右美托咪定預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制

楊雪兒，吳明瀟，張超凡，賈雋文，胡春陽，溫立勇，李罡，金蓮錦

1 牡丹江醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院，黑龍江牡丹江 157000；

2 牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科；3 牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院骨外科

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CAD）是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧或壞死而導致的心臟病，主要病理表現(xiàn)為缺血再灌注引起的心肌損傷。目前，尚無有效的治療方法來保護心臟免受心肌缺血再灌注損傷（MIRI），因此有必要尋找預防MIRI 的新策略，以改善CAD 患者的臨床結(jié)局。右美托咪定（Dex）是α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜作用；近期研究發(fā)現(xiàn)Dex可以通過多種途徑緩解包括心臟在內(nèi)的重要器官缺血再灌注損傷［1］。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）激活的交換蛋白分子Epac1是cAMP的直接靶向蛋白，通過激活Ras 蛋白家族成員Ras 樣小GTP 酶Rap1，促進Rap1上無活性的GDP轉(zhuǎn)換為具有活性的GTP，從而調(diào)節(jié)細胞相關功能［2］。研究發(fā)現(xiàn)，當Epac1信號通路被激活時，大鼠慢性MIRI 加重，并增加了大鼠心肌梗死面積，推測其機制與Epac1/Rap1信號通路的抗氧化作用有關［3］?；诖耍狙芯坑?022年9月—2023 年3 月觀察了Dex 預處理對大鼠MIRI 的影響并通過Epac1 拮抗劑ESI09 阻斷Epac1/Rap1 信號通路，分析該機制是否與氧化應激反應及Epac1/Rap1信號通路有關，以期為Dex 在CAD 中的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康成年SD 雄性大鼠32 只，體質(zhì)量225～265 g，購自牡丹江醫(yī)學院，實驗動物許可證號SCXK（黑）2019-003，符合中國動物護理和使用指南。大鼠均飼養(yǎng)在21～25 ℃鼠舍，相對濕度45%～55%，相同光照下自由飲水、進食。Dex（批號：22022317，四川美達康華康公司），Epac1 拮抗劑ESI09（批號：263707-16-0，美國Selleck 公司），Epac1、Rap1 蛋白（批號：A4149、A0975，美國ABclonal 公司），蘇木素—伊紅（HE）染色劑（批號：C0107，Beyotime 公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA試劑盒（批號：23-03-01，北京誠林生物公司），HX-300型動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 動物分組及Dex 預處理 SD 大鼠隨機分為假手術組、模型組、Dex組、抑制劑組，每組8只，大鼠禁食、禁水24 h。Dex 組在建模前30 min 腹腔注射Dex 25 μg/kg，抑制劑組在建模前30 min 及25 min 時分別給予Epac1拮抗劑ESI09 5 mg/kg［4］及Dex 25 μg/kg，假手術組、模型組在建模前30 min 給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 MIRI 模型建立 除假手術組外，各組均建立MIRI模型。通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，取仰臥位，進行氣管插管，使用小動物呼吸機進行機械通氣，監(jiān)測心跳以及心肌缺血開始時的心電圖變化。按照參考文獻進行建模［5］，在大鼠左側(cè)胸骨約第4肋間打開胸腔，找到心臟和血管，分離心包膜，結(jié)扎冠脈左前降支引起心肌缺血，心電圖表現(xiàn)為T 波高聳、ST 段明顯抬高及左心室尖和前壁變白提示心肌缺血模型制備成功。松開結(jié)扎線進行再灌注，持續(xù)2 h。心電圖顯示T 波恢復、ST 段下降50%及左心室尖和前壁變紅提示再灌注成功。假手術組胸腔暴露后，心臟僅穿線而不結(jié)扎左冠狀動脈。

1.4 心肌組織病理學觀察 采用HE染色。選取部分心肌組織，在4%多聚甲醛中固定24～72 h，脫水包埋切片，進行HE 染色，封片后用帶有照相功能的光學顯微鏡觀察采集圖像，每張切片選擇2個視野。

1.5 血清心肌損傷及氧化應激指標檢測 采用ELISA法。取各組大鼠腹主動脈血5 mL，靜置10 min，3 500 r/min離心15 min分離血清，放置于-80 ℃冰箱保存，按照ELISA試劑盒要求檢測血清心肌損傷標志物CK-MB、LDH及氧化應激指標MDA、SOD。

1.6 心肌組織Epac1/Rap1 信號通路相關蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組心肌組織20 mg，參照文獻［6］方法加入裂解液裂解研磨提取總蛋白，離心取上清液，測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%的封閉液室溫封閉2 h，加入Epac1、Rap1 及β-action 一抗稀釋，4 ℃孵育過夜，第2 天洗膜加入相應二抗稀釋，室溫下?lián)u床中作用1 h，TBST 洗4 次，每次15 min，ECL 避光顯色2 min，置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行掃描。以β-action作為內(nèi)參，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 方法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以-x±s表示，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織病理學比較 假手術組心肌纖維排列整齊、邊緣清晰，未見心肌纖維斷裂和細胞間質(zhì)腫脹；模型組心肌纖維出現(xiàn)斷裂，排列紊亂、邊界模糊，有明顯中性粒細胞浸潤，細胞間質(zhì)腫脹明顯；Dex 組與抑制劑組心肌纖維斷裂、中性粒細胞浸潤減少、間質(zhì)腫脹均減輕。

2.2 各組血清心肌損傷標志物CK-MB、LDH比較假手術組、模型組、Dex 組、抑制劑組血清CK-MB 分別為（17.95 ± 0.24）、（23.28 ± 0.32）、（20.32 ±0.28）、（19.18 ± 0.33）ng/mL，血清LDH 分別為（31.69 ± 0.27）、（40.11 ± 0.44）、（39.59 ± 0.55）、（38.50 ± 0.60）ng/L；血清CK-MB、LDH 模型組＞Dex組＞抑制劑組＞假手術組（P均＜0.05）。

2.3 各組血清氧化應激指標MDA、SOD 比較 假手術組、模型組、Dex 組、抑制劑組血清MDA 分別為（4.31 ± 0.09）、（5.17 ± 0.07）、（4.73 ± 0.13）、（4.52 ± 0.33）nmol/L，血清SOD 分別為（177.91 ±2.89）、（137.62 ± 2.90）、（156.91 ± 1.55）、（162.04 ±1.78）ng/L；血清MDA 模型組＞Dex 組＞抑制劑組＞假手術組，血清SOD假手術組＞抑制劑組＞Dex組＞模型組（P均＜0.05）。

2.4 各組心肌組織Epac1/Rap1信號通路相關蛋白表達比較 假手術組、模型組、Dex 組、抑制劑組心肌組織Epac1 蛋白表達分別為0.39 ± 0.07、0.89 ±0.06、0.72 ± 0.03、0.54 ± 0.10，心肌組織Rap1蛋白表達分別為0.05 ± 0.03、1.02 ± 0.01、0.83 ± 0.04、0.63 ± 0.05；心肌組織Epac1、Rap1蛋白表達模型組＞Dex組＞抑制劑組＞假手術組（P均＜0.05）。

3 討論

缺血性心臟病是因冠狀動脈狹窄、供血不足而引起的心臟功能障礙及器質(zhì)性病變，在病理條件下，組織中常發(fā)生缺血再灌注損傷。缺血性損傷主要由厭氧性細胞死亡和再灌注引起，導致廣泛的氧化應激反應，這些反應能夠增加組織損傷，甚至損害整個機體。此外，缺血再灌注損傷還可以在心血管疾病的治療過程中加重原始疾病。因此，尋找預防和改善MIRI的方法并了解其相關機制，對減少患者并發(fā)癥發(fā)生率及病死率，改善患者的預后和生活質(zhì)量具有重要意義。目前臨床中治療缺血性心臟病最有效的方式是恢復的心肌血液供應從而實現(xiàn)再灌注，常用的方法包括溶栓治療［7］、動脈搭橋手術［8］、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術［9］等，但仍有許多患者在治療后因MIRI導致預后不良［10］。因此，有必要在恢復心肌血液供應的同時探索能夠減輕缺血再灌注損傷的方法，以提高缺血性心臟病治療的有效性［11］。本研究通過構(gòu)建大鼠MIRI 模型并給予Dex 預處理發(fā)現(xiàn)，與Dex 組比較，模型組的心肌組織出現(xiàn)明顯的病理損傷，同時血清心肌損傷標志物CK-MB、LDH 的水平升高，提示Dex 腹腔注射預處理能夠減輕缺血再灌注引起的心肌組織損傷。

Dex 具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感神經(jīng)系統(tǒng)活性、心血管穩(wěn)定性、減少術后譫妄等作用，且沒有劑量依賴性，不會產(chǎn)生呼吸抑制，因此廣泛應用于臨床麻醉［12］。ZHANG 等［13］研究顯示，Dex 能夠通過抗氧化應激、抗炎、抗凋亡等機制發(fā)揮器官保護作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術組比較，模型組氧化應激指標MDA 水平升高，SOD 水平降低。在給予Dex 預處理后，MDA 水平有所降低，SOD 水平升高，提示Dex 可降低心肌缺血再灌注的氧化應激程度，從而減輕心肌損傷。臨床研究表明，Dex 的交感神經(jīng)溶解活性能夠通過降低代謝和預防心動過速來降低心肌耗氧量，在心臟手術過程中可降低患者血流動力學異常的風險［14］，同時使接受非心臟手術的心臟病患者受益，減少患者術后并發(fā)癥發(fā)生率［15］。此外，Dex 在腦、肺臟、肝臟及胃腸道等器官中也可起到保護作用，但具體作用機制尚不明確。

Epac1/Rap1 是cAMP 信號通路中的關鍵途徑，Epac 存在Epac1、Epac2 兩種亞型，兩者的表達譜因其組織類型和發(fā)育階段不同而有所不同。例如，Epac1 主要在心臟、腎臟、血管、脂肪組織、中樞神經(jīng)組織和子宮中發(fā)現(xiàn)，而Epac2 在中樞神經(jīng)、胰腺和腎上腺中大量表達［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，Epac1/Rap1 通路與炎癥和氧化應激調(diào)節(jié)有關，同時Epac1/Rap1信號通路在MIRI中發(fā)揮作用，被認為是心血管疾病的潛在治療靶點［18］。當心肌缺血再灌注發(fā)生時，cAMP激活交換蛋白Epac1 及其下游的Rap1，導致氧化應激反應的發(fā)生，從而加重心肌損傷［19］。基于此，本課題組提出一種假設，即Dex 可能通過調(diào)節(jié)Epac1/Rap1 通路減輕氧化應激反應來發(fā)揮心肌保護作用。本研究在MIRI 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織中Epac1、Rap1 蛋白的表達升高；給予Dex 預處理的大鼠心肌組織中的Epac1、Rap1 蛋白表達較模型組減少；而給予Dex 聯(lián)合Epac1 特異性抑制劑ESI09 處理后，大鼠心肌組織中Epac1、Rap1蛋白表達進一步減少，心肌損傷減輕，氧化應激反應得到改善。這提示Dex 可能通過抑制Epac1/Rap1 信號通路的激活減輕氧化應激反應，這為Dex 抑制MIRI 提供了進一步的證據(jù)。

綜上所述，Dex 預處理對大鼠MIRI 具有抑制作用，其機制可能與激活Epac1/Rap1信號通路減輕心肌組織氧化應激有關。然而我們的研究尚有一些局限性，我們沒有探索Epac1 在MIRI 過程中的具體調(diào)控機制，需要進一步的研究來確定Dex 通過影響Epac1所發(fā)揮的治療潛力。