康復新液調控巨噬細胞極化防治大鼠急性放射性口腔黏膜炎

董克臣，張萌，梁毅，李松，費新雄

作者單位：黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學院附屬醫(yī)院）頭頸腫瘤內科，湖北 黃石435200

急性放射性口腔黏膜炎（ROM）是口腔黏膜受射線照射后出現的以紅斑和潰瘍?yōu)橹饕卣鞯募毙匝装Y［1］。急性ROM是頭頸部腫瘤放療最常見的并發(fā)癥之一，也是主要的劑量限制性毒性反應［2］。現有理論認為，炎癥反應在急性ROM中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞是口腔中重要的固有免疫細胞，生理情況下處于靜息狀態(tài)，維持口腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。放射刺激可使口腔黏膜中的巨噬細胞迅速被極化為M1和M2兩種表型［3-5］。M1型（經典活化）巨噬細胞高表達促炎因子，介導促炎反應，造成組織損傷。M2型（替代性活化）巨噬細胞高表達抗炎因子，介導抗炎反應，促進組織修復［6-7］。因此，抑制巨噬細胞M1型極化，促進M2型極化可能為防治急性ROM的新策略。康復新液富含表皮生長因子、多元醇類及多種氨基酸等活性成分，對急性ROM具有較好的防治作用，文獻報道其機制主要與抗氧化、抗炎及免疫調節(jié)等相關［8］，能否調控巨噬細胞極化從而改善放射誘導的口腔黏膜炎癥尚不明確。本研究于2021年7月至2022年4月以SD大鼠為研究對象，通過體外照射模擬急性ROM，探討康復新液對大鼠急性ROM的防治效果及對巨噬細胞極化的影響，旨在為臨床用藥提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SD大鼠54只，雌性，SPF級，周齡范圍6～8周，體質量（200±20）g，由湖北省實驗動物研究中心提供，使用許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。試驗前常規(guī)飼喂5 d，降低應激反應。飼養(yǎng)條件：自由進食水，溫度22 ℃，濕度范圍45%～55%，自然光照。將大鼠用苦味酸進行體表標記后使用隨機數字表法分成對照組、照射組和給藥組，每組各18只。給藥組［9］：康復新液5 mL/kg，分3次滴入左側頰黏膜，可咽下，間隔2 h，每次給藥后禁食、禁水30 min，從照射第1天開始連續(xù)給藥21 d。照射組與對照組：等量生理鹽水，用法同給藥組。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試藥及儀器 康復新液（四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司，批號B190219）；細胞因子白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-10及轉化生長因子-β（TGF-β）ELISA試劑盒（PeproTech公司）；大鼠單抗CD86、山羊多抗CD206（Santa Ctuz）；Cy3標記山羊抗小鼠IgG、Cy3標記驢抗兔IgG、異硫氰酸熒光素標記驢抗山羊IgG（Jackson ImmunoResearch公司）；Thunderbird Sybr qPCR Mix試劑盒（TOYOBO公司）；Trizol（invitrogen公司）；RevertAID-TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Fermentas公司）；放療定位機（GE公司）；直線加速器（瓦里安公司）；紫外分光光度計（Nanodrop公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS公司）；PCR儀（BIO-RAD公司）。

1.3 模型制作［10］使用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于治療床，用自制鉛防護罩撐開大鼠口腔暴露頰黏膜，鉛皮遮擋頭部及身體其他部位。定位大鼠左側頰黏膜，源皮距=100.0 cm，射野大小1.5 cm×1.5 cm。采用6MV-X射線單次大劑量（30 Gy）照射，劑量率200 Gy/min。每次照射9只，分4次照射單純照射組和給藥組大鼠共36只。造模期間大鼠未出現身體扭動，照射后未出現共濟失調、抽搐、提尾時身體旋轉反射及截癱等體征。

1.4 HE染色 照射后第5、14、21天用頸椎脫臼法處死大鼠，每次各組處置6只，剝離左側頰黏膜，置于-80 ℃冰箱備用。將大鼠頰黏膜組織置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，顯微鏡觀察病理形態(tài)并采集圖像。

1.5 免疫熒光法檢測巨噬細胞CD86/Ibal和CD206/Ibal表達 將包埋好的黏膜組織進行切片、破膜、滅活內源性過氧化氫酶，分別加入CD86/Ibal（200∶1）、CD206/Ibal（100∶1），4 ℃孵育過夜，加入Cy3標記山羊抗鼠/驢抗兔和異硫氰酸熒光素標記山羊抗兔/驢抗山羊二抗（1∶100）室溫孵育0.5 h，最后進行封片。熒光顯微鏡下計數雙標記陽性細胞數，每張切片選擇4個不重復的視野，取平均值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測頰黏膜組織細胞因子 取照射后第14天大鼠頰黏膜組織，用生理鹽水浸泡、清洗干凈，加入兩倍的生理鹽水，置于勻漿器中充分勻漿。離心后取上清液用于細胞因子檢測。細胞因子IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求在酶標儀中進行操作，經標準曲線計算出各樣本中細胞因子水平。

1.7 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測M1和M2巨噬細胞相關標記物基因表達 取照射后第14天頰黏膜組織進行RT-PCR。用1 mLTrizol抽提50 mg總RNA，紫外分光光度計進行定量及純度測定（A260/A280=1.6～1.8），取0.5 μg總RNA行反轉錄，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。取1 μL逆轉錄產物行PCR，反應體系：2×Sybr qPCR Mixture 5 μL，各基因對應正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free water 2 μL。反應條件：95 ℃預變性60 s，95 ℃變性3 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)。引物序列如下：β-肌動蛋白（β-actin）正向引物5'-CTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3'，反向引物5'-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3'；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）正向引物5'-GTGAAGGGACTGAGCTGTTAGA-3'，反向引物5'-GCACTTCTGCTCCAAATCCA-3'；共刺激分子CD86正向引物5'-GAGAAGACCCAATGCCACC-3'，反向引物5'-TGCCCATCACGACAGGAA-3'；精氨酸酶1（Arginase 1，Arg1）正向引物5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'，反向引物5'-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3'；CD206正向引物5'-GGGTTCACCTGGAGTGATGG-3'，反向引物5'-ATTGTCTTGAGGAGCGGGTG-3'。應用2-ΔΔCt法［11］計算各基因相對β-actin的表達量。

1.8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 將大鼠頰黏膜組織剪碎，加入適量裂解液進行勻漿裂解，離心后取上清液，參照BCA法測定蛋白濃度。20 μg蛋白煮沸后SDS-PAGE電泳，轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液浸泡NC膜，室溫搖床封閉1.5 h。加入一抗4 ℃過夜，TBST溶液洗膜3次，加入倍比稀釋的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，ECL顯色曝光，掃描膠片并保存。使用Image J軟件進行灰度值分析，以β-actin為內參照，并計算與β-actin的比值。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，滿足正態(tài)分布的計量資料數據以表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），均數間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠一般情況比較 實驗期間所有大鼠均存活，照射組和給藥組大鼠可見口鼻部皮膚脫毛改變。對照組飲水、進食量無變化，體質量增加；照射組照射后第4～9天飲水、進食量減少，體質量下降，第15天以后飲水、進食量恢復，體質量增加；給藥組照射后第7～10天飲水、進食量減少，體質量下降，第11天以后飲水、進食量恢復，體質量回升。

2.2 三組大鼠病理觀察比較 對照組：上皮完整，層次清晰，基底層緊密排列，黏膜下層無炎細胞浸潤。單純照射組：第5天見假膜形成，上皮結構破壞，固有層見膠原水腫，黏膜下層見炎細胞；第14天上皮脫落、崩解、潰瘍，黏膜下層毛細血管擴張，大量炎細胞浸潤；第21天上皮結構破壞，黏膜下見大量炎細胞、新生血管和成纖維細胞。給藥組：上皮結構尚完整，層次清晰；第5天見少許炎細胞浸潤，毛細血管輕度擴張；第14天炎性細胞增多，血管充血加重，見少量膠原纖維；第21天炎癥消退，成纖維細胞增生，見大量新生血管和纖維組織。

2.3 康復新液對大鼠頰黏膜組織炎性因子的影響 由病理觀察可知，照射后第14天大鼠頰黏膜組織損傷最為嚴重，與李春陽等［12］結論高度吻合，因此本研究選擇照射后第14天作為主要觀測時點。與對照組比較，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織促炎因子IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.001），抗炎因子TGF-β和IL-10水平也明顯升高（P＜0.001）；與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織IL-6和TNF-α水平明顯下降（P＜0.001），而TGF-β及IL-10水平則顯著升高（P＜0.001），見表1。

表1 各組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10水平比較/（μg/L，）

表1 各組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10水平比較/（μg/L，）

注：IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TGF-β為轉化生長因子-β。①與對照組相比，P＜0.05。②與照射組相比，P＜0.05。

IL-10 0.58±0.08 0.96±0.14①1.44±0.21①②47.69＜0.001組別對照組照射組給藥組F值P值鼠數6 6 6 IL-6 0.46±0.04 1.12±0.16①0.74±0.08①②58.79＜0.001 TNF-α 0.12±0.02 0.68±0.10①0.34±0.06①②102.34＜0.001 TGF-β 0.32±0.06 0.75±0.12①1.26±0.20①②68.72＜0.001

2.4 康復新液對巨噬細胞計數影響 免疫熒光雙標記試驗結果顯示，對照組中未見CD86/Ibal陽性細胞，照射組CD86/Ibal陽性細胞數為（152.54±6.95），給藥組CD86/Ibal陽性細胞數為（99.51±3.61），ANOVA分析顯示各組間均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。對照組中無CD206/Ibal陽性細胞，照射組中CD206/Ibal陽性細胞數為（88.26±3.10），給藥組CD206/Ibal陽性細胞數為（129.99±2.61），ANOVA分析顯示各組間均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 康復新液調控巨噬細胞極性變化 與對照組比較，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1和CD206 mRNA表達均顯著升高（P＜0.001）。與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS和CD86 mRNA表達明顯下降（P＜0.001），而Arg1和CD206 mRNA表達顯著升高（P＜0.001）。見表2。蛋白印跡法質結果顯示，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1和CD206蛋白表達水平較空白對照組均顯著升高（P＜0.001）。與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS和CD86蛋白表達顯著下降（P＜0.001），Arg1和CD206蛋白表達明顯上調（P＜0.001）。見圖1。

圖1 三組大鼠頰黏膜組織蛋白質印跡法檢測結果

表2 各組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1與CD206 mRNA 表達水平比較/

表2 各組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1與CD206 mRNA 表達水平比較/

注：iNOS為誘導型一氧化氮合酶，CD86為共刺激分子86，Arg1為精氨酸酶1，CD206為共刺激分子206。①與對照組相比，P＜0.05。②與照射組相比，P＜0.05。

組別對照組照射組給藥組F值P值CD206 0.004 23±0.000 38 0.006 82±0.000 56①0.008 24±0.000 86①②62.14＜0.001鼠數6 6 6 iNOS 0.004 43±0.000 25 0.006 82±0.000 41①0.005 94±0.000 38①②70.13＜0.001 CD86 0.003 42±0.000 20 0.005 84±0.000 43①0.004 22±0.000 35①②78.76＜0.001 Arg1 0.004 24±0.000 16 0.005 20±0.000 55①0.006 61±0.000 53①②42.00＜0.001

3 討論

中醫(yī)認為放射線為火熱毒邪，急性ROM的基本病機為熱毒傷陰，臨床多見陰虛津虧證，兼見熱證、氣滯血瘀等證，治療以養(yǎng)陰潤燥、清熱解毒及涼血化瘀等為原則［13-15］?？祻托乱菏敲乐薮篌沟囊掖继崛∥铮瑸榧冎兴幹苿?，具有解毒消腫、養(yǎng)陰生肌、通利血脈等功效［16］，防治急性ROM符合“熱毒傷陰”的病機。本研究中，單次大劑量照射后照射組和給藥組大鼠均出現飲食量、進水量減少及體質量下降等改變，病理觀察可見頰黏膜急性炎性病變，提示造模成功。與對照組比較，給藥組大鼠飲食量、進水量減少及體質量下降的程度較輕且時間相對滯后，HE染色可見頰黏膜病理損傷較輕。表明康復新液能改善急性ROM大鼠的一般情況，減輕頰黏膜炎癥。

目前，急性ROM的病理機制尚未完全闡明。根據Sonis［17-18］理論，炎性反應幾乎貫穿急性ROM的始終，由巨噬細胞分泌的炎性因子在此過程中起著關鍵作用。促炎因子IL-6和TNF-α等與口腔黏膜損傷程度呈正相關，而抗炎因子IL-10和TGF-β可抑制過度的炎性反應，對口腔黏膜具有保護作用［19-21］。筆者研究發(fā)現，照射后照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β水平均顯著升高，病理切片見不同程度的炎性改變，表明促炎因子與抗炎因子共同參與大鼠急性ROM。給予康復新液治療后大鼠頰黏膜炎癥明顯減輕，IL-6和TNF-α水平顯著下降，而IL-10和TGF-β水平明顯升高。提示康復新液防治大鼠急性ROM可能與抑制促炎因子，促進抗炎因子分泌相關。

巨噬細胞廣泛分布于口腔黏膜，在不同環(huán)境因素刺激下可分化出不同表型，表現出功能上的差異，這種現象被稱為極化［22］?；罨木奘杉毎蓸O化為M1和M2兩種表型。巨噬細胞的極化現象可看作細胞表面標志物表達的改變，如M1型巨噬細胞可高表達共刺激分子CD86及特異性標志物iNOS，承擔促炎功能，并分泌大量的促炎因子如IL-6和TNF-α等，促進炎癥反應。M2型巨噬細胞高表達共刺激分子CD206及特異性標志物Arg1，產生抗炎因子如IL-10和TGF-β等，發(fā)揮抗炎作用，并參與修復損傷組織［23-25］。本研究顯示，康復新液可抑制大鼠頰黏膜組織M1型巨噬細胞特異性標志物iNOS和CD86蛋白和mRNA表達，促進M2型巨噬細胞特異性標志物Arg1和CD206蛋白和mRNA表達。免疫熒光試驗顯示，康復新液可減少大鼠頰黏膜組織M1型（CD86陽性）巨噬細胞數量，增加M2型（CD206陽性）巨噬細胞數量，提示康復新液可抑制巨噬細胞M1極化，促進M2極化。

綜上所述，康復新液對大鼠急性ROM有較好的防護作用，可改善大鼠的一般情況，減輕口腔黏膜炎癥。推測康復新液的放射防護作用可能與抑制大鼠頰黏膜組織中巨噬細胞M1極化，促進M2極化，從而下調促炎因子IL-6和TNF-α，促進抗炎因子TGF-β和IL-10 mRNA和蛋白表達相關。急性ROM的機制極其復雜，康復新液防治大鼠急性ROM的確切機制及本試驗數據的合理性有待進一步深入研究。