UPLC-Q-TOF/MS 法鑒定不同基原水柏枝的化學(xué)成分

武鑫玥，丁 銀，趙程成，茍曉玲，趙紫薇，張 靜，唐 策*，范 剛*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

水柏枝為常用藏藥，具有清熱解毒、發(fā)散透疹的功效，是藏醫(yī)治療熱毒癥、黃水病的常用藥材之一，具有較高的藥用價值和良好的開發(fā)與應(yīng)用前景。目前水柏枝屬植物化學(xué)成分的研究比較少，主要含有黃酮類與酚酸類化合物，這些化學(xué)成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化等活性［1］。已有研究采用HPLC 法測定了水柏枝中槲皮素、槲皮苷、沒食子酸的含量［2-3］，但其他化學(xué)成分還未見分析報道。

水柏枝為典型的多基原藥材，課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，秀麗水柏枝（MyricariaeelegansRoyle）、具鱗水柏枝（M.squamosaDesv.）、三春水柏枝（M.paniculateP.Y.Zhang ＆ Y.J.Zhang）、小花水柏枝（M.wardiiMarquand） 為目前使用的主流品種。由于遺傳背景不同，水柏枝不同品種的化學(xué)成分可能存在一定的差異，進而影響其質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效。因此，有必要采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)篩選種間差異性成分，以促進其質(zhì)量控制和臨床合理利用。

UPLC-Q-TOF/MS 法具有分析速度快、靈敏度高、定性能力強等優(yōu)點，為中藥、藏藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價提供了新的分析方法，目前已成功應(yīng)用于當(dāng)歸等藥材的品種差異研究中［4］。因此，本研究主要采用基于UPLC-Q-TOF-MS 的分析技術(shù)分別對不同基原水柏枝藥材進行化學(xué)成分分析，并結(jié)合偏最小二乘法判別分析和方差分析，尋找種間差異成分，以期為其品種鑒定、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用等提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀（配有四元溶劑管理系統(tǒng)、樣品管理系統(tǒng)、PDA 檢測器、Empower 色譜工作站）、Q-TOF analyzer in a SYNAPT G2 HDMS system 高分辨質(zhì)譜儀（配有ESI 接口、MarkerLynx 4.1 工作站）（美國Waters 公司）； Sorvall Legend Micro 17 高速離心機、微量移液槍（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BT125D 十萬分之一電子天平 （德國Sartorius 公司）； KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈 （色譜純，美國J.T.Baker 公司）； 甲酸、亮氨酸腦啡肽（色譜純，美國Sigma 公司）； 水為蒸餾水［屈臣氏集團（香港） 有限公司］； 其余試劑均為分析純。

1.3 藥材 本研究共收集27 批不同品種的水柏枝樣品，經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云研究員鑒定為秀麗水柏枝M.elegans、具鱗水柏枝M.squamosa、三春水柏枝M.paniculata和小花水柏枝M.wardii。樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS 條件

2.1.1 色譜 Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流動相0.1%甲酸水（A） -0.1% 甲酸乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～1 min，4% B； 1 ～4 min，4% ～5% B； 4 ～6 min，5% ～7%B； 6 ～10 min，7% B； 10 ～13 min，7% ～14%B； 13 ～18 min，14% B； 18 ～21 min，14% ～18%B； 21 ～25 min，18% ～37% B； 25 ～26 min，37% ～60% B； 26 ～29 min，60% B； 29 ～32 min，60% ～80% B； 32 ～35 min，80% ～95% B； 35 ～40 min，95%B； 40 ～41 min，95% ～99% B； 41 ～46 min，99% B； 46 ～48 min，99% ～4% B； 48 ～50 min，4%B）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫40 ℃；進樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 Waters SYNAPT G2 HDMS 系統(tǒng)； 霧化、錐孔氣氮氣； 源溫度150 ℃； 反向錐孔氣體體積流量50 L/h； 脫溶劑氣溫度450 ℃； 脫溶劑氣體體積流量800 L/h； 錐空電壓40 V； 萃取錐空電壓4 V； 毛細管電壓3.0 kV （正）、2.5 kV （負）； 掃描時間0.3 s； 掃描間隔0.02 s； 掃描范圍m/z100～1 500； 鎖定質(zhì)量數(shù) （亮氨酸腦啡肽）m/z556.277 1 ［M+H］+，54.261 5 ［M-H］-。

2.2 供試品溶液制備 稱取水柏枝粉末（過3 號篩） 約1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz） 30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取濾液，13 000 r/min 離心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 質(zhì)譜分析 在正、負離子模式下，同時進行一級和二級掃描。通過精確分子量、出峰時間、裂解碎片、加合離子峰（ ［M+H］+、［M-H］-、［2M+H］+等），確認和指證化合物。按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定，對27 批水柏枝進行分析，得到水柏枝藥材的正、負離子狀態(tài)下掃描總離子流圖。在正離子模式下，除出現(xiàn)［M+H］+的準(zhǔn)分子離子峰外，大部分化合物均顯示出強豐度的［M+Na］+的加合離子峰，有時還會出現(xiàn)［2M+H］+、［2M+Na］+離子峰；在負離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰一般為［M-H］-，同時還會出現(xiàn)［M+Na-2H］-、［2M-H］-等離子峰。通過對準(zhǔn)分子離子峰上對應(yīng)的分子量進行擬合計算，按保留時間先后順序列出。從中得到36 個化合物，包括6 個黃酮類（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、木犀草素、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等）、17 個酚酸類（沒食子酸、鞣花酸等）、2 個生物堿類（N-阿魏酰酪胺、N-阿魏?；?4-O-甲基酪胺）、3 個氨基酸類（脯氨酸、苯丙氨酸等）、8 個其他類（水柏枝素A、腺苷等）。水柏枝基峰色譜圖見圖1，鑒定的化合物質(zhì)譜裂解信息見表2。

圖1 水柏枝總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of Myricariae Ramulus

表2 水柏枝主要化學(xué)成分的質(zhì)譜信息Tab.2 MS information of the major constituents in Myricariae Ramulus

2.4 化學(xué)計量學(xué)分析

2.4.1 偏最小二乘法分析 采用SIMCA-P 軟件的偏最小二乘法（PLS-DA） 對各化合物的質(zhì)譜峰面積數(shù)據(jù)進行建模，分別在正、負離子模式下對4 種基原水柏枝進行比較，見圖2。PLS-DA 三維模型中，可直觀看出不同基原的水柏枝明顯分為4 類。

圖2 水柏枝的PLS-DA 三維得分圖Fig.2 PLS-DA three-dimensional score plot of Myricariae Ramulus

2.4.2 差異代謝物篩選 觀察不同樣品的分類情況，并從大量多維數(shù)據(jù)中找出貢獻于分類的主要差異代謝物，但無法確定觀察到的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（顯著性），因此需要采用其他方法進一步驗證PLS-DA 結(jié)果。本研究采用方差分析評價這些成分在4 種基原間的差異是否具有顯著性。結(jié)合VIP＞1 和P＜0.05 這2 個標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在的差異成分，最終篩選出7 種具有統(tǒng)計學(xué)意義的種間差異成分，分別為水柏枝素A、阿福豆苷、對羥基桂皮酸、3，4-二甲氧基沒食子酸、沒食子酸甲酯、2，4，6-三羥基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯，詳見圖3、表3。

圖3 種間差異成分峰面積的方差分析Fig.3 Analysis of variance for peak area of interspecific differential components

表3 4 種基原水柏枝潛在差異成分的方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis for the potential component differences of 4 species of Myricariae Ramulus

3 小結(jié)與討論

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 定性技術(shù)，首次對水柏枝藥材的化學(xué)成分進行了全面分析，結(jié)合文獻報道及化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，最終鑒定了36個化合物，包括6 個黃酮類，17 個酚酸類，2 個生物堿類，3 個氨基酸類，以及8 個其他類。其中，二-O-沒食子酰-D-葡萄糖、二-O-沒食子酰-鞣花酰-D-葡萄糖、三-O-沒食子酰-D-葡萄糖、四-O-沒食子酰葡萄糖、五-O-沒食子酰-D-葡萄糖為首次從水柏枝藥材中鑒定的化學(xué)成分。

此外，結(jié)合多元統(tǒng)計和方差分析方法，利用P＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)篩選4 組樣品間的差異成分，最終確定7 種潛在的種間差異性成分，包括水柏枝素A、阿福豆苷、對羥基桂皮酸、3，4-二甲氧基沒食子酸、沒食子酸甲酯、2，4，6-三羥基苯甲酸甲酯和香草酸甲酯。這些化合物為區(qū)別不同基原水柏枝藥材的化學(xué)標(biāo)志物，今后可應(yīng)用于水柏枝藥材的品種鑒定。此外，由于這7 種化學(xué)成分的差異，可能會影響不同基原水柏枝藥材的質(zhì)量，今后應(yīng)結(jié)合與功效相關(guān)的藥理活性進一步評價不同品種的質(zhì)量差異，為水柏枝藥材的質(zhì)量控制和臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。