幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物病蟲害生物防治中的研究進展

馬賽買 李同源 馬燕軍 韓富軍 彭海 孔維寶

（1. 西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070; 2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院林果花卉研究所，蘭州 730070）

隨著農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)和模式的不斷變化，其受到病蟲害威脅的情況也愈發(fā)嚴重。病蟲害對農(nóng)作物的品質(zhì)、產(chǎn)量和安全造成了嚴重影響，進而直接影響著我國的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人民的生活物資保障及食品安全。一方面，一些作物害蟲如麥種蠅、草地貪夜蛾等，植物病害如土傳病害、根腐病害等已經(jīng)嚴重危害農(nóng)作物的生產(chǎn)［1-4］。例如，由煙粉虱通過傳播病毒引起番茄卷曲病及致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的番茄晚疫病導(dǎo)致番茄的產(chǎn)量下降了20%-100%［5-6］；植物寄生線蟲已對全球農(nóng)業(yè)造成嚴重危害，其通過破壞種類繁多的農(nóng)作物、水果和蔬菜來影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［7-8］；根結(jié)線蟲每年會導(dǎo)致韓國番茄產(chǎn)量有30%-40%的損失，已成為該國番茄生產(chǎn)的主要問題［9］。由鐮刀菌屬（Fusarium）和絲囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆土傳病害根腐病，導(dǎo)致豌豆的生產(chǎn)面積下降［10］；干腐病是馬鈴薯貯藏期間最嚴重的病害，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和燕麥鐮刀菌（F. avenaceum）是引起干腐病的主要病原菌，其造成的馬鈴薯減產(chǎn)嚴重時可達60%［11］；鐮孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum）引起的紅腐病是影響甘蔗生產(chǎn)的一種嚴重秸稈病害［12］；土傳真菌Stromatinia cepivora引起的白腐病對洋蔥和大蒜作物生產(chǎn)造成嚴重危害［13］。另一方面，化學農(nóng)藥一般被認為是抑制病蟲害的可靠選擇，但是過量使用化學農(nóng)藥會導(dǎo)致土壤和水體的污染，也會直接或間接地危害人體健康［14］。研究顯示人體長期暴露于亞致死量的化學殺蟲劑下，會導(dǎo)致一些慢性病的發(fā)生，如癌癥，生殖、腎臟和呼吸系統(tǒng)疾病等［15］。

生物防治是一種直接利用有益微生物或微生物代謝產(chǎn)物來防治有害生物的方法，因其對人畜安全、不污染環(huán)境且防治病蟲害效果顯著、持久等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注［16-18］。生物防治可以利用天敵控制病蟲害，包括以蟲治蟲即利用天敵昆蟲來防治害蟲，如肉食性瓢蟲捕食蚜蟲；也包括以菌治蟲即利用真菌（如金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae）、細菌（如蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis）和病毒（如核型多角體病毒NPV、顆粒體病毒GV、細小病毒CPV）及其代謝產(chǎn)物防治害蟲；同時還可以以菌（拮抗菌）治病，如利用枯草芽孢桿菌（B. subtilis）產(chǎn)生的枯草菌素防治灰霉病。由于對環(huán)境友好型產(chǎn)品的需求日益增長，生物源殺蟲劑、殺菌劑以及植物保護劑等已被廣泛應(yīng)用，以減少對化學農(nóng)藥的使用，減輕對環(huán)境和人畜的直接和潛在危害［19-23］。

幾丁質(zhì)（chitin）是一種僅次于纖維素的第二大多糖，廣泛分布于真菌細胞壁、節(jié)肢動物角質(zhì)層、圍食膜以及軟體動物殼中［24］。幾丁質(zhì)酶（chitinase）是一種廣泛分布于古菌、細菌、真菌、高等植物及動物中的糖苷水解酶，對含有幾丁質(zhì)的真菌、昆蟲及其幼蟲等病原體的生長和發(fā)育具有抑制作用［14］，同時也能夠水解天然高聚物，如幾丁質(zhì)、殼聚糖、脂質(zhì)寡糖、肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和含有N?乙酰葡糖胺的糖蛋白［25］。幾丁質(zhì)在多種植物病原體細胞中的廣泛分布提示我們幾丁質(zhì)酶在病蟲害綜合防控中有可能作為有潛力的生物殺蟲和殺菌劑，而且目前的研究也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶可同時防治有害昆蟲、真菌和線蟲［26-28］。本文總結(jié)了幾丁質(zhì)酶的分類、來源及其應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害防治的生防機理和策略等，以期為幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物病蟲害生物防治中的研究和應(yīng)用開發(fā)提供有價值的信息參考。

1 幾丁質(zhì)酶的分類

根據(jù)作用方式不同，幾丁質(zhì)酶可分為內(nèi)切酶（endochiyinases，E.C 3.2.1.14）和外切酶（exochitinases，EC 3.2.1.52），其中幾丁質(zhì)外切酶可以分為幾丁質(zhì)水解酶（E.C 3.2.1.29）和β-1,4?葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.30）。幾丁質(zhì)內(nèi)切酶隨機裂解幾丁質(zhì)鏈內(nèi)部，生成具有可溶性且分子量低的N?乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）多聚體，如幾丁四糖、幾丁三糖、幾丁二糖；幾丁質(zhì)外切酶催化幾丁質(zhì)鏈的非還原端，可連續(xù)去除GlcNAc單體［29］。

根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的類型，幾丁質(zhì)酶可分為兩大類糖基水解酶（glycosyl hydrolases，GH）家族，即GH18和GH19家族。GH18家族的幾丁質(zhì)酶具有典型的（β/α）8磷酸丙糖異構(gòu)酶桶狀折疊結(jié)構(gòu)，其催化結(jié)構(gòu)域具有［DN］G［LIVMF］［DN］［LIVMF］［DN］xE、Y［DN］和SxGG等高度保守區(qū)域。前兩個區(qū)域參與底物輔助催化機制，第3個區(qū)域參與底物結(jié)合［30-31］。GH19家族的幾丁質(zhì)酶富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，采用單置換催化機制，并以保守區(qū)域［FHY］GRG［AP］xQ［IL］［ST］［FHYW］［HN］［FY］NY和L（x）9LV（x）12W［FY］W為表征，形成底物結(jié)合區(qū)［32］。

根據(jù)幾丁質(zhì)酶在基因序列、氨基酸組成和保守基序分布的差異，可將其分為五類。I類、II類和IV類幾丁質(zhì)酶含有GH19結(jié)構(gòu)域作為催化結(jié)構(gòu)域，GH18結(jié)構(gòu)域存在于III類和V類幾丁質(zhì)酶中［33-34］。I類和IV類幾丁質(zhì)酶在N端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的存在下結(jié)構(gòu)相似，但IV類幾丁質(zhì)酶由于缺失這兩個結(jié)構(gòu)域而導(dǎo)致長度較短。I類和II類幾丁質(zhì)酶具有序列同源性，但II類幾丁質(zhì)酶缺乏N端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，III類和V類幾丁質(zhì)酶中也不存在幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。III類幾丁質(zhì)酶具有溶菌酶活性，其特征是存在C端延伸［35］。III類和V類幾丁質(zhì)酶廣泛分布于真菌、病毒和高等植物中，I類、II類和IV類幾丁質(zhì)酶大多來自細菌，有少數(shù)也存在于高等植物中［25］。

2 幾丁質(zhì)酶的來源

幾丁質(zhì)酶來源廣泛，主要包括細菌、真菌、病毒和植物，另外，基于特殊環(huán)境的宏基因組來源的幾丁質(zhì)酶也受到廣泛關(guān)注。附表1總結(jié)了幾丁質(zhì)酶的來源、催化特性、生化特征及生防信息。

2.1 細菌幾丁質(zhì)酶

大多數(shù)細菌幾丁質(zhì)酶屬于GH18家族，但放線菌（Actinomycetes）和紫細菌（purple bacteria）中一些幾丁質(zhì)酶屬于GH19家族，隸屬于上述兩個家族的酶在序列、三維結(jié)構(gòu)和催化機制方面有一定的差異［29,31］。細菌幾丁質(zhì)酶的GH18家族根據(jù)其催化域的結(jié)構(gòu)相似性進一步分為A、B、C三個亞族［31］。B亞族和C亞族僅在少數(shù)細菌中被發(fā)現(xiàn)，但A亞族的成員在自然界中分布廣泛［36-37］。后者的特征是存在幾丁質(zhì)插入結(jié)構(gòu)域，它是一個存在于磷酸丙糖異構(gòu)酶桶中的小α+β結(jié)構(gòu)域，有助于結(jié)合長鏈底物及提高酶的加工能力［31,38］。

迄今為止，大多數(shù)細菌幾丁質(zhì)酶都來自于水生和陸生生境中可培養(yǎng)的幾丁質(zhì)降解微生物，這些微生物從含有幾丁質(zhì)底物（膠體幾丁質(zhì)）的固體培養(yǎng)基中分離出來［39］，然后在同源宿主菌中對酶基因進行克隆、表達、純化后再做表征［40］，一般優(yōu)選大腸桿菌（Escherichia coli）作為宿主［41］。在革蘭氏陰性菌中，黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）被認為是降解幾丁質(zhì)的有效菌之一，并被用作研究幾丁質(zhì)酶作用機理的模式菌株［38］。S. marcescens的幾丁質(zhì)酶降解機制包括屬于GH18家族的幾丁質(zhì)酶ChiA、ChiB、ChiC和ChiD（圖1）［38］，以及屬于GH20家族的裂解多糖單加氧酶CBP21和β-己糖胺酶［38,42］。在一些細菌中，如豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae），其幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的復(fù)雜性更大，因為不同的幾丁質(zhì)酶可以通過不同的轉(zhuǎn)錄模式從同一基因產(chǎn)生［43］。楊紹青團隊克隆了來自Paenibacillus xylanexedens Z2?4 的幾丁質(zhì)酶基因PxChi52，并在E.coli中進行了表達，該PxChi52酶對灰霉菌（Botrytis cinerea）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）及蘋果腐爛病菌（Valsa mali）有很強的抗菌活性，可抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）的菌絲生長［44］。

圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌18家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)概述Fig. 1 Structural overview of the family 18 chitinases of S. marcescens

2.2 真菌幾丁質(zhì)酶

真菌幾丁質(zhì)酶大多屬于GH18家族，但來自家蠶微孢子蟲的幾丁質(zhì)酶NbChiA屬于GH19家族。NbchiA總共包含9個α螺旋（圖2?A），在其分子表面有一個深的裂隙，可能在底物結(jié)合中起作用［45］（圖2?B）。GH18家族的真菌幾丁質(zhì)酶根據(jù)其序列相似性、底物結(jié)合裂縫結(jié)構(gòu)和酶活性分為A、B和C亞族［46］。但真菌GH18家族幾丁質(zhì)酶的亞群與細菌GH18家族幾丁質(zhì)酶的亞族并非對應(yīng)關(guān)系。與細菌一樣，真菌幾丁質(zhì)酶也可能具有多種結(jié)構(gòu)域［30］。

圖2 NbchiA的三維模型Fig. 2 Three-dimensional model of NbchiA

幾丁質(zhì)酶在調(diào)節(jié)真菌細胞分裂、生長和形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮著主要作用。所有真菌中都具有幾種不同的幾丁質(zhì)酶活性，其中包括絲狀真菌，而酵母細胞壁中的幾丁質(zhì)含量通常低于絲狀真菌，因此，酵母基因組編碼的幾丁質(zhì)酶的數(shù)量較少［46］。絲狀真菌，如木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、脈孢菌（Neurospora）、毛霉（Mucor）、曲霉（Aspergillus）、耳霉屬（Conidiobolus）以及白僵菌屬（Beauveria）菌株可以分泌不同的幾丁質(zhì)酶，其中大多數(shù)酶是真菌寄生所必需的。作為寄生病原真菌的哈茨木霉（T. harzianum）和綠色木霉（T. viride）中的幾丁質(zhì)酶分解機制是由多個細胞外GH18幾丁質(zhì)酶類協(xié)同作用［47］，來自T. viride中的一種混合物被發(fā)現(xiàn)含有4種不同的幾丁質(zhì)酶，能夠破壞家蠶的圍食膜［26］。值得注意的是，真菌保護自身免受內(nèi)源性幾丁質(zhì)酶的降解作用機理還有待深入研究。研究發(fā)現(xiàn)在Trichoderma中，幾丁質(zhì)酶參與真菌寄生、外源幾丁質(zhì)原纖維的分解以及自溶和細胞壁的再循環(huán)；在健康的菌絲中，幾丁質(zhì)受到細胞壁中蛋白質(zhì)的保護，而這種保護功能在真菌寄生攻擊、菌絲老化和自溶過程中會部分喪失［48］。

盡管真菌幾丁質(zhì)酶在真菌生命周期和生物相互作用中具有重要作用，但根據(jù)BRENDA酶數(shù)據(jù)庫中的信息，沉積的真菌幾丁質(zhì)酶序列數(shù)量約多于細菌幾丁質(zhì)酶的10%，這表明真菌幾丁質(zhì)酶的分子研究可能遠落后于對細菌幾丁質(zhì)酶的認識。

2.3 病毒幾丁質(zhì)酶

目前已知的幾種病毒幾丁質(zhì)酶均屬于GH18家族，它們的功能是通過削弱宿主屏障結(jié)構(gòu)，促進病毒感染或從受感染細胞中釋放新生病毒。已知的病毒幾丁質(zhì)酶來源為Epinotia aporema granulovirus［49］、菜青蟲顆粒體病毒（Pieris rapae granulosisvirus，PrGV）［50］、Autographa californica nucleopolyhedrovirus、Cydia pomonella granulovirus［51］以及思茅松毛蟲的核型多角體病毒［52］，其中來自于思茅松毛蟲的幾丁質(zhì)酶被證明具有很強的殺蟲活性。在轉(zhuǎn)基因煙草中提取純化出的一種核型多角體病毒幾丁質(zhì)酶（rChiA），可增強幼蟲圍食膜的滲透性，且能抑制鏈格孢菌（A. alternata）的孢子萌發(fā)和生長，因此rChiA可作為生態(tài)友好的抑制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［53］。

2.4 植物幾丁質(zhì)酶

植物幾丁質(zhì)酶為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶類，屬于GH19家族，分子量在25-36 kD之間，它們根據(jù)來源有堿性與酸性之分。植物幾丁質(zhì)酶主要存在于單子葉和雙子葉植物中，如水稻、馬鈴薯、胡蘿卜、草莓、番茄等［54］。當有病原體攻擊時，植物幾丁質(zhì)酶作為自衛(wèi)酶釋放病原響應(yīng)蛋白，部分蛋白在鹽濃度增加、寒冷和干旱脅迫條件下才會表達。植物容易受到病原真菌和有害昆蟲的侵害，但許多植物因含有幾丁質(zhì)酶而能夠拮抗病原真菌和有害昆蟲。許多幾丁質(zhì)酶已從不同的植物中分離純化出來，對植物病原真菌表現(xiàn)出了較強的抗菌活性［55］。

從大麥中提取的35 kD重組幾丁質(zhì)酶對植物病原真菌番茄早疫病菌（A. solani）、鐮刀菌（Fusarium）、立枯絲核菌（R. solani）和黃萎病菌（Verticillium）有顯著的抑制作用［56］。大麥幾丁質(zhì)酶基因可用于甘蔗抗真菌植株的培育，轉(zhuǎn)基因甘蔗SCT?15和SCT?20在體外生物測定中對接種的鐮形刺盤孢菌（C.falcatum）表現(xiàn)出較強的抗性，與對照組相比，轉(zhuǎn)基因植株依舊可以健康生長和保持綠色，而對照組在感染C. falcatum后第3周明顯變黃并最終導(dǎo)致植株死亡［57］。蛾豆來源的幾丁質(zhì)酶可拮抗病原真菌，從尖葫蘆中分離提取的幾丁質(zhì)酶對黑曲霉（A. niger）和Trichoderma均有抑菌作用［58-59］。

2.5 宏基因組幾丁質(zhì)酶

21世紀以來，研究者從GH18或GH19家族催化結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，開始對不同生境的微生物幾丁質(zhì)酶降解群落進行了基于序列的多樣性分析，揭示了陸地和生態(tài)系統(tǒng)中幾丁質(zhì)酶編碼基因的群落結(jié)構(gòu)以及未開發(fā)幾丁質(zhì)酶的多樣性［36］。幾丁質(zhì)降解細菌的群落結(jié)構(gòu)分布及其相對豐度對于環(huán)境的變化（如營養(yǎng)或pH值）均具有一定響應(yīng)［37,60］。在富含幾丁質(zhì)的土壤中，幾丁質(zhì)酶基因的豐度隨著幾丁質(zhì)的添加而升高，幾丁質(zhì)降解細菌的活性也顯著增強［61］。抑制性和富集性土壤被第一次用于尋找?guī)锥≠|(zhì)酶的宏基因組研究，因此無需培養(yǎng)微生物即可獲得整個群落的環(huán)境DNA［62-63］。

2014年研究人員從瑞典烏普薩拉農(nóng)業(yè)大學試驗田的抑制卷心菜植物病原體的土壤中分離獲得第一個宏基因組來源的幾丁質(zhì)酶［27-28］，該幾丁質(zhì)酶Chi18H8屬于GH18家族，對植物病原體禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）具有抗菌活性。Dai等［64］使用膠體幾丁質(zhì)作為底物，從青藏高原微生物宏基因組中發(fā)現(xiàn)了一種新的幾丁質(zhì)酶（P1724），并在大腸桿菌中進行了表達。P1724在系統(tǒng)發(fā)育上與其他用于研究的幾丁質(zhì)酶差異較大，包含兩個GH18家族的催化結(jié)構(gòu)域。Li等［65］從福建漳州市紅樹林土壤的宏基因組中克隆出一種幾丁質(zhì)酶基因（ChiT?7），該基因編碼一種含有381個氨基酸的蛋白質(zhì)，不僅與GH18家族幾丁質(zhì)酶有一定的序列相似性，且還表現(xiàn)出廣泛的pH和溫度穩(wěn)定性。通過系統(tǒng)發(fā)育分析和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，ChiT?7酶屬于GH18家族。在極端環(huán)境中生存的大多數(shù)微生物，無法在實驗室條件下進行培養(yǎng)，這就降低了發(fā)現(xiàn)新型幾丁質(zhì)酶的概率，但是基于宏基因組的方法無需經(jīng)過微生物的純培養(yǎng)便可在基因庫中進行功能篩選。因此，宏基因組方法在未來生物技術(shù)應(yīng)用上有較大潛力。

3 幾丁質(zhì)酶對農(nóng)作物病原真菌和昆蟲的生防機理及防治策略

3.1 病原真菌的生防機理及防治策略

大多數(shù)農(nóng)作物病害由真菌引起，而幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的重要組成部分，因此產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株能夠通過降解病原真菌的細胞壁進而抑制其繁殖與生長，幾丁質(zhì)酶抗病原真菌的潛力取決于真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)（圖3）［66］?，F(xiàn)有研究主要集中于產(chǎn)酶微生物對植物病原真菌的抑制作用，試圖用生物殺菌劑替代化學制劑從而減少化學農(nóng)藥對環(huán)境的危害［67］。

圖3 真菌細胞壁的一般結(jié)構(gòu)Fig. 3 General structure of the fungal cell wall

Yan等［68］從畢赤酵母（Pichia pastoris）中純化出重組表達的水稻幾丁質(zhì)酶，該酶能有效抑制匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和B. cinerea的生長，但對A. niger和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）無明顯抑制作用。水稻幾丁質(zhì)酶之所以表現(xiàn)出不同的抗真菌活性，是由于真菌的微結(jié)構(gòu)表面和細胞壁中幾丁質(zhì)的比例不同。當以鱗片狀結(jié)構(gòu)的排列方式允許幾丁質(zhì)纖維束暴露在真菌細胞壁表面時，幾丁質(zhì)酶更有可能與真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)相互作用。Berini等［27］通過對土壤抑菌宏基因組生成的fosmid文庫進行功能篩選時發(fā)現(xiàn)了一種新型抗真菌幾丁質(zhì)酶Chi18H8，該酶對F. graminearum和茄絲核菌（Thanatephorus）具有抗菌活性，且具有耐溶劑性和在酸性環(huán)境中能夠長期穩(wěn)定存在等特點。Moka等［69］從洋蔥種植區(qū)分離出一株Trichoderma，對該分離株進行幾丁質(zhì)酶活性篩選，發(fā)現(xiàn)它能有效抑制洋蔥作物中由F. oxysporum引起的枯萎病。Asif等［70］從巴基斯坦當?shù)貪O港收集的樣本中分離出7種可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細菌，通過菌絲抑制法發(fā)現(xiàn)可有效抑制真菌細胞壁的生長。Akram等［71］從存放魚類的土壤中分離、鑒定出一種新的能夠合成高活性幾丁質(zhì)酶的細菌菌株（Acinetobacter indicus CCS?12），純化后的酶對一些植物病原菌具有明顯的抗真菌活性。Sarker等［72］從不同農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)種植的番茄根際土壤中共分離到160株天然熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），并從中篩選出兩株產(chǎn)酶活性較高的菌株FPK22和FPK4，田間實驗結(jié)果表明，這兩株菌對番茄和辣椒的防治效果分別為69.2%和62%。上述研究表明，不同來源的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌主要通過降解植物病原真菌細胞中的幾丁質(zhì)來抑制病原菌的生長，從而起到一定的靶向防控作用。而且，具有高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的拮抗菌對不同植物病原真菌表現(xiàn)出一定的廣譜拮抗性。

3.2 蟲害的生防機理及防治策略

對于昆蟲來說，圍食膜和外骨骼（圖4）［66］起著理化屏障的作用以防止環(huán)境危害和天敵捕食。圍食膜和外骨骼由幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類、兒茶酚胺代謝產(chǎn)物和微量礦物質(zhì)組成。昆蟲由于脫皮液中幾丁質(zhì)酶的作用，可周期性地脫去舊的外骨骼和圍食膜并重新合成新的外骨骼，脫皮液積累在舊角質(zhì)層與表皮的中間及腸道組織中，含有GlcNAc的水解產(chǎn)物最終會被回收用于合成新的角質(zhì)層［73］。

圖4 昆蟲體內(nèi)存在幾丁質(zhì)層（角質(zhì)層和腸道）Fig. 4 Presence of chitin layers（cuticle and gut）in case of insects

Tu等［74］從工蜂腸道中分離出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的S.marcescens，并對其防治西方蜜蜂的寄生螨進行實驗室效果評價，研究表明細菌培養(yǎng)上清液和硫酸銨沉淀收集的蛋白質(zhì)對雌螨有較強的殺滅作用（5 d內(nèi)的死亡率為100%），其中幾丁質(zhì)酶可能直接通過外骨骼起到殺蟲作用。Zhong等［75］從土壤中分離出Pseudomonas sp. TXG6?1，并純化出52 kD的幾丁質(zhì)酶（PsChiC），僅用PsChiC對斜紋夜蛾沒有明顯的殺蟲作用，但在斜紋夜蛾核型多角體病毒存在下，PsChiC對斜紋夜蛾的殺蟲作用明顯增強。Suganthi等［76］從P. fluorescens中純化并制備出一種幾丁質(zhì)酶，將酶噴灑在受控環(huán)境中的新鮮茶樹嫩枝上，然后讓昆蟲在嫩枝上取食，觀察到96 h內(nèi)茶蚊的死亡率為100%。

Berini等［26］研究發(fā)現(xiàn)T. viride幾丁質(zhì)酶混合物對家蠶圍食膜有顯著影響，降解幾丁質(zhì)的細菌可降解昆蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，表明它們在害蟲防控方面具有潛在的應(yīng)用前景［77］。S. marcescens SEN的培養(yǎng)液中至少含有兩種在堿性條件下具有活性的幾丁質(zhì)酶，將其添加到斜紋夜蛾幼蟲的飼料中，幼蟲的死亡率很高［78］，從B. subtilis中純化出的幾丁質(zhì)酶也可使斜紋夜蛾幼蟲的發(fā)育變緩［79］。S. marcescens WW4中的3種幾丁質(zhì)酶（ChiA、ChiB和ChiC）對天幕毛蟲和棉鈴蟲幼蟲也具有殺蟲活性［80］。將來自于木豆野生品種的CpCHI4基因通過在煙草中進行異源表達，證實煙草具有殺棉鈴蟲活性是因為整合了CpCHI4基因［81］。通過掃描電鏡觀察幾丁質(zhì)酶HaCHT4 對棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育過程中幾丁質(zhì)含量及圍食膜結(jié)構(gòu)的影響，在4-6齡的幼蟲早期，觀察到圍食膜表面結(jié)構(gòu)多呈小孔結(jié)構(gòu)，后期孔隙變多且較大。在4齡幼蟲的后期，經(jīng)過RNA干擾引起基因HaCHT4的低表達又導(dǎo)致圍食膜中幾丁質(zhì)含量增加，表面結(jié)構(gòu)呈多層結(jié)構(gòu)并且孔徑變小。該研究認為幾丁質(zhì)酶HaCHT4對棉鈴蟲的幾丁質(zhì)含量及圍食膜結(jié)構(gòu)有顯著的調(diào)節(jié)作用［82］。

綜上所述，依據(jù)害蟲體內(nèi)存在幾丁質(zhì)重要成分的事實，通過直接噴施幾丁質(zhì)酶液或在農(nóng)作物中異源表達幾丁質(zhì)酶基因降解害蟲體壁和圍食膜中的幾丁質(zhì)進行害蟲防治，是一種靶向、綠色、有效的生防策略。

3.3 植物寄生線蟲的生防機理及防治策略

植物寄生線蟲是一種微小的圓形蠕蟲，會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失［83］。線蟲的生命周期主要包括3個不同階段，即卵期、幼蟲期和成蟲期［84］。線蟲卵殼的角質(zhì)層在預(yù)防感染方面起著重要作用，其主要成分是膠原蛋白，在線蟲感染期間可被微生物降解［84］。卵殼復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可提高被包裹的卵、胚胎或幼蟲的存活率。卵殼是線蟲卵中最堅硬的部分，其主要成分是幾丁質(zhì)。目前，主要用化學殺蟲劑控制線蟲病害，但細菌和真菌因能產(chǎn)生具有殺線蟲作用的代謝物和水解酶而受到越來越多的關(guān)注［85］。

PjChi?1是從青霉菌中分離出的一種幾丁質(zhì)酶，通過使用轉(zhuǎn)基因番茄對根結(jié)線蟲進行了測試。與從對照植物中收集的卵相比，在轉(zhuǎn)基因番茄中發(fā)現(xiàn)的卵殼幾丁質(zhì)含量較低，轉(zhuǎn)基因植物中PjCHI?1的過表達有效減少了線蟲繁殖并抑制了胚胎發(fā)育［86］。幾丁質(zhì)酶在降解鐵載體和其他次生代謝物控制線蟲方面也有優(yōu)勢［87］。據(jù)報道，幾丁質(zhì)酶主要干擾寄生線蟲的卵孵化，Lee和Kim報道了來自于短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）L1的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶對沙蠶卵孵化和幼體死亡率的抑制作用顯著增強［88］。幾丁質(zhì)酶和明膠酶在抑制番茄隱孢子蟲感染中也發(fā)揮著重要作用［89］。因此，利用幾丁質(zhì)酶來防治農(nóng)作物的線蟲危害是一種非常有潛力的生防策略。但是目前這方面的研究報道相對較少，后期還需更深入地研究。

4 基于幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物害蟲防治中的應(yīng)用

利用生物技術(shù)對具有先天和后天抗生物脅迫能力的農(nóng)作物進行基因工程育種，在很大程度上可以減少對農(nóng)藥的使用，并能保障持續(xù)的作物產(chǎn)量。幾丁質(zhì)酶是一種單基因編碼的蛋白質(zhì)，具有低分子量和存在信號肽的特點，在轉(zhuǎn)基因作物中具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物幾丁質(zhì)酶在植物發(fā)育和非特異性脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，來自植物的幾丁質(zhì)酶基因已成功地在小麥、西紅柿、土豆等作物中進行過表達以對抗真菌病原體［90］。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將山崳菜防御素基因和來自灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus HUT6037）的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到煙草中，所得轉(zhuǎn)基因煙草可通過抑制病原菌菌絲體生長來抗煙草枯萎病菌［91］。使用來自深綠木霉（T. atroviride）的工程化基因Chit42和S. marcescens的C端幾丁質(zhì)結(jié)合域可培育抗菌核莖腐病的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜［92］。利用橄欖鏈霉菌（S. olivaceus）GH19家族的幾丁質(zhì)酶基因可培育抗真菌的轉(zhuǎn)基因大豆［93］。Ahmad Mir等［94］通過從印度芥菜中克隆幾丁質(zhì)酶IV基因，選育了具有高轉(zhuǎn)錄水平幾丁質(zhì)酶IV基因的獨立芥菜轉(zhuǎn)基因株系，可用于抗甘藍型油菜病菌的感染。病理學研究表明，與非轉(zhuǎn)基因植物相比，芥菜幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因株系的甘藍型油菜病斑發(fā)育速率和大小顯著降低。Wang等［95］通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，同源四倍體蘋果中Md Chi1基因的表達水平顯著上調(diào)，由此從該蘋果中克隆出Chi1基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法獲得4個Md Chi1 OE品種，轉(zhuǎn)基因植株對炭疽桿菌（B. anthracis）和鏈格孢菌（A. alternata）引起的真菌病害具有較強的抗性。Zhang等［96］報道了從B. subtilis中克隆出幾丁質(zhì)酶基因chi113并將其通過載體導(dǎo)入到越南伯克霍爾德菌（Burkholderia vietnamiensis P418）中形成重組體P418?37，檢測到重組體P418?37有穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶活性，并對小麥紋枯病、棉花枯萎病和番茄灰霉病的植物病害產(chǎn)生抑制作用。從S. marcescens中克隆幾丁質(zhì)內(nèi)切酶基因SmchiC，將其通過轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草對B. cinerea及草地貪夜蛾的抗性明顯高于野生型植株［97］。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅促進了不同來源幾丁質(zhì)酶基因的功能驗證，而且還推動了它們在作物改良中的成功應(yīng)用［81］。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的農(nóng)作物中，可獲得具有高抗病蟲害性能的作物新品種，可在很大程度上減少對化學農(nóng)藥的使用。

5 總結(jié)與展望

植物病蟲害問題已嚴重制約農(nóng)作物的生產(chǎn)、品質(zhì)及安全。使用化學農(nóng)藥進行病蟲害防治會對種植土壤、農(nóng)作物品質(zhì)及其安全性造成不利影響。而且，隨著長期、過量使用化學農(nóng)藥，病原體會對其產(chǎn)生抗性，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性產(chǎn)生更加嚴重的危害。隨著綠色、可持續(xù)發(fā)展理念的不斷深入，以蟲治蟲、以菌治蟲、以菌治菌、以微生物（或植物）代謝物治蟲治菌的生物防治與綠色防控技術(shù)越來越受到農(nóng)科科技人員和農(nóng)戶的重視和認可。幾丁質(zhì)酶作為一種有效的生防制劑，主要是基于它能夠特異性降解存在于植物病原真菌細胞壁、線蟲和有害昆蟲體細胞內(nèi)的幾丁質(zhì)，在農(nóng)作物病蟲害的生物防治生產(chǎn)實踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，有關(guān)幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物病蟲害生物防治領(lǐng)域的研究和開發(fā)應(yīng)用工作已較為廣泛和深入。但是，結(jié)合當前農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究開發(fā)領(lǐng)域的新進展以及生防酶制劑的實際應(yīng)用形式，建議今后在以下幾個方面作進一步的探索和努力：（1）鑒于實驗室可培養(yǎng)微生物種類和數(shù)量的有限性，可采用宏基因組學技術(shù)進一步挖掘不同生境、不同生物體中幾丁質(zhì)酶基因的多樣性和特異性，以發(fā)現(xiàn)更多更具開發(fā)應(yīng)用潛力的生防幾丁質(zhì)酶；（2）應(yīng)采用生物信息學技術(shù)全面系統(tǒng)地比較分析不同物種來源的幾丁質(zhì)酶基因和蛋白質(zhì)序列、氨基酸組成、理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、亞細胞定位、結(jié)構(gòu)功能域以及高級結(jié)構(gòu)，為深入理解幾丁質(zhì)酶的催化機理、理性設(shè)計與定向進化、催化活性和穩(wěn)定性的提高、化學模擬酶的制備提供理論依據(jù)；（3）通過開發(fā)創(chuàng)建基于幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因和基因編輯耦合技術(shù)體系，可獲得兼具抗病性、抗逆性、特性品質(zhì)、產(chǎn)量潛力和生長發(fā)育等多個優(yōu)良性狀的改良農(nóng)作物新品系；（4）基于綠色環(huán)保、多酶聯(lián)產(chǎn)、節(jié)能省時、混菌多底物的幾丁質(zhì)酶的固態(tài)、半固態(tài)新型發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)亟需創(chuàng)新探索；（5）幾丁質(zhì)酶作為有效、有潛力的綠色生防制劑，目前的研究大多集中于實驗室層面的防治效果評價，但是田間試驗報道還相對較少。因此，基于高活性、高穩(wěn)定性、高效性為特征，以生產(chǎn)實踐可應(yīng)用為目標的幾丁質(zhì)酶生防新型制劑的生產(chǎn)技術(shù)體系和實際應(yīng)用效果評估工作亟需攻關(guān)，以期開發(fā)出能在農(nóng)作物病蟲害生物防治生產(chǎn)實踐中可應(yīng)用推廣的幾丁質(zhì)酶生防產(chǎn)品，為綠色健康、可持續(xù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻。

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