吳茱萸堿通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕大鼠輸血相關(guān)性急性肺損傷*

喬劍 刁春紅 于洋 張娜 常夢遠(yuǎn)

聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院輸血醫(yī)學(xué)科，天津 300142

輸血相關(guān)性急性肺損傷（transfusion-related acute lung injury，TRALI）是一種輸血誘發(fā)的并發(fā)癥，具有起病快、進(jìn)展迅速、致死率高的特點(diǎn)[1-2]。輸血過程中內(nèi)皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞激活誘發(fā)的肺微血管系統(tǒng)炎癥反應(yīng)是TRALI的重要病理基礎(chǔ)[3]。高遷移率族蛋白Bl（high-mobility group box 1，HMGBl）/Toll樣受體4（Toll- like receptor 4，TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路可通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與腎臟、肺臟等器官損傷[4-5]。據(jù)報(bào)道，降低HMGB1可減輕輸血誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞壞死和組織器官損傷[6]；而激活NF-κB信號(hào)可加重小鼠TRALI癥狀[7]。吳茱萸堿具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等功效[8]。研究顯示，吳茱萸堿是急性肺損傷等炎癥性疾病的潛在治療劑[9-10]；且吳茱萸堿可通過抑制HMGB1/NF-κB/TLR4通路，減輕哮喘大鼠氣道炎癥和肺損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究吳茱萸堿對TRALI大鼠肺損傷的影響及機(jī)制。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只健康SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（220±20）g，7周齡，采購于上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2022-0009。于維持屏障環(huán)境且溫度設(shè)為（23±2）℃、濕度設(shè)為（60±5）%動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)大鼠，并每天以12 h黑暗/12 h光照的節(jié)律交替照明。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，批號(hào)：醫(yī)倫審〔2022〕57號(hào)。

1.2 試劑與儀器

吳茱萸堿（純度≥98%，批號(hào)W012140801）采購自成都瑞芬思生物科技有限公司；HMGB1過表達(dá)質(zhì)粒、空載質(zhì)粒采購自山東維真生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（批號(hào)113M4068V）、吉姆薩染液、DAPI染液采購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、蘇木素-伊紅（haematoxylin eosin，HE）染色試劑盒采購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗、小鼠抗大鼠β-actin、TLR4、Ly6g、CD41a、p-NF-κB p65、HMGB1及NF-κB p65一抗、Alexa Fluor? 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor? 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗采購自美國Abcam公司。

FinePointe WBP無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)采購自DSI Buxco公司（美國）；3000A冷凍切片機(jī)采購自達(dá)科為（深圳）醫(yī)療設(shè)備有限公司；P250 FLASH熒光顯微鏡采購自濟(jì)南丹吉爾電子有限公司；SynergyH1酶標(biāo)檢測儀采購自BioTek公司（美國）；VE小型蛋白垂直電泳與印跡系統(tǒng)采購自Cytiva公司（美國）。

2 方法

2.1 制備TRALI大鼠模型并分組給藥

取SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、空載組、吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組，每組12只，除對照組外的其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[12]制備TRALI大鼠模型：以2 mg/kg的劑量腹腔注射LPS，2 h后腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，于股血管處插管抽出1 mL血液（約等于大鼠10%血容量）后輸注1 mL人血漿（速度為4 mL/h，血型為AB型）即完成造模，對照組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水后抽出血液后輸注1 mL生理鹽水。

大鼠于造模前3 d開始分組處理，造模當(dāng)天于造模前30 min進(jìn)行處理，共處理7 d，具體處理方案如下：吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠分別灌胃40、80 mg/kg吳茱萸堿（吳茱萸堿用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備成混懸液，分別以10 mL/kg的劑量灌胃4、8 mg/mL吳茱萸堿混懸液，1次/d，吳茱萸堿的給藥劑量由參考文獻(xiàn)[13]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），同時(shí)尾靜脈注射與吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組等劑量的生理鹽水（1次/3 d）；空載組大鼠灌胃10 mL/kg的0.5%羧甲基纖維素鈉（1次/d），同時(shí)尾靜脈注射空載質(zhì)粒（溶于生理鹽水，劑量遵照說明指導(dǎo)，1次/3 d）；吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠灌胃80 mg/kg吳茱萸堿（以10 mL/kg的劑量灌胃8 mg/mL吳茱萸堿混懸液，1次/d），同時(shí)尾靜脈注射HMGB1過表達(dá)質(zhì)粒（溶于生理鹽水，劑量遵照說明指導(dǎo)，1次/3 d）；對照組、模型組大鼠灌胃10 mL/kg的0.5%羧甲基纖維素鈉（1次/d），同時(shí)尾靜脈注射與吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組等劑量的生理鹽水（1次/3 d）。

2.2 檢測各組大鼠肺功能

最后1次給藥24 h后以無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)檢測各組大鼠每分鐘通氣量（minute ventilation，MV）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、吸氣阻力（resistance inspiratory，Ri），以此評(píng)估其肺功能。

2.3 檢測各組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)與中性粒細(xì)胞百分比、肺濕干比并采集標(biāo)本

肺功能檢測結(jié)束后麻醉各組大鼠，開胸采集其腹主動(dòng)脈血，離心得到血清樣本，存在-80℃?zhèn)溆?；各組大鼠做氣管插管，同時(shí)結(jié)扎其右主支氣管，以1 mL生理鹽水緩慢灌洗左肺，回抽灌洗液再次灌洗，如此重復(fù)3次后離心灌洗液得肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）存在-80℃?zhèn)溆?；剩下的?xì)胞沉淀以PBS緩沖液混勻，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中滴加20 μL，行吉姆薩染色，于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)其中細(xì)胞總數(shù)與中性粒細(xì)胞數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞百分比=中性粒細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

得到BALF后每組隨機(jī)選出6只大鼠取其雙肺，稱量右肺濕重（W1），然后將其置于80℃烘箱中烘干，稱重其干重（W2），計(jì)算肺濕干比=W1/W2。

每組剩余的6只大鼠取其雙肺，自右肺上剪下約0.5 g肺組織，以RIPA緩沖液提取各組蛋白后以BCA法測定其濃度，存在-80℃?zhèn)溆?；剩余右肺組織包埋后速凍成塊，以在冷凍切片機(jī)切片，以預(yù)冷4%多聚甲醛固定30 min后存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理形態(tài)并進(jìn)行病理評(píng)分

取2.3中各組大鼠肺組織冷凍切片以預(yù)冷蒸餾水漂洗，行HE染色，于顯微鏡下觀察并任選6個(gè)視野采集圖像，根據(jù)Holfbauer評(píng)分[14]進(jìn)行病理評(píng)分，分值越大表示損傷約嚴(yán)重，最大為4分。

2.5 免疫熒光染色檢測各組大鼠肺組織內(nèi)血小板與中性粒細(xì)胞聚集情況

取2.3中的各組大鼠肺組織冷凍切片以預(yù)冷蒸餾水漂洗、血清封閉、抗原修復(fù)、分別孵育小鼠抗大鼠Ly6g、CD41a一抗（每種抗體孵育3張切片）、TBST漂洗、孵育相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，洗片后封片觀察，于熒光顯微鏡下采集任意6個(gè)視野圖像，用Image-J圖像分析系統(tǒng)定量圖像中綠色和紅色熒光強(qiáng)度，取6個(gè)視野平均值可得切片中血小板-中性粒細(xì)胞合光密度。

2.6 ELISA法檢測各組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平

取2.3中的各組大鼠血清及BALF解凍后采用ELISA檢測試盒分別測定其中TNF-α、IL-1β水平。

2.7 免疫印跡檢測各組大鼠肺組織HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取2.3中的各組大鼠肺組織蛋白樣品液解凍后每組取20 μg蛋白樣本，于120V恒壓下進(jìn)行電泳后濕轉(zhuǎn)，剪下待測蛋白HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65和內(nèi)參蛋白β-actin條帶，封閉其非特異位點(diǎn)后行抗原抗體反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯色后攝取圖像，用Image-J圖像分析系統(tǒng)定量各組蛋白灰度值后計(jì)算其相對表達(dá)，公式：相對表達(dá)=待測蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 吳茱萸堿對各組大鼠肺功能的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF顯著降低（P＜0.05），Ri顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF均升高（P＜0.05），Ri均降低（P＜0.05），空載組大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF、Ri無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF升高（P＜0.05），Ri降低（P＜0.05）。與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF降低（P＜0.05），Ri升高（P＜0.05）。各組大鼠肺功能指標(biāo)MV、Ri、PEF差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.348、21.521、19.341，P＜0.001），見圖1。

圖1 各組大鼠肺功能指標(biāo)MV、Ri、PEF比較

2 吳茱萸堿對各組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)與中性粒細(xì)胞百分比的影響

與對照組相比，模型組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比均降低（P＜0.05），空載組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比升高（P＜0.05）。各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.412、17.943，P＜0.001），見圖2。

圖2 各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比的比較

3 吳茱萸堿對各組大鼠肺水腫及肺組織病理形態(tài)的影響

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰正常，肺組織無水腫炎癥、細(xì)胞浸潤、充血等病理損傷癥狀。模型組大鼠肺泡壁增厚且其間隔加寬，肺組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤并產(chǎn)生出血、水腫等病理損傷癥狀，與對照組相比，大鼠肺濕干比和肺組織病理評(píng)分顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織上述病理損傷癥狀均減輕，肺濕干比和肺組織病理評(píng)分均降低（P＜0.05）；空載組大鼠肺組織上述病理損傷癥狀未見減輕，肺濕干比和肺組織病理評(píng)分無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織上述病理損傷癥狀減輕，肺濕干比和肺組織病理評(píng)分降低（P＜0.05）。與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠肺組織上述病理損傷癥狀加重，肺濕干比和肺組織病理評(píng)分升高（P＜0.05）。各組大鼠肺濕干比和肺組織病理評(píng)分差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.250、18.439，P＜0.001），見圖3、圖4。

圖3 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理形態(tài)（×200）

圖4 各組大鼠肺濕干比和肺組織病理評(píng)分比較

4 吳茱萸堿對各組大鼠肺組織內(nèi)血小板與中性粒細(xì)胞聚集程度的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度均降低（P＜0.05），空載組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度升高（P＜0.05）。見圖5、表1。

表1 各組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度（n=6，）

表1 各組大鼠肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度（n=6，）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與吳茱萸堿低劑量組相比，cP＜0.05；與吳茱萸堿高劑量組相比，dP＜0.05。

組別合光密度對照組21.82±0.70模型組 33.14±2.65a吳茱萸堿低劑量組 27.89±1.21b吳茱萸堿高劑量組 22.21±0.83bc空載組34.02±2.33吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組 32.78±2.42d F 21.439 P＜0.001

圖5 免疫熒光染色檢測各組大鼠肺組織內(nèi)血小板與中性粒細(xì)胞聚集情況（×200）

5 吳茱萸堿對各組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.05），空載組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠baLF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平（n=12，）

表2 各組大鼠baLF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平（n=12，）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與吳茱萸堿低劑量組相比，cP＜0.05；與吳茱萸堿高劑量組相比，dP＜0.05。

組別baLF血清TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）對照組13.58±3.2423.62±3.7223.12±4.1532.64±5.12模型組 78.75±11.57a 94.56±12.91a 105.84±13.42a 129.41±16.53a吳茱萸堿低劑量組 46.86±13.06b 59.84±9.22b 66.12±9.64b 81.84±15.24b吳茱萸堿高劑量組 15.97±2.86bc 26.03±3.52bc 27.11±4.83bc 37.98±6.15bc空載組 79.52±12.73 92.64±14.23108.57±16.12132.13±17.01吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組 73.10±12.54d 89.05±13.48d 97.93±14.40d 120.96±13.93d F 23.46819.28529.73116.734 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

6 吳茱萸堿對各組大鼠肺組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05），空載組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65無明顯變化（P＞0.05）；與吳茱萸堿低劑量組相比，吳茱萸堿高劑量組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組相比，吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65均升高（P＜0.05）。見圖6、表3。

表3 各組大鼠肺組織HMGb1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κb p65/NF-κb p65（n=6，）

表3 各組大鼠肺組織HMGb1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κb p65/NF-κb p65（n=6，）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與吳茱萸堿低劑量組相比，cP＜0.05；與吳茱萸堿高劑量組相比，dP＜0.05。

組別HMGb1/β-actinTLR4/β-actinp-NF-κb p65/NF-κb p65對照組 0.13±0.020.21±0.040.30±0.05模型組 0.97±0.12a 1.08±0.15a 1.16±0.18a吳茱萸堿低劑量組 0.56±0.05b 0.65±0.06b 0.73±0.11b吳茱萸堿高劑量組 0.15±0.03bc 0.24±0.02bc 0.33±0.04bc空載組 0.99±0.141.06±0.171.17±0.19吳茱萸堿高劑量+HMGB1過表達(dá)組 0.92±0.16d 1.04±0.12d 1.12±0.13d F 20.13615.21922.438 P＜0.001＜0.001＜0.001

圖6 免疫印跡檢測各組大鼠肺組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

討 論

發(fā)生TRALI時(shí)應(yīng)立即停止輸血，進(jìn)行及時(shí)治療，如今臨床中以氧療、機(jī)械通氣改善氧合等對癥治療手法為主，但患者死亡率仍然較高，但除此之外尚無其他特別有效且可靠的特異性治療方法[15]。TRALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，“二次打擊”機(jī)制得到了廣泛認(rèn)同及大量研究支持，第一次打擊是由嚴(yán)重的感染或膿血癥引起，導(dǎo)致內(nèi)皮和中性粒細(xì)胞激活，第二次打擊是由輸入的血液制品引起，血液制品中的白細(xì)胞抗體和患者體內(nèi)白細(xì)胞產(chǎn)生了抗原-抗體免疫反應(yīng)，使內(nèi)皮和中性粒細(xì)胞進(jìn)一步激活，加重了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的打擊損傷，最終導(dǎo)致TRALI發(fā)生[16]。本實(shí)驗(yàn)在上述理論的指導(dǎo)下采用了腹腔注射LPS聯(lián)合輸注人血漿的方法制備TRALI模型，結(jié)果顯示造模大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均高于正常大鼠，且造模大鼠肺組織出現(xiàn)出血、水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤與肺泡壁增厚、間隔加寬等病理癥狀，造成大鼠肺功能受損，揭示TRALI大鼠模型制備成功。

吳茱萸堿作為吳茱萸中一種天然生物堿，可通過抗菌消炎、提高免疫等活性在潰瘍性結(jié)腸炎、胃潰瘍、肺炎等疾病中發(fā)揮治療作用[17-19]。董悅等[20]發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可作為香連片的起效成分之一，在新型冠狀病毒肺炎的治療中發(fā)揮作用。張瑩等[9]發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿可通過抑制NF-κB通路，減少炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-6）釋放，減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷；FAN等[10]的研究顯示，吳茱萸堿可抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)，并通過抑制NF-κB通路活化改善肺組織的異常狀態(tài)，抑制體外和體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。本文結(jié)果顯示，以吳茱萸堿處理TRALI大鼠，相比正常大鼠，TRALI大鼠肺功能指標(biāo)MV、PEF升高，Ri降低，表明吳茱萸堿可改善大鼠肺功能；同時(shí)，吳茱萸堿可降低TRALI大鼠肺濕干比、肺組織病理評(píng)分、肺組織內(nèi)血小板-中性粒細(xì)胞合光密度、BALF細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平，減輕肺組織病理損傷癥狀，表明吳茱萸堿可抑制中性粒細(xì)胞激活，減少促炎因子釋放，減輕TRALI大鼠肺組織炎癥損傷及肺水腫癥狀，揭示吳茱萸堿在TRALI的治療中有一定的應(yīng)用前景。

HMGBl/TLR4/NF-κB通路可通過調(diào)控炎癥介導(dǎo)各種因素引發(fā)的肺損傷疾病的發(fā)生發(fā)展，下調(diào)HMGBl/TLR4通路蛋白表達(dá)可阻滯NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生釋放，減輕肺損傷[21-22]。研究顯示，TLR4在TRALI的病理過程中表達(dá)增強(qiáng)[23]，且降低HMGB1表達(dá)可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和組織器官免于輸血引發(fā)的炎性損傷[6]；本研究結(jié)果顯示，TRALI大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均升高，表明TRALI大鼠肺組織中HMGBl/TLR4/NF-κB通路被激活。WANG等[11]的研究顯示吳茱萸堿對哮喘大鼠氣道炎癥和肺組織重塑的改善作用是通過抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信號(hào)通路激活實(shí)現(xiàn)的，表明抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信號(hào)通路是吳茱萸堿發(fā)揮生物學(xué)活性的靶點(diǎn)之一。在本研究中，吳茱萸堿處理可降低TRALI大鼠肺組織中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65比值，表明吳茱萸堿處理可抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信號(hào)通路活化。因此，推測吳茱萸堿對TRALI大鼠肺損傷的改善機(jī)制可能與阻止HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。為了驗(yàn)證此推測，本研究以吳茱萸堿處理TRALI大鼠的同時(shí)過表達(dá)HMGB1，結(jié)果顯示，過表達(dá)HMGB1可減弱吳茱萸堿單獨(dú)處理對TRALI大鼠中性粒細(xì)胞激活的抑制作用，消除其對大鼠肺組織炎癥損傷及肺水腫癥狀的減輕作用，最終逆轉(zhuǎn)吳茱萸堿對大鼠肺功能的改善作用，揭示吳茱萸堿改善TRALI大鼠臨床癥狀是通過下調(diào)HMGB1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，吳茱萸堿可下調(diào)HMGB1、TLR4表達(dá)并減弱NF-κB磷酸化，進(jìn)而減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)釋放，抑制輸血誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活，減輕TRALI大鼠肺組織炎癥損傷，改善其肺水腫及肺功能障礙癥狀，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)激活可能是吳茱萸堿改善TRALI大鼠臨床癥狀的藥理機(jī)制，本文證實(shí)了吳茱萸堿可作為TRALI的候選治療藥物，表明其具有一定的研發(fā)價(jià)值，對于保障安全輸血及改善TRALI預(yù)后起到一定積極作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突