肝細胞癌患者超聲造影特征與其血漿miR-30a 水平的相關性研究

路 英，王 霞

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中國常見的肝臟惡性原發(fā)腫瘤，復發(fā)率高[1]。盡管近年來多種治療手段的提高在一定程度上提高了患者的預后，但疾病的死亡率仍然較高，因此如何評估患者預后至關重要。 肝臟超聲造影檢查具有操作簡單、重復性高等優(yōu)點，可用于評估肝癌診斷、進展及治療效果等[2]。miR-30a 是與HCC 密切相關的microRNAs （mi RNAs），研究發(fā)現(xiàn)[3～5]，miR-30a 肝癌組織中低表達，可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，提示其在HCC 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 如何利用超聲造影方法間接分析HCC 的預后因子， 并尋找它們之間的相關性是研究的熱點。 筆者對HCC 患者進行了超聲造影檢查及外周血miR-30a 水平檢測， 并探索兩者關系，希望為HCC 預后評估提供新方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究采用雙盲法。 選擇2019 年1 月至2021 年8月在新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院手術治療的100 例HCC 患者（HCC 組），其中男性74 例，女性26 例；年齡32 ～78 歲，平均年齡58.24 歲（標準差4.92 歲）；腫瘤數(shù)量，1 個67 例，≥2 個23 例；直徑3.1 cm（標準差0.23 cm）。

選擇標準： ①符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[6]，病理、實驗室指標等明確診斷；②均首次治療，術前無放化療；③臨床資料完整；④患者及家屬知情同意，醫(yī)院倫理委員會批準。

排除標準：①合并肝臟其他疾??；②合并其他組織器官腫瘤；③嚴重心肝腎功能不全者；④血液、免疫系統(tǒng)疾病。

選取同期50 例健康人群（對照組），其中男性35例，女性15 例；年齡30 ～71 歲，平均年齡56.24 歲（標準差12.32 歲）。

選擇標準：①肝腎功能正常；②均獲得知情同意。

排除標準：組織器官腫瘤者。

兩組性別、 年齡比較， 差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

采用美國Philips 公司EPIQ7 彩色多普勒超聲儀（中國江蘇）進行檢查，探頭頻率3.5 ～5.0 MHz。 使用Bracco 公司研制的SonoVue 造影劑。 患者仰臥于檢查床，對肝臟常規(guī)檢查，包括腫瘤位置、大小、數(shù)量、邊界、內(nèi)部回聲、血流信號及周圍組織結構。 用0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）溶解SonoVue，混勻后由肘部靜脈注入，再用0.9 %氯化鈉溶液（生理鹽水）沖管，記錄4 min 內(nèi)腫瘤內(nèi)部增強及消退特征。 將結果進行時間-強度曲線分析，記錄始增時間、達峰時間、峰值加速時間、始增速度及增強速度。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測血漿miR-30a 表達

所有患者的血樣在入院后24 h 內(nèi)采集， 對照組血樣在登記時采集。 所有血樣在4 °C、1 600 g 條件下離心10 min。 隨后，將上清液轉移到Eppendorf 管中，于4°C、12 000 g 條件下離心10 min。 保留血漿并儲存在-80°C 冰箱中。 采用實時定量聚合酶鏈式反應（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測miR-30a 在血漿中的含量。 使用PureZOL RNA分離試劑（Bio-Rad）從血漿中提取總RNA。 使用RTPCR Quick Master Mix（Toyobo）進行cDNA 的反轉錄。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo）進行qPCR，miR-30a 的相對表達量使用2-ΔΔCt表示，內(nèi)參為U6。

引物序列：miR-30a 上游序列，5′-ACACACTCCAGCTGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游序列，5′-TGTCGTGGAGTCGGAATTC-3′；U6 上游序列，5′-CTCGCTTCGGAGCACATACTA-3′，下游序列，5′-ACGAATTTGTGTCATCCTGC-3′。

根據(jù)miR-30a 中位數(shù)將患者分為低表達組和高表達組。

1.2.3 觀察指標

HCC 病灶及癌旁組織超聲造影特征；HCC 組及對照組血漿miR-30a 水平；miR-30a 表達水平與超聲造影特征的關系。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 24.0 軟件（IBM）進行統(tǒng)計分析，并使用GraphPad Prism7.01 軟件繪制圖。 使用分位數(shù)圖（Q-Q 圖）檢查連續(xù)變量的正態(tài)性，正態(tài)或近似正態(tài)分布計量資料用均值± 標準差表示，兩組間采用t檢驗比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌與癌旁組織超聲造影特征比較

HCC 病灶的始增時間、達峰時間、峰值加速時間均低于癌旁組織，始增速度和增強速率均高于癌旁組織（均P＜0.05）。 見圖1、表1。

表1 HCC 與癌旁組織超聲造影指標比較Tab.1 Comparison of contrast-enhanced ultrasound indexes between HCC and adjacent tissues

圖1 HCC 典型超聲造影圖像Fig.1 Typical contrast-enhanced ultrasound images of HCC

2.2 肝細胞癌患者與健康人血漿miR-30a 水平比較

HCC 組患者血漿miR-30a 水平（0.12±0.03）低于對照組（0.28±0.04），差異有顯著統(tǒng)計學意義（t=7.945，P=0.000）。

2.3 不同miR-30a 表達水平患者超聲造影特征

根據(jù)miR-30a 中位數(shù)將患者分為低表達組（43例）和高表達組（57 例）。 低表達組患者始增時間、達峰時間、 峰值加速時間均低于高表達組， 始增速度和增強速率均高于高表達組（均P＜0.05）。 見表2。

表2 不同miR-30a 表達水平患者超聲造影特征比較Tab.2 Comparison of contrast-enhanced ultrasound features in patients with different miR-30a expression levels

3 討論

HCC 是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，預后差。 腫瘤組織內(nèi)大量新生血管為腫瘤的生長供給了豐富營養(yǎng)，因此全方位評估腫瘤內(nèi)部血液供應情況及腫瘤細胞增殖調(diào)控機制， 不但可以用于評價疾病嚴重程度，還可以為其臨床治療提供新的方法和思路。

超聲造影檢查是近年來新型發(fā)展的超聲檢查技術，通過對患者的局部病灶部位血管造影，進而對患者的血流情況進行分析，為患者的病理狀態(tài)及惡性生物學能力進行評估[7～9]。 原發(fā)性肝癌的生長發(fā)育主要以浸潤性生長為主，所以在病理學中，生長發(fā)育過程中需要大量養(yǎng)分，血管較為豐富，容易對周邊組織造成壓迫。超聲造影通過將造影劑注射到病灶局部血管內(nèi)，分析病灶血流情況，從而對病灶病理狀態(tài)進行評估。始增時間與病灶區(qū)域血管的通暢性及血管壓力有關，峰值時間與病灶區(qū)血管通暢性及側支循環(huán)能力有關。 有文獻報道[10]，HCC 分化程度越低，造影增強消退越快。 冉琪等研究同樣發(fā)現(xiàn)[11]，HCC 超聲造影參數(shù)與腫瘤病理特征、 患者預后有關。 筆者研究結果顯示，HCC 區(qū)域始增時間、達峰時間、峰值加速時間均低于正常肝組織， 始增速度和增強速率均高于癌旁組織，提示HCC 組織內(nèi)新生血管豐富，管徑粗、阻力小，造影劑進入血管的速度更快，與劉軾初等[12]研究結果一致，如HCC 病灶的始增時間、達峰時間、峰值加速時間均小于病灶周圍背景肝組織，病灶始增速度和增強速率均大于病灶周圍背景肝組織。隨著腫瘤細胞增殖能力的增加，對營養(yǎng)的需求逐漸增加，導致腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量增加，血管畸形率升高，在超聲造影特征上表現(xiàn)為腫瘤區(qū)域內(nèi)部血流量增加、流速升高。 此外，HCC 組織內(nèi)存在大量動靜脈短路， 導致腫瘤內(nèi)血流量增大，流速增快。

miRNAs 是一類長度約為18 ～25 nt 的非編碼調(diào)控RNA， 在腫瘤惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用。miR-30a 是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNAs， 在多種腫瘤組織中低表達，與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關[13～15]。有文獻報道[16]，過表達miR-30a 可促進肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力。 另外研究發(fā)現(xiàn)[17]，miR-30a 在肝癌組織中低表達，與腫瘤分期、分化程度及預后有關。筆者研究結果顯示，HCC 患者血漿miR-30a 水平低于健康人群，這與Yang X 等[17]研究結果基本一致，進一步佐證了miR-30a 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用。 超聲造影可以對病灶內(nèi)部血流情況進行定量分析，真實評估病灶血流狀態(tài)。腫瘤內(nèi)部豐富血流可促進細胞增殖，而腫瘤細胞增殖受miR-30a 調(diào)控。但HCC 超聲造影參數(shù)與miR-30a 表達水平的關系是否相關目前尚不清楚。筆者研究結果顯示，低表達組患者始增時間、達峰時間、峰值加速時間均低于高表達組，始增速度和增強速率均高于高表達組， 提示HCC 腫瘤組織的血流狀態(tài)與miR-30a 表達調(diào)控有關，隨著HCC 腫瘤組織內(nèi)血供增多， 流速增快，miR-30a 表達水平也增加，進而導致腫瘤細胞惡性行為。

綜上所述， 超聲造影可以準確評估HCC 腫瘤組織血流狀態(tài)， 其血流參數(shù)與miR-30a 表達水平有關，可為間接反映miR-30a 水平提供新思路。