一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定寒熱痹膠囊中8 種成分

李 麗，袁 航，郭緒生，吳愛(ài)英，陳安珍，劉紅兵，盧京光，3*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島 266000； 2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局海洋中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266000； 3.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266000）

寒熱痹膠囊由白芍、麻黃、甘草等10 味中藥組成，具有散寒清熱、和營(yíng)定痛作用［1-2］，主要用于治療風(fēng)濕病中的寒熱錯(cuò)雜證［3］，而且無(wú)明顯不良反應(yīng)，是一種安全有效的抗風(fēng)濕病藥物。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中藥成方制劑第十九冊(cè)［4］，但只有麻黃TLC鑒別、膠囊通用檢查，缺少成分含量測(cè)定，很難對(duì)其內(nèi)在性質(zhì)進(jìn)行全面把控，從而無(wú)法充分反映其質(zhì)量。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)寒熱痹膠囊質(zhì)量的研究很少，文獻(xiàn)［5-6］ 也只對(duì)單一成分進(jìn)行含量測(cè)定，而且效率低，成本高。

一測(cè)多評(píng)法是一種能滿足中藥多成分特性的質(zhì)量評(píng)估方法［7-9］，可節(jié)約時(shí)間，降低成本，目前已收載于各國(guó)藥典［10］，而且在多種中藥材、中藥飲片、中藥制劑含量測(cè)定研究中得到廣泛應(yīng)用［11-17］，但尚未涉及寒熱痹膠囊。因此，本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定寒熱痹膠囊中沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨的含量，以期為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）； LC-2030C 高效液相色譜儀，配置PDA 檢測(cè)器（日本島津公司）；超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；BP211D 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試劑 沒(méi)食子酸（批號(hào)110831-201906，純度91.5%）、鹽酸麻黃堿（批號(hào)171241-201809，純度100%）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)171237-201510，純度99.8%）、芒果苷（批號(hào)111607-201704，純度98.1%）、芍藥苷 （批號(hào)110736-202145，純度94.6%）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-202021，純度96.2%） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷 （批號(hào) MUST-21031601，純度≥99.14%）、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖（批號(hào)MUST-21092610，純度≥99.14%） 對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）； 其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材與藥物 桂枝、白芍、防風(fēng)、知母、白術(shù)、麻黃、干姜、附子（炙）、甘草、地龍藥材均購(gòu)自市場(chǎng)，經(jīng)青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院吳愛(ài)英主任中藥師鑒定為正品。寒熱痹膠囊共10 批，均由長(zhǎng)春英平藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，編號(hào)S1～S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1% 磷酸 （B），梯度洗脫 （0 ～8 min，4.5% A； 8 ～9 min，4.5% ～12% A； 9 ～17 min，12%A； 17 ～30 min，12% ～47% A； 30 ～33 min，47% ～52%A； 33 ～35 min，52% ～70%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)0 ～8 min 210 nm （沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿），8～17 min 235 nm （芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷），17 ～27 min 216 nm （1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖），27～35 min 254 nm （甘草酸銨）；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨對(duì)照品適量，70%甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為202.032、217.800、213.372、35.128、207.996、750.746、419.560、414.814 μg/mL 的貯備液，精密量取適量，70%甲醇稀釋，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為 22.377、8.712、8.535、2.810、33.279、60.060、16.782、16.593 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取本品10 粒，傾出內(nèi)容物研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加入40 mL 70%甲醇，超聲（功率240 W，頻率40 kHz） 處理30 min，冷卻，70% 甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和工藝，分別制成缺白芍、缺麻黃、缺知母、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，雜質(zhì)不會(huì)干擾待測(cè)成分，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，70%甲醇稀釋，制成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨峰面積RSD 分別為0.27%、0.45%、0.52%、0.46%、0.90%、0.30%、0.39%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份本品（批號(hào)S10），于0、4、8、12、18、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨峰面積RSD 分別為0.23%、0.35%、1.12%、1.54%、0.75%、0.44%、0.98%、0.20%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)S10） 6 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨峰面積 RSD 分別為 0.89%、0.64%、0.55%、0.87%、0.76%、0.86%、1.76%、0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品（批號(hào)S10） 6 份，每份約0.2 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液（沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.202 0、0.217 8、0.213 4、0.035 13、1.053 9、0.841 2、0.212 6、0.414 8 mg/mL） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨平均加樣回收率分別為 95.53%、99.24%、102.93%、104.81%、101.47%、103.45%、103.20%、100.33%，RSD 分別為 1.84%、2.04%、2.57%、1.54%、1.60%、2.17%、0.84%、2.52%。

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 分別取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、3、5 μL，各3 份，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算相對(duì)校正因子fk/s，公式［18］為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子（n＝3）Tab.2 Relative correction factors of various constituents （n＝3）

2.5 耐用性考察

2.5.1 儀器、色譜柱 本實(shí)驗(yàn)分別在Agilent 1260、LC-2030C 色譜儀，以及Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Waters CORTECS C18（100 mm × 4.6 mm，2.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm） 色譜柱上計(jì)算相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響（n＝3）Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors （n＝3）

2.5.2 柱溫 本實(shí)驗(yàn)分別在33、35、37 ℃下計(jì)算相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響（n＝3）Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors （n＝3）

2.5.3 體積流量 本實(shí)驗(yàn)分別在0.9、1.0、1.1 mL/min 下計(jì)算相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜4%）。

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響（n＝3）Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors （n＝3）

2.6 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算在“2.5.1”項(xiàng)儀器、色譜柱上的相對(duì)保留時(shí)間、保留時(shí)間差，結(jié)果見(jiàn)表6～7。由此可知，各成分保留時(shí)間差波動(dòng)較大，而相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，故選擇后者作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn)。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of various constituents

表7 各成分保留時(shí)間差Tab.7 Retention time differences of various constituents

2.7 樣品含量測(cè)定 取10 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表8，可知2 種方法所得結(jié)果接近。

表8 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.8 Results of content determination of various constituents （mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)先以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸洗脫時(shí)各成分色譜峰分離度、對(duì)稱因子均良好，再進(jìn)行190 ～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)各成分最大吸收波長(zhǎng)，最終確定在210 nm 處檢測(cè)沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，235 nm處檢測(cè)芒果苷、芍藥苷、芍藥苷，216 nm 處檢測(cè)1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖，254 nm 處檢測(cè)甘草酸銨。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、稀乙醇、70%乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（15、30、45 min），以各成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合考慮檢測(cè)時(shí)間、成本及操作便利性，最終確定70%甲醇超聲處理30 min 作為供試品溶液制備方法。

3.3 內(nèi)標(biāo)選擇 選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，應(yīng)遵循性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉、易得、低毒、有效的原則［19］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定［20-21］，含量高，無(wú)毒，對(duì)照品廉價(jià)易得，故以其為內(nèi)標(biāo)。

3.4 含量分析 10 批樣品中均可檢出8 種成分，其中S1 樣品中各成分含量與其他批次樣品存在一定差異，可能與藥材質(zhì)量、生產(chǎn)工藝有關(guān)。

3.5 耐用性分析 本實(shí)驗(yàn)考察了不同儀器、色譜柱、柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，并對(duì)同一色譜條件下的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)相對(duì)校正因子重復(fù)性理想，相對(duì)保留時(shí)間定位色譜峰波動(dòng)較小，表明該方法穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定寒熱痹膠囊中沒(méi)食子酸、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、甘草酸銨的含量，不僅能降低實(shí)驗(yàn)成本，還可提高工作效率，從而為該制劑多成分含量測(cè)定提供新的思路和模式，使其質(zhì)量評(píng)價(jià)更具有科學(xué)性。