丙泊酚通過SFRP1-Wnt 信號通路抑制腸癌細胞增殖侵襲的機制研究

梁偉華,蔣淼

上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院(復旦大學附屬華山醫(yī)院北院寶山分院) 麻醉科 上海市,200431

結(jié)直腸癌為消化道常見腫瘤之一[1]。由于其起病隱匿,患者就診已為中晚期,當前手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療療效仍然不佳、預后也不理想[2]。據(jù)報道結(jié)直腸癌晚期患者的5 年生存率僅為13.1 %[3];因此,探究結(jié)直腸癌發(fā)生的致病機理,挖掘相關(guān)干預靶點成為臨床亟待解決的問題。丙泊酚(Propofol) 為臨床手術(shù)常用麻醉劑。近年研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚除了具有麻醉效果外,還具備抗焦慮、神經(jīng)保護、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤活性[4-7]。已有多篇文獻報道丙泊酚可抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[8-10],但對結(jié)直腸癌細胞作用報道不多。

Wnt/β-catenin 信號通路為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動信號通路。最新研究發(fā)現(xiàn)Wnt 上游抑制因子分泌卷曲相關(guān)蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1,SFRP1) 可因Zeste 同源2 增強子(enhancer of Zeste homologue 2,EZH2) 介導的組蛋白3 甲基化修飾導致表觀沉默,從而活化Wnt/β-catenin 信號通路[11-14]。有證據(jù)表明丙泊酚在脂肪干細胞、肺癌細胞 中可阻斷Wnt/β-catenin 信號 通路[15-16],但在結(jié)直腸癌中是否存在此效應(yīng)尚不明確。本研究擬明確丙泊酚對腸癌細胞增殖和侵襲的抑制作用,揭示丙泊酚對Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)節(jié)機制,為丙泊酚的抗腫瘤活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細胞SW620 和HT29 購自ATCC。丙泊酚購自Sigma Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 結(jié)直腸癌細胞SW620 和HT29 購自ATCC。采用含100 U/mL 青霉素、100 U/ml 鏈霉素和10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃,含5 % CO2且濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為對照組(為生理鹽水)和丙泊酚組(其工作終濃為10 μg/mL)。

1.2.2 細胞增殖試驗(CCK-8) 將SW620 細胞和HT29 細胞制成單細胞懸液,分別接種于96 孔板,每孔1 000 個細胞,將接種好的96 孔板放入培養(yǎng)箱中。待24 h 細胞貼壁后,對照組及丙泊酚組各孔內(nèi)更換對照及含丙泊酚培養(yǎng)液,并于加藥時、加藥24、48 和72 h 將10 %的CCK-8 試劑加入待檢測孔中,37 ℃孵育4 h,每個時間點設(shè)置6個復孔。采用酶標儀檢測各時間點各孔的吸光度(A450nm)。

1.2.3 細胞劃痕實驗 于6 孔板培養(yǎng)各組細胞(1.0 ×105個/孔) 12 h,棄培養(yǎng)液,于底部劃線,除去劃痕間細胞,測量劃痕間距(d),記為d0h。培養(yǎng)48 h 后,再次測量,記為d48h。劃痕愈合率(%)=(d0h-d48h)/d0h×100 %。

(1) 工程案例一。案例引自文獻[9]，滑坡體為黏土和粉質(zhì)黏土為主夾雜碎石，坡體傾斜度為20°，土體重度γ=18 kN/m3，土體抗剪強度參數(shù)c=130 kPa，φ=15°，抗滑樁截面尺寸a=2 m，b=3 m，抗滑樁受荷段長H=10.5 m。由不平衡荷載傳遞系數(shù)法計算出抗滑樁處的設(shè)計滑坡體推力為1 076.6 kN/m。

縣級思想宣傳機構(gòu)發(fā)展緩慢，更有甚者舉步維艱，公眾閱讀習慣的改變使得縣級傳統(tǒng)媒體快速流失用戶，受到新媒體猛烈的打擊。短視頻可謂是更為徹底的手機原生態(tài)產(chǎn)品，流量大規(guī)模從傳統(tǒng)媒體傾瀉般涌入短視頻，儼然已是當今無可辯駁的事實。同時，可以預見的是，2020年5G大規(guī)模商用之后，用戶觀看視頻時長還將大幅度上升，大概率會出現(xiàn)視頻APP使用時間多于社交通信APP的情況，而社交通信類APP也面臨視頻化和三維化的發(fā)展壓力?；诖耍桃曨l建設(shè)將是縣級融媒體建設(shè)不可或缺的戰(zhàn)略重鎮(zhèn)。

1.2.6 染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR (ChIP-qPCR) 按廠家說明書進行操作,通過DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)、酶處理消化染色質(zhì)為小片段、利用EZH2 及H3K27Me3 抗體將與目的蛋白相結(jié)合的DNA 片段沉淀下來,再通過洗脫、解交聯(lián)及純化DNA,利用qPCR 檢測EZH2 及H3K27Me3 沉淀DNA 中靶基因的含量。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR 按總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 按試劑盒說明書操作。Real-time 定量PCR 條件為: 95 ℃10 min 后,95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 個循環(huán)。Real-time 定量PCR使用ABI 7500 儀器進行。根據(jù)待測標本的Ct 值,以GAPDH 作為內(nèi)參照,采用2-△△Ct法計算相對表達倍數(shù)變化。各引物如下: E-cadherin 正義鏈為5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,反義鏈為 5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;N-cadherin 正義鏈為5′-TGCGGTACAGTGTAACTGGG-3′,反義鏈為5′-GAAACCGGGCTATCTGCTCG-3′;β-catenin 正義鏈為5′-AGCTTCCAGACACGCTATCAT-3′,反義鏈為5′-CGGTACAACGAGCTGTTTCTAC-3′;c-Myc正義鏈為5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′,反義鏈為5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′;CyclinD1正義鏈為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′,反義鏈為5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′;SFRP1正義鏈為5′-ACGTGGGCTACAAGAAGATGG-3′,反義鏈為5′-CAGCGACACGGGTAGATGG-3′。

數(shù)據(jù)報出率：共送樣6596件，報出項目數(shù)91802個，未報出項目數(shù)542個，各元素的報出率均在97.86%～100%之間。

1.3 統(tǒng)計學方法

細胞劃痕實驗表明,丙泊酚組細胞遷移愈合面積顯著低于對照組(P＜0.01),提示丙泊酚抑制細胞遷移運動能力(圖1)。Tranwell 小室實驗發(fā)現(xiàn),丙泊酚組穿膜細胞數(shù)量顯著低于對照組(P＜0.01),提示丙泊酚抑制細胞侵襲能力(圖2)。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制腸癌細胞增殖

CCK-8 細胞增殖試驗表明: 腸癌細胞SW620及HT29 丙泊酚處理24 h 后,丙泊酚組增殖活性顯著低于對照組細胞(表1,P＜0.0001)。

1.2.4 Transwell 小室試驗 腸癌細胞制成單細胞懸液并調(diào)整濃度至5 ×104個/mL 接種于Transwell小室(鋪有Matrigel 膠),下室加入正常含胎牛血清完全培養(yǎng)基700 μL,培養(yǎng)48 h 后取出小室。預冷甲醇,固定10 min,在PBS 中用棉簽刮去小室上層細胞后,進行結(jié)晶紫染色,ddH2O 清洗。倒置顯微鏡取3 個視野,計數(shù)取均值。

表1 丙泊酚組和對照組細胞增殖活性(A450nm) 的比較(n=6)

2.2 丙泊酚抑制腸癌細胞轉(zhuǎn)移與侵襲

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件比較不同組別間的差異,2 組獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗。取P＜0.05 為假設(shè)檢驗有統(tǒng)計學意義的標準。

圖1 對照組與丙泊酚組腸癌細胞劃痕愈合能力比較(×100)

圖2 對照組與丙泊酚組腸癌細胞侵襲能力比較(×200)

2.3 丙泊酚抑制腸癌細胞Wnt 信號通路相關(guān)基因表達

隨著時代的發(fā)展，馬克思主義思想中的生態(tài)哲學愈來愈得到人們的重視。曾繁仁的生態(tài)美學思想就是繼承發(fā)展了馬克思恩格斯唯物實踐存在論中的生態(tài)理論。通過對馬克思恩格斯創(chuàng)立的實踐觀的研究，證明了其是一種富有革命精神的生態(tài)人文主義，具有濃郁的生態(tài)內(nèi)涵，因此我們把它作為現(xiàn)階段建設(shè)生態(tài)觀和生態(tài)審美觀的理論基礎(chǔ)是完全可行的。

圖3 對照組及丙泊酚組Wnt 信號通路相關(guān)基因表達比較

表2 對照組及丙泊酚組Wnt 信號通路相關(guān)基因表達比較(n=3)

2.4 丙泊酚減弱EZH2 對SFRP1 抑制效應(yīng)

利用ChIP-qPCR 方法,我們檢測了對照組細胞和丙泊酚組細胞中,EZH2、H3K27Me3 于SFRP1 啟動子富集程度的變化。如表3 所示,丙泊酚組SW620 及HT29 細胞的EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 啟動子富集程度顯著低于對照組細胞(P＜0.01),上述結(jié)果提示EZH2 對SFRP1 轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱。

我們利用qPCR 檢測對照組及丙泊酚組細胞Wnt 信號通路相關(guān)基因表達變化,如表2、圖3 所示,丙泊酚組腸癌細胞較對照組,E-cadherin 顯著上調(diào)(P＜0.0001),而N-cadherin 表達減低(P＜0.0001),提示丙泊酚促進了腸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時,Wnt 信號通路靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1 與對照組比較明顯下調(diào) (P＜0.0001)。Wnt 信號通路上的抑制因子SFRP1 表達顯著上調(diào)(P＜0.0001)。

表3 對照組及丙泊酚組EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 啟動子富集程度比較(n=3)

3 討論

結(jié)直腸癌為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)仍為主要治療手段。研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性吸入性麻醉劑可促進機體進入炎癥狀態(tài),增加動物小鼠及人發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的概率[17],相比之下,丙泊酚通過抗炎、抗氧化等作用抑制腫瘤生長,減少轉(zhuǎn)移風險[18-19]。臨床研究已發(fā)現(xiàn)丙泊酚與吸入性麻醉劑相比可減少腫瘤復發(fā)和患者死亡率[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚對結(jié)直腸癌細胞具有直接抑制作用。與對照組比較,丙泊酚可以直接抑制腸癌細胞SW620 及HT29增殖活性,在作用24 h 即出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象。此外,細胞劃痕實驗及Transwell 小室試驗表明丙泊酚對腸癌細胞運動遷移和侵襲有抑制作用,表明丙泊酚具備抑制腸癌細胞增殖和侵襲的抗腫瘤功能。

鑒于Wnt 信號通路為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動信號通路,我們利用qPCR 分析丙泊酚是否影響Wnt 信號通路活性。Wnt 信號通路激活往往伴隨著上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT),從而增強腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力[22-24]。我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚組細胞較對照組E-cadherin 表達顯著上調(diào),N-cadherin 減弱,表明丙泊酚可減弱腸癌細胞發(fā)生EMT 能力,與我們的細胞劃痕實驗和Tranwell 小室結(jié)果相符。同時,我們檢測了丙泊酚處理細胞后Wnt 信號通路經(jīng)典下游靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1,結(jié)果表明丙泊酚組細胞上述3 基因均有不同程度下調(diào)。其中c-Myc可抑制細胞凋亡,而周期蛋白Cyclin D1 促進細胞G1/S 期轉(zhuǎn)換,均與細胞增殖活性有關(guān)[25-26]。我們的體外CCK-8 實驗也證實了丙泊酚作用腸癌細胞后增殖活性明顯低于對照組細胞。本研究發(fā)現(xiàn)的丙泊酚新靶點Wnt 信號通路尚未見類似報道,豐富了丙泊酚作為抗腫瘤的作用機制。

近年來,大量研究表明SFRP1 是Wnt 信號通路表面受體拮抗劑,通過競爭抑制Wnt 配體與受體結(jié)合,增加β-catenin 磷酸化水平,降低細胞內(nèi)β-catenin 水平[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以誘導SFRP1 上調(diào),提示了丙泊酚可能通過增強SFRP1 表達水平抑制Wnt 信號通路。最新研究表明SFRP1 可因EZH2 在其啟動子富集程度增加后催化組蛋白3 第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27Me27),導致其啟動子染色質(zhì)構(gòu)象改變,從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制[11-14]。我們推測丙泊酚可能通過影響SFRP1 的啟動子對EZH2 的招募,誘導SFRP1 的表達。利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚組細胞較對照組細胞EZH2 在SFRP1 啟動子富集程度顯著下降,同時H3K27Me27 形式組蛋白在啟動子富集度也明顯降低,證明了丙泊酚可通過抑制EZH2 介導SFRP1 啟動子表觀機制,誘導其表達上調(diào),從而抑制Wnt信號通路活化。本研究首次從SFRP1 表觀調(diào)控角度揭示了丙泊酚抗癌作用,具有重要臨床價值。

亞里士多德把柏拉圖的理念論倒轉(zhuǎn)為一種目的論，即認為人類的一切行為、人類的一切共同體都是為了某種目的，而這種目的就是某種善。城邦是一種最高的、并且包含了其他一切共同體的共同體，即政治共同體，其目的一定是“追求最高的善”，因為它能成就最廣最大的善業(yè)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有抑制腸癌細胞增殖和侵襲活性。丙泊酚通過減弱EZH2 對SFRP1 表觀沉默作用,誘導其表達上調(diào),從而減低Wnt 信號通路活性,抑制腸癌細胞惡性生物學表型。本研究豐富了丙泊酚抗癌作用理論,為其成為潛在抗癌藥物提供了實驗依據(jù)。