活性位點［18］，而實驗是通過Discovery studio軟件的半柔性分子對接抓取與膽固醇小分子作用關鍵蛋白質位點，定點突變?yōu)楸彼帷８鶕?jù)對接結果（圖6），選取5個位點定點突變?yōu)楸彼?，分別得到H111A、I114A、V281A、W284A和G485A突變體，這些位點存在于CYP7A1活性口袋附近，主要作用力為疏水作用力以及氫鍵相互作用，疏水作用可以維持活性中心空間結構的穩(wěn)定性。對111、114及284位點突變后酶的活性消失，說明這些位點對CYP7A1的活性有關鍵作用，這些位點突變后可能改變了傳遞電子的能力或改變結合口袋的結構等。對281及485突變后催化活性變低或變高，可能是由于氨基酸極性不同導致的活性不同，氨基酸可分為親水氨基酸和疏水氨基酸，親水氨基酸對水分子具有一定的親和性，疏水氨基酸對脂溶性物質的親和性更高。由于膽固醇為非極性分子，根據(jù)“相似相溶”的性質，較容易與疏水氨基酸相互作用。實驗中涉及的氨基酸極性從大到小的順序為：His＞Trp＞Gly＞Ala＞Val＞Ile，突變體485位點甘氨酸突變?yōu)闃O性更小的丙氨酸后，與膽固醇形成的疏水鍵的作用力更強，催化活性提高；突變體281位點纈氨酸突變?yōu)闃O性更大丙氨酸后，與膽固醇形成的疏水鍵的作用力減弱，催化活性降低；其次也可能是由于突變位點距離膽固醇C?7位距離的不同導致活性不同，突變位點與膽固醇分子對接位置如圖7所示。281位點與膽固醇C?17位上的側鏈相連，與C?7位距離較遠，而485位點與A環(huán)相連，與C?7位距離較近，改變485位點氨基酸的大小對催化C?7羥基化有較大的影響。綜上所述281和485位點可以作為改造位點，將其突變?yōu)楦邮杷陌被峄蚋淖?85位點氨基酸的大小會對酶與底物結合有進一步影響。

圖6 CYP7A1與膽固醇分子對接結果圖Fig. 6 Docking results of CYP7A1 and cholesterol molecules

圖7 CYP7A1與膽固醇分子對接結果的二維平面圖Fig. 7 2D floor plan of docking results of CYP7A1 and cholesterol molecules

3.2 CYP7A1（WT/突變型）與CPR適配提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量的分析

畢赤酵母為真核表達系統(tǒng)，自身含有CPR可幫助CYP7A1轉移電子，但通過異源表達不同來源的CPR可增加產(chǎn)物7α-羥基膽固醇的產(chǎn)量。實驗表明，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR和SgCPR與CYP7A1共表達菌株催化膽固醇的能力均有提高，并且SgCPR與G485A適配后催化能力更加顯著。雖然CPR的過表達能夠增強CYP7A1在畢赤酵母的羥基化水平，但并不是與CYP7A1基因同源的人源CPR與其適配性最好，可能是由于CYP?CPR相互作用時，不同CPR中的FMN結構域附近特定殘基組成不同導致的，F(xiàn)MN區(qū)域正電荷氨基酸數(shù)量顯著影響其相互作用［19］。

既然幼兒園里吃到的水產(chǎn)品不足，那么家里就要每周至少吃一次水產(chǎn)品了。當然為了安全起見，應給孩子吃刺少的魚比如龍利魚、鱈魚、桂魚。這里特別要注意一類海魚（如金槍魚、沙丁魚、三文魚），青皮紅肉，富含歐米伽3脂肪酸和蝦青素，是適合全家人的健康食品，但是這類魚同時富含組氨酸，如果加熱時間不夠長或者不新鮮都可能造成組胺中毒。所以，吃這類魚一定要選新鮮的，然后充分加熱。當然還可以吃蝦，建議把蝦去頭之后再做，因為重金屬都蓄積在蝦頭中。

因此在畢赤酵母中異源表達其他CYP450時，可添加外源CPR提高轉化率。根據(jù)相關文獻報道，CYP450與CPR相互作用中存在著一定的比例，選取合適的比例可以大大提高酶的催化活性［20］，因此進一步實驗可以通過CYP7A1適配不同濃度SgCPR，提高CYP7A1的轉化能力。

3.3 重組畢赤酵母中生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的分析

重組畢赤酵母生產(chǎn)7α-羥基膽固醇，是通過膽固醇7α-羥化酶在畢赤酵母異源表達的催化膽固醇實現(xiàn)的，其難點在于7α-羥基膽固醇的產(chǎn)量很低，只有產(chǎn)物濃度濃縮10-20倍才可用儀器檢測到，因此并不是酶沒有表達，而是產(chǎn)物濃度低到難以用蒸發(fā)光等儀器發(fā)現(xiàn)。并且膽固醇為脂溶性物質，難于進入細胞進行催化反應，即使在助溶劑的幫助下其溶解度也很低，因此找到膽固醇進入細胞的更有效辦法，可顯著提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量。

4 結論

構建CYP7A1異源表達平臺并對其轉化膽固醇能力進行研究，獲得全細胞催化膽固醇生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的重組畢赤酵母菌株，通過定點突變及適配不同來源CPR進一步提高了7α-羥基膽固醇產(chǎn)量。實驗為7α-羥基膽固醇的高效生產(chǎn)奠定了良好的基礎，也為CYP450的高效表達提供了有效方法。