脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝損傷及肝細(xì)胞凋亡的影響

徐文軒，宋汶軒，喇孝瑾，申明宇，王 碩，李 超，王秀萍，陳 震，齊亞娟，李繼安*

（1.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北省中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其并發(fā)癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063200；2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063200； 3.河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 唐山 063210； 4.匈牙利東方國(guó)藥集團(tuán)，匈牙利 布達(dá)佩斯 999024）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是最常見(jiàn)的慢性肝病之一［1］，可進(jìn)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［2］。此外，NAFLD患者常伴有肥胖、糖尿病等，其心血管疾病和肝外癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加［3-4］。近年來(lái)，亞洲地區(qū)NAFLD 的患病率大幅上升［5］，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。以往研究者通過(guò)“二次打擊” 理論來(lái)闡釋NAFLD 的發(fā)病機(jī)制，即通過(guò)脂毒性的“一次打擊” 后，繼以胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 為基礎(chǔ)，其他如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥因子等多因素形成“第二次打擊”，從而導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)?。?］。當(dāng)肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)生時(shí)，大量游離脂肪酸可引起肝臟IR，同時(shí)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞損傷，Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白（Bcl-2） 和促凋亡蛋白（Bax） 調(diào)節(jié)失衡，肝細(xì)胞無(wú)法維持結(jié)構(gòu)和功能完整性，啟動(dòng)肝細(xì)胞凋亡［7-8］。因此，調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路是防治NAFLD 肝細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為NAFLD 屬于“肥氣” “肝痞”等范疇，根據(jù)臨床分析，該病以脾虛肝郁、濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀為基礎(chǔ)病機(jī)?；诖耍n題組以枳術(shù)丸為基礎(chǔ)，加清利濕熱、活血化瘀中藥擬定了脂肝清方。本研究以脂肝清方干預(yù)NAFLD 小鼠，觀察小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)、肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)等，初步探索其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 48 只SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京） 2020-0004］，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室，晝夜周期為12 h，溫度20 ～22 ℃，相對(duì)濕度40% ～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理號(hào)LX202090）。

1.2 藥物 白術(shù)、枳實(shí)、茵陳、蒲公英、草決明、荷葉、姜黃、五味子、炒山楂（批號(hào)036210901、188211001、188211001、154211101、234210301、245211001、143220101、106210901、099210401）藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店唐山分公司，經(jīng)李繼安教授鑒定為正品。鹽酸吡格列酮片 （國(guó)藥準(zhǔn)字H2010047） 購(gòu)自江蘇德源藥業(yè)股份有限公司。

1.3 試劑 膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 檢測(cè)試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號(hào) 20211211、20211211、G20211117S、G20211117S、G20211118S、G20211118S）； 小鼠C肽（C-Peptide）、胰島素 （INS） ELISA 試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)202110、202110）； 一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C1088）； 兔源Bcl-2、caspase-3 多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)GR224831-1、GR228406-3）；兔源Bax 多克隆抗體、小鼠源β-actin 單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)00094203、66009-l-lg）； 小鼠源tubulin alpha 1a （TUBA1A）單克隆抗體（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)10308）； 兔源cleaved caspase-3 多克隆抗體（美國(guó)Affinity Biosciences 公司，批號(hào)8354054）； 總RNA提取試劑盒（北京金沙生物科技有限公司，批號(hào)22RE70303）。

1.4 儀器 穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；SpectraMaxM3 多功能微孔板讀板機(jī) （ 美國(guó)Molecular Devices 公司）； JY600E 型通用電泳儀電源及JY-SCZ2+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）； ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）； BX53 型顯微鏡及SZX71 型熒光體式顯微成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）； 熒光定量PCR 儀［耶拿分析儀器（北京） 有限公司］。

2 方法

2.1 藥物制備 脂肝清方中白術(shù)、枳實(shí)、荷葉、茵陳蒸餾法提取揮發(fā)油，并用β-環(huán)糊精包合； 其藥渣與草決明、蒲公英、炒山楂合并水提濃縮； 姜黃、五味子由75% 乙醇提取過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮提取物，最后合并提取物，冷凍干燥備用，臨用前使用蒸餾水溶解。藥液經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，其主要含蒼術(shù)酮0.038%、綠原酸0.053%、白術(shù)內(nèi)酯I 0.076%。

2.2 造模、分組及給藥 將48 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常組 （8 只） 和造模組 （40只）。正常組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組小鼠給予60%高脂飼料［9］（北京華阜康生物科技股份有限公司，貨號(hào)H10060，配方比例為脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質(zhì)20%） 喂養(yǎng)。8 周后將造模組隨機(jī)分為隨機(jī)分為模型組、吡格列酮組（1.95 mg/kg） 和脂肝清方低、中、高劑量組（2.75、5.5、11 g/kg），每組8 只，灌胃給予相應(yīng)劑量藥物8 周，給藥期間模型組及給藥組繼續(xù)給予60%高脂飼料喂養(yǎng)。

2.3 體質(zhì)量、空腹血糖和口服葡萄糖耐量檢測(cè)給藥前及給藥期間，每周測(cè)定1 次體質(zhì)量，在給藥第0、8 周進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）。于OGTT 實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，按2 g/kg 灌胃給予50% 葡萄糖注射液，檢測(cè)0、30、60、90、120 min 血糖值，并采用Graphpad Prism 軟件計(jì)算曲線下面積。

2.4 取材 給藥結(jié)束后，小鼠麻醉并摘眼球取血，離心取血清，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取血后取肝臟，一半置于4%多聚甲醛中固定48 h，另一半于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè)及肝組織形態(tài)學(xué)觀察 生化法檢測(cè)小鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、INS、C-Peptide 水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA IR），公式為HOMA IR＝取材當(dāng)天空腹血糖×空腹胰島素/22.5。取于4%多聚甲醛中固定的小鼠肝組織，經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水后石蠟包埋，制備4 μm 切片，分別行蘇木素-伊紅（HE）染色和PAS 染色，于顯微鏡下觀察。每只小鼠隨機(jī)選取一張切片，對(duì)其進(jìn)行NAFLD 活動(dòng)度評(píng)分（NAS），評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1［10］。

表1 NAS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 NAS scoring standard

2.6 TUNEL 法檢測(cè)小鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況 取石蠟切片脫蠟水化，滴加蛋白酶K，室溫孵育20 min，PBS 洗滌，滴加TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗滌后DAPI 染核，封片后立即于熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。采用Image J 2.9.0 軟件計(jì)算綠色熒光平均光密度值。

2.7 小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)檢測(cè)

2.7.1 免疫組織化學(xué)法 取石蠟切片常規(guī)脫蠟，每組隨機(jī)選取3 張切片。將切片置于枸櫞酸緩沖液中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉，滴加一抗Bax（1 ∶2 000）、Bcl-2 （1 ∶100） 4 ℃孵育過(guò)夜，滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG 聚合物孵育，DAB 顯色，Mayer 蘇木素染核，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J 2.9.0 軟件分離染色圖中的棕色通道，使用IHC Profiler 插件將陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值（染色強(qiáng)度） 和陽(yáng)性面積百分比（染色面積） 共同作為測(cè)量指標(biāo)。

2.7.2 蛋白免疫印跡法 取凍存的肝組織，加入RIPA 裂解液，振蕩提取總蛋白，BCA 法測(cè)定各組樣本蛋白濃度，加入蛋白示蹤上樣緩沖液，根據(jù)濃度加入相應(yīng)體積的雙蒸水，于恒溫混勻儀100 ℃加熱變性5 min。蛋白樣本經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于快速封閉液中封閉2 h，TBST緩沖液洗滌，加一抗Bax （1 ∶5 000）、Bcl-2 （1 ∶100）、caspase-3 （1 ∶ 2 000）、cleaved caspase-3（1 ∶700）、tubulin （1 ∶25 000）、β-actin （1 ∶50 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗（1 ∶9 000） 室溫孵育，使用超敏ECL 發(fā)光液顯影、曝光，通過(guò)Image Lab 6.1 軟件測(cè)定各條帶灰度值并記錄。

2.8 小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 每組取出3 只肝組織，剪取60 mg 置于離心管中，滴加適量TRIzol 試劑后勻漿，抽提總RNA，加入氯仿混勻，高速離心后吸出上層無(wú)色液體與異丙醇混合，離心取沉淀，將沉淀與75%乙醇混勻，離心后棄去上清，加入DEPC 水溶解后凍存。采用M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加樣后于PCR 儀進(jìn)行進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer Sequences

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時(shí)兩兩比較比較采用LSD 檢驗(yàn)，若方差不齊時(shí)2 組間比較采用Tamhane's 檢驗(yàn)； 不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠體質(zhì)量的影響 造模8 周時(shí)造模組小鼠體質(zhì)量較正常組升高。給藥期間正常組小鼠體質(zhì)量略有上升，模型組小鼠體質(zhì)量大幅上升，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組體質(zhì)量逐漸下降。給藥8 周時(shí)，模型組小鼠體質(zhì)量高于正常組（P＜0.05）； 脂肝清方各劑量組小鼠體質(zhì)量低于模型組（P＜0.05），趨近于正常組水平，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)Fig.1 Trend in mouse body mass change of each group

3.2 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠空腹血糖值及OGTT曲線下面積的影響 給藥干預(yù)前（第0 周），模型組和各給藥組小鼠空腹血糖較正常組升高（P＜0.05）； 而模型組與各給藥組之間無(wú)明顯變化（P＞0.05）。給藥8 周后，與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組小鼠空腹血糖和OGTT 曲線下面積（OGTT AUC） 降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠空腹血糖值及OGTT AUC 比較（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of mouse fasting blood glucose value and OGTT AUC in each group （±s，n＝8）

表3 各組小鼠空腹血糖值及OGTT AUC 比較（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of mouse fasting blood glucose value and OGTT AUC in each group （±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別第0 周空腹血糖/（mmol·L-1）第8 周空腹血糖/（mmol·L-1）第8 周OGTT AUC正常組3.55±0.323.53±0.2730.22±2.77模型組5.03±0.33**6.37±0.92**56.83±5.09**吡格列酮組5.20±0.13**4.42±0.33＃49.26±3.19＃＃脂肝清方低劑量組5.05±0.48**4.40±0.28＃49.97±5.01＃＃脂肝清方中劑量組4.92±0.62**4.07±0.19＃44.81±3.94＃＃脂肝清方高劑量組5.08±0.32**3.35±0.63＃＃41.68±3.32＃＃

3.3 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠血清脂質(zhì)和肝功能水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方中、高劑量組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方低劑量組小鼠TC、TG、LDL-C 水平降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平比較（±s，n＝8）Fig.2 Comparison of mouse serum levels of TC，TG，HDL-C，LDL-C，ALT and AST in each group （±s，n＝8）

3.4 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠血清C-Peptide、INS水平及IR 指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清C-Peptide、INS 水平降低（P＜0.01），IR指數(shù)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組小鼠血清C-Peptide、INS 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01），IR 指數(shù)降低 （P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠血清C-Peptide、INS 水平及IR 指數(shù)比較（±s，n＝8）Fig.3 Comparison of mouse serum levels of INS，C-Peptide and IR index in each group （±s，n＝8）

3.5 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 正常組肝組織細(xì)胞排列致密，大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)分布均勻且清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)的中心； 模型組肝組織出現(xiàn)大范圍脂肪變性及脂滴堆積，細(xì)胞質(zhì)受到脂滴的占位擠壓，排列疏松，呈漁網(wǎng)狀分布，同時(shí)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； 吡格列酮組和脂肝清方各劑量組肝組織脂肪變性有不同程度改善，炎性浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖4。各組小鼠肝組織NAS 評(píng)分如表4 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織NAS 評(píng)分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組小鼠肝組織NAS評(píng)分均降低（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠肝組織HE 染色（×200）Fig.4 HE staining of mouse liver tissue in each group（×200）

表4 各組小鼠肝組織NAS 評(píng)分比較（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of NAS scores in mouse liver tissue of each group （±s，n＝8）

表4 各組小鼠肝組織NAS 評(píng)分比較（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of NAS scores in mouse liver tissue of each group （±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別NAS 評(píng)分/分正常組0.00±0.00模型組4.13±0.64**吡格列酮組1.88±0.99＃＃脂肝清方低劑量組2.25±0.46＃＃脂肝清方中劑量組1.87±0.83＃＃脂肝清方高劑量組1.50±0.53＃＃

3.6 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝組織糖原分布的影響 正常組肝組織糖原陽(yáng)性物質(zhì)呈紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，糖原分布飽滿且均勻； 模型組肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大量脂肪空泡，PAS 糖原陽(yáng)性反應(yīng)較弱，糖原分布稀薄且不均勻，鏡下呈粉紅色； 吡格列酮組和脂肝清方各劑量組脂肪空泡減少，PAS染色相對(duì)飽滿且均勻，見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肝組織糖原分布（PAS 染色，×200）Fig.5 Distribution of glycogen in mouse liver tissue of each group （PAS staining，×200）

3.7 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝組織細(xì)胞凋亡的影響 正常組肝組織中鮮見(jiàn)凋亡細(xì)胞（TUNEL 綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞）； 與正常組比較，模型組TUNEL陽(yáng)性表達(dá)增加（P＜0.01），即凋亡細(xì)胞數(shù)量增加；與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組TUNEL 陽(yáng)性表達(dá)降低（P＜0.01），即凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL 染色，×200，±s，n＝6）Fig.6 Apoptosis in mouse liver tissue of each group （TUNEL staining，×200，±s，n＝6）

3.8 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

3.8.1 免疫組化實(shí)驗(yàn) 與正常組比較，模型組小鼠肝組織Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方中、高劑量組小鼠肝組織Bax 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方低劑量組小鼠肝組織Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2 蛋白免疫組化染色（×200，±s，n＝3）Fig.7 Immunohistochemical staining of Bax and Bcl-2 protein in mouse liver tissue of each group （×200，±s，n＝3）

3.8.2 Western blot 實(shí)驗(yàn) 與正常組比較，模型組小鼠肝組織Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Bax、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方各劑量組小鼠肝組織Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2 比值降低（P＜0.01），吡格列酮組和脂肝清方中、高劑量組小鼠肝組織caspase-3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖8、表5。

圖8 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白條帶圖Fig.8 Protein bands of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleved caspase-3 in mouse liver tissue of each group

表5 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein expressions in mouse liver tissue of each group（±s，n＝3）

表5 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein expressions in mouse liver tissue of each group（±s，n＝3）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別Bax/tubulinBcl-2/tubulincaspase-3/tubulincleaved caspase-3/β-actinBax/Bcl-2正常組0.22±0.020.32±0.020.33±0.014.21±0.140.69±0.04模型組0.51±0.04**0.19±0.05**0.42±0.05**6.57±0.24**2.80±0.48**吡格列酮組0.29±0.03＃＃0.25±0.01＃0.34±0.01＃＃5.14±0.20＃＃1.19±0.18＃＃脂肝清方低劑量組0.34±0.06＃＃0.27±0.05＃＃0.39±0.015.70±0.21＃＃1.26±0.12＃＃脂肝清方中劑量組0.33±0.08＃＃0.26±0.003＃0.35±0.04＃＃5.47±0.14＃＃1.27±0.28＃＃脂肝清方高劑量組0.27±0.02＃＃0.27±0.05＃＃0.31±0.02＃＃4.93±0.13＃＃0.99±0.07＃＃

3.9 脂肝清方對(duì)NAFLD 小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織Bcl-2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，吡格列酮組和脂肝清方高劑量組Bcl-2 mRNA 表達(dá)升高 （P＜0.05），Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)降低 （P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方中劑量組BaxmRNA 表達(dá)降低 （P＜0.05），見(jiàn)圖9。

圖9 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝3）Fig.9 Comparison of mRNA expressions of Bax，Bcl-2 and caspase-3 in mouse liver tissue of each group （±s，n＝3）

4 討論

NAFLD 以肝臟脂肪變性等為主要特征，一般認(rèn)為脂質(zhì)過(guò)度堆積會(huì)促進(jìn)IR，IR 可導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生，而脂肪肝又可加重IR［11］，從而加劇脂毒性，引起肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脂質(zhì)的堆積，加重NAFLD的病理?yè)p害，形成惡性循環(huán)［12-13］。

半胱氨酸蛋白酶-3 （caspase-3） 為細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路的核心蛋白。研究證明NAFLD 模型的caspase-3 激活和肝細(xì)胞凋亡與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［14］。另外，Bcl-2 家族通過(guò)影響線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)控凋亡?？沟蛲龅鞍譈cl-2 和Bcl-xL 定位于線粒體外膜，抑制細(xì)胞色素C 的釋放； 促凋亡蛋白Bax 定位于胞漿，在收到凋亡信號(hào)后，轉(zhuǎn)移到線粒體中促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，Bax 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 而B(niǎo)cl-2 可與Bax 形成二聚體，抑制Bax 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡［15］。調(diào)節(jié)Bcl-2 家族相關(guān)蛋白表達(dá)是治療NAFLD 潛在靶向，對(duì)藥物研究具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血脂、肝功能指標(biāo)及HOMA IR 指數(shù)升高，INS 和C 肽水平均降低。值得注意的是，模型組小鼠HDL-C 水平出現(xiàn)了異常升高。研究發(fā)現(xiàn)，HDL-C 其與心血管疾病、2 型糖尿病等疾病呈“U” 型曲線相關(guān)［16］，過(guò)高水平的HDL-C 會(huì)增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是過(guò)高水平的HDL-C 可促進(jìn)炎癥、增加氧化應(yīng)激有關(guān)［17］。本研究病理結(jié)果顯示，模型小鼠肝細(xì)胞大范圍脂肪變性，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。上述結(jié)果提示NAFLD 小鼠存在糖脂代謝紊亂、IR、肝細(xì)胞凋亡、脂肪肝和肝組織受損。

脂肝清方中白術(shù)、枳實(shí)具健脾理氣散結(jié)之效，為主藥； 茵陳、草決明、蒲公英具清利濕熱、利尿散結(jié)之效，姜黃具行氣破瘀之效，焦山楂具消食散瘀之效，荷葉具健脾升清之效，為臣藥； 五味子具收斂固澀、益氣生津、護(hù)肝之效，為佐使藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可調(diào)節(jié)腸道菌群，減輕肝臟炎癥，下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，抑制凋亡進(jìn)而緩解NAFLD 的進(jìn)展［18］； 枳實(shí)可調(diào)節(jié)肝臟脂代謝紊亂，并有降血糖、肝臟保護(hù)作用［19］； 姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)P5 調(diào)控caspase-3、Bax、caspase-9、Bcl-2 與線粒體途徑相關(guān)的細(xì)胞色素C分子表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡［20］； 五味子和荷葉具有抗凋亡、抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，對(duì)NAFLD 大鼠肝細(xì)胞具有保護(hù)作用［21-22］。全方具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制肝細(xì)胞凋亡、抗炎及改善肝損傷作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂肝清方可降低模型小鼠體質(zhì)量、血脂及肝功能指標(biāo)，改善胰島素抵抗，改善肝脂肪變性、炎性浸潤(rùn)及糖原儲(chǔ)存，減少細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bax、caspase-3 及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，提示脂肝清方可調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞受損。

綜上所述，脂肝清方可調(diào)節(jié)NAFLD 小鼠糖脂代謝，改善胰島素抵抗，抑制肝細(xì)胞凋亡，從而減輕NAFLD 肝損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase-3 凋亡蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。