灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究

楊敏 龍雨青 曾娟 曾梅 周新茹 王玲 付學(xué)森 周日寶，2，3劉湘丹，2，3

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208；2. 湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室，長(zhǎng)沙 410208；3 湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208）

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.?Mazz.為中藥材山銀花的主要來(lái)源品種之一［1］，主要以干燥花蕾或者初開的花入藥，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒之功效，用于風(fēng)熱感冒、癰腫疔瘡、溫病發(fā)熱、熱毒血痢等癥狀［2］?；覛置潭啾粦?yīng)用于醫(yī)藥、園藝、化妝品［3］等行業(yè)，還可以作為抗氧化劑的提取來(lái)源［4］，具有巨大的藥用、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)價(jià)值。

皂苷類為灰氈毛忍冬中重要化學(xué)成分之一，主要包括灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲［5］，現(xiàn)代藥理研究表明，該類成分具有保肝、抗癌、抗氧化、抗補(bǔ)體活性等作用［6-10］?；覛置潭碥諏儆邶R墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，其生物合成途徑包括上游前體物質(zhì)3?異戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成，中游氧化鯊烯環(huán)化酶（OSCs）催化的碳環(huán)骨架的合成，下游細(xì)胞色素P450酶（CYP450s）氧化和糖基化反應(yīng)生成各種植物三萜皂苷［11-12］。糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）是能夠催化糖基化反應(yīng)的一大類酶，在生物體內(nèi)以超基因家族的形式存在，其能使糖基和天然產(chǎn)物之間形成特定的糖苷鍵來(lái)合成糖苷類化合物，根據(jù)已收集的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy，http://www.cazy.org/）及GTs氨基酸序列，將GTs分為114個(gè)家族［13］，目前發(fā)現(xiàn)的催化植物天然產(chǎn)物糖基化的酶常以尿苷二磷酸-糖為糖基供體，被稱為尿苷二磷酸依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）［14］。在山芥［15］、姜狀三七［16］、甘草［17］、大豆［18］、苜蓿［19］等植物中已經(jīng)分離出參與齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷生物合成途徑的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶基因，目前未見灰氈毛忍冬皂苷相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶報(bào)道。

相關(guān)研究表明灰氈毛忍冬不同部位皂苷含量存在較大差異，花蕾的皂苷含量較高，較葉和莖中的皂苷含量高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)［5］，且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬花蕾不同發(fā)育階段皂苷含量存在差異?；诖?，項(xiàng)目組對(duì)灰氈毛忍冬進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到2個(gè)差異顯著的皂苷合成關(guān)鍵酶UGTs基因（UGTPg17、UGTPg36），其編號(hào)為DN53278_c0_g1（log2 Ratio：8.023 762 531）及DN45149_c0_g2（log2 Ratio：8.888 548 674）。利用RT?PCR克隆得到2個(gè)UGTs基因并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行特征解析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因在不同花期表達(dá)模式，HPLC法測(cè)定各個(gè)花期皂苷含量，并對(duì)表達(dá)量和皂苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析以探索UGTPg17及UGTPg36基因功能。

1 材料與方法

1.1 材料

灰氈毛忍冬樣品采于湖南省隆回縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.?Mazz.）樣品，根據(jù)課題組前期分期依據(jù)，將灰氈毛忍冬分為7個(gè)不同花期［20］，即花蕾初期（花期1）、青綠色花期（花期2）、綠白色花蕾期（花期3）、白色花蕾期（花期4）、白色開花期（花期5）、金黃色開花期（花期6）、枯萎期（花期7），其中花期4、花期5為藥典規(guī)定山銀花樣品（圖1）［21］。部分樣品用密封袋裝好，液氮速凍后保存于?80℃冰箱，用于提取RNA。部分樣品烘干后儲(chǔ)存，用于皂苷含量測(cè)定。

圖1 灰氈毛忍冬不同花期樣品Fig. 1 Flower samples at different flowering stages of L. macranthoides

灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品（17021504，純度≥97%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司），灰氈毛忍冬皂苷甲對(duì)照品（18120403，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司），川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品（20072004，純度≥99%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。本實(shí)驗(yàn)所用其他試劑見表1，基因克隆、熒光定量PCR等引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，濃度均稀釋至10 μmol/L，具體引物序列見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑Table 1 Reagents for experiment

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 灰氈毛忍冬各組織總RNA提取及cDNA的獲得 分別取灰氈毛忍冬各花期樣品適量，于研缽中加液氮研磨充分，利用多糖多酚試劑盒法（BiospinPlant Total RNA Extraction Kit）分別提取各花期總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的完整性和純度。選取高質(zhì)量的RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)賽默飛）說(shuō)明書，逆轉(zhuǎn)錄合成灰氈毛忍冬各花期cDNA。

1.2.2 UGTPg17、UGTPg36基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)灰氈毛忍冬花、葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Unigene序列，通過(guò)NCBI比對(duì)確定ORF區(qū)域，根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)特異性克隆引物（表2）。

1.2.3 目的片段的克隆、回收及測(cè)序 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL PCR反應(yīng)體系包括：2×Pfu MasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，UGTPg17?F 1 μL，UGTPg17?R 1 μL，cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)反應(yīng)40次；最后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的條帶經(jīng)膠回收試劑盒回收純化（北京擎科），回收產(chǎn)物連接pEASY??T1 Cloning Vector克隆載體后轉(zhuǎn)化TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp，IPTG，X?gal的固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定后選取陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng)，次日送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 UGTPg17、UGTPg36生物信息學(xué)分析 通過(guò)在線軟件（表3）對(duì)UGTPg17、UGTPg36蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析；將氨基酸序列上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp比對(duì)，篩選出同源性相對(duì)較高的物種，導(dǎo)入DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析；利用MEGA 7.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表3 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Table 3 Websites on bioinformatics analysis

1.2.5 UGTPg17、UGTPg36基因不同花期表達(dá)量分析 根據(jù)灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因序列，設(shè)計(jì)適用于熒光定量PCR的特異性引物（表2）。以18S基因?yàn)閮?nèi)參［22］，設(shè)計(jì)引物18S?F和18S?R。將提取的灰氈毛忍冬各花期的總RNA定量至相同濃度（約90 ng/μL），逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Bio?Rad CFX96進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×TransStart?Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，超純水8.2 μL。擴(kuò)增程序（全式金兩步法）為50℃ 2 min，94℃預(yù)變性10min；94℃變性5 s，55℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)完成后以2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 灰氈毛忍冬皂苷含量測(cè)定

1.2.6.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品適量，用70%甲醇溶解制得濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，密封，制得對(duì)照品溶液，在“1.2.6.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.6.2 供試品溶液制備 分別取過(guò)60目篩的灰氈毛忍冬不同花期樣品約0.1 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，稱量，超聲提取30 min后取出冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，制得樣品溶液，在“1.2.6.3”項(xiàng)色譜條件下每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

1.2.6.3 色譜條件 采用Agilent Technologies 1260 Infinity液相儀，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A），0.4%磷酸水（B），進(jìn)行梯度洗脫（0-15 min，90%B；15-17 min，90%-88% B；17-20 min，88%-84.6% B；20?22 min，84.6%-78.6% B；22-34 min，78.6%-78.2% B；34-40 min，78.2%-70% B）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃［23］。

1.2.7 灰氈毛忍冬UGT基因表達(dá)量與皂苷含量相關(guān)性分析 分別將灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達(dá)量與皂苷含量峰面積導(dǎo)入SPSS 23數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)兩者進(jìn)行Pear?son相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取

灰氈毛忍冬不同花期的總RNA瓊脂糖凝膠電泳見圖2，可見28S和18S條帶明顯，說(shuō)明RNA完整性較好，A260/A280值在1.8-2.0，A260/A230值大于2.0，RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 灰氈毛忍冬各花期總RNA提取Fig. 2 Extraction of total RNA from the L macranthoides in different flowering stages

2.2 UGTPg17、UGTPg36基因的克隆

RT?PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3，分別在約1 400 bp、1 450 bp處有1條清晰條帶，條帶長(zhǎng)度符合UGTPg17、UGTPg36基因編碼區(qū)開放閱讀框大小，故推測(cè)成功擴(kuò)增相關(guān)目的基因。通過(guò)DNAMAN比對(duì)，測(cè)序所得的序列與Unigene模板序列匹配。

圖3 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36 PCR產(chǎn)物Fig. 3 PCR product of UGTPg17 and UGTPg36 gene cloned from L. macranthoides

2.3 UGTPg17、UGTPg36生物信息學(xué)分析

2.3.1 UGTPg17、UGTPg36基因序列分析 根據(jù)NCBI與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果，將獲得的灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因進(jìn)行命名并將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得基因登錄號(hào)為L(zhǎng)m?UGTPg17（GenBank：OP326755），Lm?UGTPg36（GenBank：OP331224）。Lm?UGTPg17，Lm?UGTPg36基因ORF全長(zhǎng)分別為1 410 bp、1 428 bp，分別編碼469、475個(gè)氨基酸。

2.3.2 UGTPg17、UGTPg36蛋白理化性質(zhì) 利用ExPASy Protparam在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白基本理化性質(zhì)，推測(cè)灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36相對(duì)分子質(zhì)量分別為52.66 kD，53.47 kD；蛋白分子式分別為C2393H3692N622O688S15、C2400H3720N684O687S10。LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白不穩(wěn)定系數(shù)＞40，推測(cè)其均屬于不穩(wěn)定蛋白。NetOGly 4.0分析推測(cè)LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白分別包含4個(gè)、7個(gè)糖基化位點(diǎn)。ProtScale在線預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性，結(jié)果顯示LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白平均疏水指數(shù)（GRAVY）分別為?0.161、?0.244（負(fù)值），推測(cè)LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白為親水性蛋白。通過(guò)在線軟件WOLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明LmUGTPg17蛋白定位于葉綠體（chloroplast）中定位系數(shù)為6，LmUGTPg36蛋白定位于細(xì)胞核（nucleus）中定位系數(shù)為7。Signal P 4.1 Server 軟件預(yù)測(cè)可知LmUGTPg17蛋白平均S值＞0.5，推測(cè)其可能含有信號(hào)肽，LmUGTPg36蛋白平均S值＜0.5，推測(cè)其不存在含信號(hào)肽序列。運(yùn)用在線軟件TMHMM2.0分析LmUGTPg17、LmUGTPg36編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)表明，兩者均不具跨膜區(qū)域且均在膜外。

2.3.3 UGTPg17、UGTPg36蛋白結(jié)構(gòu)域和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)NCBI網(wǎng)站CD?Search在線工具分析灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4。LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白均屬于Glycosyltransferase_GTB?type、Yjic超基因家族成員，均包含GT1_Gtf?like特殊結(jié)構(gòu)域。

圖4 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 4 Domain prediction of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）proteins

通過(guò)SOPMA在線預(yù)測(cè)灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5，LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白中α螺旋（alpha helix）分別占34.62%和42.53%，無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）分別占44.87%和38.32%，β轉(zhuǎn)角（beta turn）分別占6.41%和5.26%，延伸鏈（extended strand）分別占14.10%和13.89%。無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋為灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)組成元件。通過(guò)SWISS?MODEL軟件，在線預(yù)測(cè)得到灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。

圖5 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 5 Secondary structure of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）proteins

圖6 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 6 Prediction of tertiary structure of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）protein

2.3.4 UGTPg17、UGTPg36氨基酸序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用NCBI中的BlastP對(duì)LmUGTPg17、LmUGTPg36氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，下載同源性較高的幾個(gè)物種的氨基酸序列。UGTPg17蛋白與人參Panax ginseng、伊德斯種咖啡Coffea eugenioides、萵苣Lactuca sativa、茶Camellia sinensis、向日葵Helianthus annuus、小飛蓬Erigeron canadensis、紫花風(fēng)鈴木Handroanthus impetiginosus、黃花蒿Artemisia annua、獨(dú)腳金Striga asiatica、獨(dú)腳金屬雜草Striga hermonthica等同源性達(dá)59.21%-67.89%。運(yùn)用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，顯示LmUGTPg17與其他物種UGTPg17氨基酸序列總相似度達(dá)69.96%，比對(duì)結(jié)果如圖7。UGTPg36蛋白與山梨獼猴桃Actinidia rufa、人參Panax ginseng、紫花風(fēng)鈴木Handroanthus impetiginosus等同源性達(dá)59.74%-60.59%。運(yùn)用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，顯示LmUGTPg36與其他物種UGTPg36氨基酸序列總相似度達(dá)71.31%，比對(duì)結(jié)果如圖8。

圖7 LmUGTPg17蛋白與多種植物UGT蛋白序列比對(duì)Fig. 7 Multiple sequences alignment of LmUGTPg17 with UGT protein of other plants

圖8 LmUGTPg36蛋白與多種植物UGT蛋白序列比對(duì)Fig. 8 Multiple sequences alignment of LmUGTPg36 with UGT protein of other plants

利用MEGA7.0.21構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白與其他植物UGT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖9，系統(tǒng)進(jìn)化樹聚為兩大分支，灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36均與人參Panax ginseng同源性最高。

圖9 LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白與多種植物UGT家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 9 Phylogenetic tree of LmUGTPg17 and LmUGTPg36 with UGT protein from other plants

2.4 UGTPg17、UGTPg36基因在不同花期特異性表達(dá)

用RT?qPCR檢測(cè)UGTPg17、UGTPg36基因在灰氈毛忍冬不同花期中表達(dá)情況（圖10），結(jié)果表明兩個(gè)基因在7個(gè)花期中均有表達(dá)且趨勢(shì)相似，在前3個(gè)花期中表達(dá)量相對(duì)低，在后4個(gè)花期中表達(dá)量較高，UGTPg17基因在后4個(gè)花期的表達(dá)量均較UGTPg36基因表達(dá)量高出2倍以上。

圖10 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）基因在不同花期中表達(dá)模式Fig. 10 Expression patterns of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）in different flowering stages of L. macranthoides

2.5 灰氈毛忍冬皂苷含量測(cè)定

對(duì)灰氈毛忍冬不同花期灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲進(jìn)行含量測(cè)定，色譜圖中3種皂苷色譜峰與其他色譜峰分離度良好（圖11）?；覛置潭煌ㄆ谠碥蘸孔兓厔?shì)見圖12，灰氈毛忍冬中皂苷類成分以灰氈毛忍冬皂苷乙為主，不同花期中3種皂苷含量高低順序?yàn)椋夯覛置潭碥找遥敬ɡm(xù)斷皂苷乙＞灰氈毛忍冬皂苷甲，各花期間總皂苷含量差異較小，整體表現(xiàn)為前3個(gè)花期總皂苷含量相對(duì)較高，后4個(gè)花期總皂苷含量相對(duì)較低。

圖11 對(duì)照品溶液（A）和灰氈毛忍冬樣品溶液（B）的 HPLC圖譜Fig. 11 HPLC profiles of reference substance（A）and L. macranthoides sample solution（B）

圖12 灰氈毛忍冬不同花期皂苷含量趨勢(shì)Fig. 12 Trend of saponins at different flowering stages of L. macranthoides

2.6 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達(dá)量與不同花期總皂苷含量相關(guān)性分析

灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達(dá)量與不同花期皂苷含量做相關(guān)性分析（表4），UGTPg17、UGTPg36基因表達(dá)量與灰氈毛忍冬皂苷乙、總皂苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙含量呈負(fù)相關(guān)，即基因表達(dá)量增加時(shí)皂苷含量下降，基因表達(dá)量減少時(shí)皂苷含量增加。

表4 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達(dá)量與皂苷含量相關(guān)性法分析Table 4 Correlation analysis between the gene expression of UGTPg17 and UGTPg36 and the content of saponins of L. macranthoides

3 討論

皂苷類化合物是許多藥用植物的藥效成分，隨著皂苷類化合物在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)的廣泛使用，其生物合成途徑也在不斷進(jìn)行研究，參與皂苷生物合成的關(guān)鍵酶包括氧化鯊烯環(huán)化酶（OSCs）、細(xì)胞色素P450（CYP450s）及糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs），其中UGTs催化的糖基化反應(yīng)通常被認(rèn)為是皂苷生物合成的最后一步，是皂苷多樣性和生物活性形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［24-25］，因此對(duì)UGTs基因的研究在探索灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑中具有重要意義。

UGTPg基因主要?dú)w屬于UGT71、UGT74、UGT94家族，在人參皂苷生物合成途徑研究中較為廣泛，例如從人參中克隆得到的UGTPg45具有糖基化原人參二醇C3?OH的作用，UGTPg1能夠糖基化C20?OH［24］；后續(xù)在人參中分離出的UGTPg100和UGTPg101，前者可催化原人參三醇的C6?OH糖基化生成人參皂苷Rh1，后者可催化原人參三醇的C20?OH糖基化生成人參皂苷F1，再進(jìn)一步催化C6?OH糖基化生成人參皂苷Rg1［25］。在對(duì)催化糖鏈延長(zhǎng)的UGTs的研究中發(fā)現(xiàn)，UGTPg29具有延長(zhǎng)C3?糖鏈的作用［24］；UGTPg71A29能夠延長(zhǎng)人參皂苷Rd的C20?糖鏈［26］；PgUGT94Q15能夠延長(zhǎng)人參皂苷Rh2的C3?糖鏈生成Rg3以及延長(zhǎng)人參皂苷F2C3?糖鏈生成Rd，PgUGT94Q15?V1延長(zhǎng)金盞花苷E（calenduloside E）的C3?糖鏈生成姜狀三七皂苷R1（zingibroside R1），且這兩個(gè)基因均能延長(zhǎng)3?O-β-Glc齊墩果酸（3GOA）的C3?糖鏈生成3?O?［β-D?吡喃葡萄糖?（1→2）-β-D?吡喃葡萄糖］?齊墩果酸［27］。為進(jìn)一步研究UGTPg17、UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑中的作用，通過(guò)NCBI下載山芥、苜蓿、姜狀三七、竹節(jié)參中已報(bào)道的參與齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物糖基化作用的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，與本研究克隆所得Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬中UGTPg17、UGTPg36基因與已報(bào)道的17條UGTs基因總同源性為61.43%，表明本研究克隆所得基因可能參與灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑，發(fā)揮類似的糖基化作用。

在植物中皂苷生物合成為多基因及多物質(zhì)共同調(diào)控的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探索Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷合成途徑中的具體功能奠定研究基礎(chǔ)，后續(xù)將通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將克隆所得Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因分別轉(zhuǎn)化至灰氈毛忍冬愈傷組織中，培養(yǎng)鑒定得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行HPLC?MS檢測(cè)，分析Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑具體功能。

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因，其編碼蛋白LmUGTPg17包含4個(gè)糖基化位點(diǎn)，LmUGTPg36包含7個(gè)糖基化位點(diǎn)，均屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白，不具跨膜區(qū)域；UGTPg36蛋白不存在信號(hào)肽序列，UGTPg17蛋白可能含有信號(hào)肽；進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白均與人參親緣關(guān)系最近。通過(guò)分析不同花期基因表達(dá)量與皂苷含相關(guān)性得出，Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因與灰氈毛忍冬總皂苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)2個(gè)UGTs基因均與灰氈毛忍冬皂苷合成密切相關(guān)。