豬偽狂犬病毒快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張眾，王新茹，殷健，陳彤，莊林林，申秋平*

（ 1.沛縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇 徐州 221600 ； 2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400 ； 3.國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225127 ）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性、接觸性傳染病[1-2]。PRV感染會(huì)導(dǎo)致豬的生長(zhǎng)及繁殖指標(biāo)嚴(yán)重下降，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了一定經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)將豬偽狂犬病列入需要進(jìn)行凈化的疫病的行列，并通過(guò)PRV糖蛋白基因（gE）缺失疫苗有效遏制了疫情蔓延。但近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，PRV野毒株已發(fā)生新變異（PRV Ⅱ型）且毒力強(qiáng)于經(jīng)典毒株（PRV Ⅰ型），現(xiàn)有的疫苗難以提供有效保護(hù)。目前，國(guó)內(nèi)外臨床中均有人感染PRV的案例，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜炎或眼內(nèi)炎，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為急性腦炎，甚至發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[3]。因此，精準(zhǔn)檢測(cè)PRV對(duì)有效防控潛在的PRV感染風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。本文就當(dāng)前國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的PRV快速檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)豬偽狂犬病凈化以及科學(xué)防控潛在的PRV感染風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原或抗體固定到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的方法。袁夢(mèng)等[4]通過(guò)表達(dá)PRV FA株糖蛋白gE制備單克隆抗體，開(kāi)發(fā)了一種特異性的競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，結(jié)果表明，該試劑盒效價(jià)可達(dá)1∶5 120。郭忠欣等[5]以PRV流行株gE重組蛋白為包被抗原，建立了一種可快速檢測(cè)PRV野毒株抗體的間接ELISA方法。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，間接ELISA方法與PRV疫苗免疫血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）等無(wú)交叉反應(yīng)性，且檢測(cè)結(jié)果與商品化gE-ELISA試劑盒具有較高的一致性?？軙跃У萚6]基于PRV gE蛋白建立的ELISA抗體檢測(cè)方法與商業(yè)化試劑盒總體符合率達(dá)89.84%，并具有良好的可重復(fù)性。劉旻翾等[7]以PRV gB蛋白為包被抗原，建立了一種間接ELISA抗體檢測(cè)方法。研究表明，該方法檢測(cè)限為血清稀釋度1∶128，且具有良好的特異性，與口蹄疫病毒、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）等陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。

為簡(jiǎn)化采樣步驟，Cheng等[8]利用ELISA方法評(píng)估了直接從豬口腔液中檢測(cè)PRV抗體的效果。結(jié)果顯示，基于口腔液檢測(cè)的IgG ELISA表現(xiàn)出良好的診斷性能（ROC曲線(xiàn)下面積為93%）和可重復(fù)性（R2=99.3%）。研究表明，豬口腔液有望作為可選采樣方案用于PRV的快速檢測(cè)。

1.2 免疫層析技術(shù)檢測(cè)方法

免疫層析技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、成本可控的檢測(cè)方法，能夠利用特異性的抗原-抗體反應(yīng)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行快速識(shí)別，適用于欄邊檢測(cè)[9]。王華俊等[10]利用膠體金標(biāo)記純化的抗PRV gB單克隆抗體制備出一種可用于PRV即時(shí)檢測(cè)的膠體金試紙條。經(jīng)測(cè)試，該試紙條具有較低的檢測(cè)限，且與PRRSV、PPV等無(wú)交叉反應(yīng)性。陳輝[11]使用銪納米顆粒標(biāo)記PRV病毒顆粒和羊抗雞IgY制備出熒光探針，開(kāi)發(fā)出一種快速靈敏的PRV gE抗體阻斷熒光免疫層析試紙條。經(jīng)測(cè)試，該方法與其他豬病病毒感染血清的交叉反應(yīng)率低，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%，且具有較長(zhǎng)的保存期限，為PRV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了新的有力支持。

1.3 熒光微球免疫檢測(cè)方法

微納米磁珠具有表面積大、易制備和儲(chǔ)存、表面可進(jìn)行多種修飾、超順磁性等優(yōu)點(diǎn)。在免疫學(xué)檢測(cè)中，微納米磁珠可以快速分離、富集、純化和檢測(cè)靶分子，特別是對(duì)存在于復(fù)雜的生物體系中，且具有濃度低、難以檢測(cè)特點(diǎn)的分子來(lái)說(shuō)更具優(yōu)勢(shì)。Ji等[12]將PRV gE和gB重組蛋白偶聯(lián)到磁性微球上，建立了一種可快速檢測(cè)PRV的雙重?zé)晒馕⑶蛎庖邫z測(cè)方法（fluorescent-microbead immunoassay，F(xiàn)MIA）。結(jié)果表明，與ELISA相比，F(xiàn)MIA方法對(duì)gE-IgG的特異性、敏感性分別為99.26%和92.30%，對(duì)gB-IgG的特異性、敏感性分別為95.74%和96.30%。同時(shí)，該方法可準(zhǔn)確鑒別PRV野毒株感染和疫苗株免疫應(yīng)答。曾夢(mèng)[13]將PRV gE、gB重組蛋白與磁性微球偶聯(lián)并將其作為捕獲載體，分別建立gE、gB IgG抗體單重及雙重FMIA方法。分析表明，F(xiàn)MIA方法具有良好的特異性和臨床適用性。

免疫學(xué)技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)技術(shù)之一，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于畜禽病原微生物的抗原（抗體）檢測(cè)。當(dāng)前，應(yīng)用于PRV檢測(cè)的免疫學(xué)方法主要包括ELISA、免疫層析技術(shù)以及熒光微球免疫檢測(cè)方法等。其中，ELISA法靈敏度和可重復(fù)性較高，且抗體檢測(cè)結(jié)果可以實(shí)現(xiàn)定量或半定量分析，在PRV快速檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的臨床適用性；免疫層析試紙操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果可目視判斷，適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)；熒光微球免疫檢測(cè)方法具有靈敏度高、支持抗原/抗體多重檢測(cè)且可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)快速分離等優(yōu)勢(shì)，為PRV快速檢測(cè)提供了新的支持。但是，上述方法均基于免疫學(xué)原理，而抗原抗體具有交叉反應(yīng)性，所以在特異性方面上述方法仍有待提升。而且動(dòng)物從感染病原到產(chǎn)生抗體需要時(shí)間，因此基于抗體檢測(cè)的方法具有一定的滯后性，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷。未來(lái)，隨著功能性微納米材料的應(yīng)用以及多學(xué)科的交叉融合，對(duì)豬偽狂犬病的檢測(cè)方法在目標(biāo)抗體（抗原）捕獲、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果呈現(xiàn)方式等方面有望得到優(yōu)化，其靈敏度、特異性以及可重復(fù)性等將進(jìn)一步得到提升。

2 基于核酸的檢測(cè)方法

2.1 基于PCR的檢測(cè)方法

2.1.1 常規(guī)PCR檢測(cè)方法

PCR技術(shù)是由Kary Mullis于20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)出的一種核酸高效擴(kuò)增方法[14]。該技術(shù)的原理是在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)變性、退火、延伸等循環(huán)變溫過(guò)程，以引物為起點(diǎn)不斷合成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。PCR反應(yīng)完成后，目標(biāo)序列數(shù)量將達(dá)到數(shù)十億個(gè)拷貝。王豕辰等[15]研究建立的PRV PCR檢測(cè)方法經(jīng)優(yōu)化后，特異性良好，與非PRV病毒無(wú)交叉反應(yīng)性。王鳳求等[16]根據(jù)PRV gB、gE基因設(shè)計(jì)引物建立了一種可快速檢測(cè)PRV野毒株的PCR方法。經(jīng)臨床樣品驗(yàn)證，靶向gB和gE的PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

2.1.2 多重PCR檢測(cè)方法

多重PCR（multiplex PCR）技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的一種可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶序列的核酸擴(kuò)增技術(shù)。通過(guò)在同一反應(yīng)管中同時(shí)添加多對(duì)擴(kuò)增引物，經(jīng)條件優(yōu)化后即可以實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增，有效提高了PCR的效率和準(zhǔn)確性。王穎旺等[17]根據(jù)PRVUL27基因、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）ORF1基因和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）N基因設(shè)計(jì)引物，建立了一種可快速檢測(cè)PRV、CSFV和PEDV的三重PCR方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)PRV、CSFV、PEDV的檢測(cè)限分別為12.00、0.05和3.50 pg，且特異性良好。此外，為精準(zhǔn)區(qū)分PRV疫苗株和野毒株，范克偉等[18]基于PRV gE及gB基因序列設(shè)計(jì)引物建立了可區(qū)分兩種毒株的雙重PCR方法?；谠摲椒ǎ琍RV野毒株的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為400 bp和582 bp的兩條片段，而PRV疫苗株的產(chǎn)物為582 bp的單一片段。經(jīng)臨床樣本驗(yàn)證，該雙重PCR的檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR一致。

2.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)方法

熒光定量PCR（qzuantitative PCR，qPCR）是一種可用于精確測(cè)定樣品中核酸數(shù)量的分子技術(shù)。與常規(guī)PCR不同的是，qPCR可以在反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)熒光曲線(xiàn)實(shí)時(shí)反映PCR產(chǎn)物的累積量，具有更高的靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)定量檢測(cè)。溫書(shū)香等[19]基于PRV gE基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，建立的qPCR方法顯示出良好的特異性和可重復(fù)性，可用于PRV快速準(zhǔn)確定量。蔡晴霞等[20]根據(jù)gE基因設(shè)計(jì)特異性引物及探針，能夠準(zhǔn)確區(qū)分PRV野毒株與疫苗株，且與PCV2、CSFV等其他豬源病毒均無(wú)交叉反應(yīng)性，同時(shí)具有良好的可重復(fù)性。針對(duì)同樣的靶標(biāo)，侯月娥等[21]試驗(yàn)建立的TaqMan qPCR方法可以區(qū)別野毒株和基因缺失疫苗株。經(jīng)檢測(cè)，該方法可精準(zhǔn)檢出PRV野毒株感染，且靈敏度比常規(guī)PCR高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。胡銘哲等[22]通過(guò)對(duì)PRV全基因組進(jìn)行分析，在PRV Ⅱ型gC基因上篩選出一段不同于PRV Ⅰ型的47 bp的差異序列并分別建立了單重和雙重PRV分型檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法能夠準(zhǔn)確區(qū)分PRV Ⅰ型和Ⅱ型，且針對(duì)PRV Ⅰ型、Ⅱ型的最低檢測(cè)限均為1×104拷貝/μL。

此外，qPCR也可應(yīng)用于準(zhǔn)確定量PRV疫苗的病毒含量。李雪峰等[23]基于PRV gB基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立qPCR方法檢測(cè)PRV滅活疫苗中的抗原含量。經(jīng)測(cè)試，該方法靈敏度高，與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)。華濤等[24]研究表明，qPCR方法可應(yīng)用于準(zhǔn)確檢測(cè)PRV弱毒疫苗的病毒含量。

2.1.4 數(shù)字PCR檢測(cè)方法

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是一種用于核酸精準(zhǔn)定量檢測(cè)的新型分子技術(shù)，可檢測(cè)極低濃度的DNA或RNA分子[25]。與qPCR技術(shù)相比，dPCR無(wú)須制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具有更高的靈敏度、特異性和耐受性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中目標(biāo)分子的絕對(duì)定量分析。數(shù)字PCR可分為兩種類(lèi)型：液滴數(shù)字PCR和芯片數(shù)字PCR。液滴數(shù)字PCR通過(guò)在液滴中分離DNA分子，每個(gè)液滴內(nèi)只存在1個(gè)或0個(gè)DNA分子，之后同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并采集熒光信號(hào)。根據(jù)泊松分布和陽(yáng)性比例即可以計(jì)算出初始樣品中的DNA分子數(shù)；芯片數(shù)字PCR是通過(guò)將樣品加入微型反應(yīng)室（通常為10～100 μL）中，每個(gè)反應(yīng)室中有一定數(shù)量的DNA分子，之后在芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分析。Ren等[26]開(kāi)發(fā)出一種液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，可應(yīng)用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。分析結(jié)果表明，ddPCR靈敏度高于qPCR，且樣品檢測(cè)結(jié)果與qPCR的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。

2.1.5 基于PCR的新型檢測(cè)方法

隨著PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步以及多學(xué)科技術(shù)的融合發(fā)展，基于PCR的新型檢測(cè)方法在檢測(cè)PRV感染方面更加靈敏和高效。烏那爾汗等[27]將PCR和核酸斑點(diǎn)進(jìn)行雜交建立了一種可快速鑒別PRV野毒株和疫苗株的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)出PRV野毒株與PRRSV、PCV2等其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。張悅勇等[28]基于gB基因建立了一種可快速檢測(cè)PRV的納米PCR方法。結(jié)果表明，該納米PCR方法的檢測(cè)限為10拷貝/μL，比常規(guī)PCR低2個(gè)數(shù)量級(jí)，且具有良好的特異性和臨床檢測(cè)適用性。胡輕輕[29]基于PRV TK和gE基因建立的PCR介導(dǎo)的CRISPR/Cas12a熒光檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，而且將側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l與CRISPR/Cas12a結(jié)合，無(wú)須設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果快速判讀。結(jié)果表明，該方法適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增方法

2.2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種高效、靈敏、操作方便的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在單一溫度條件下對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行快速擴(kuò)增[30]。陳珍金等[31]根據(jù)PRV gB基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增引物，并對(duì)其靈敏度、特異性進(jìn)行評(píng)估。經(jīng)臨床樣品驗(yàn)證，建立的LAMP方法具有良好的特異性，且樣本檢測(cè)結(jié)果與qPCR結(jié)果具有高度一致性。En等[32]建立的LAMP方法可在63 ℃、1 h內(nèi)完成PRV DNA擴(kuò)增。同時(shí)，通過(guò)Hinc Ⅱ酶對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行消化，驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和特異性。此外，經(jīng)臨床樣本驗(yàn)證，LAMP結(jié)果與PCR具有良好的相關(guān)性。

2.2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[33]。該技術(shù)利用重組酶酶促作用啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)，并基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理，能夠在常溫下迅速擴(kuò)增目標(biāo)核酸片段。與PCR相比，RPA具有更短的反應(yīng)時(shí)間、更高的靈敏度和特異性。因此，Yang等[34]基于PRV gD基因分別建立實(shí)時(shí)RPA方法和聯(lián)合免疫層析試紙（lateral flow dipstick，LFD）應(yīng)用的RPA-LFD檢測(cè)方法，RPA可在39 ℃、20 min內(nèi)完成靶基因擴(kuò)增。上述兩種方法檢測(cè)限分別為100和160 拷貝/反應(yīng)，且均具有良好的特異性。為快速鑒別PRV野毒株和疫苗株，劉立兵等[35]基于gB和gE基因設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增引物，建立了一種雙重RPA方法，可在20 min內(nèi)完成對(duì)PRV野毒株和疫苗株的區(qū)分。同時(shí)，該方法具有良好的特異性，針對(duì)PRV gB和gE基因的檢測(cè)限均為102拷貝，與qPCR方法相當(dāng)。

2.2.3 重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（recombinase-aided amplification，RAA）是一種近年來(lái)發(fā)展的核酸擴(kuò)增方法，利用該技術(shù)可在等溫條件下快速、準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增DNA或RNA。該方法基于重組酶、聚合酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白等的協(xié)同作用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的高效擴(kuò)增。Tu等[36]根據(jù)PRVgE基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一種實(shí)時(shí)熒光RAA方法以快速檢測(cè)PRV。結(jié)果表明，該方法靈敏度與qPCR相當(dāng)，且可特異性檢出PRV野毒株，與gE基因缺失疫苗株以及其他豬源病毒無(wú)交叉反應(yīng)性。經(jīng)206份臨床樣本驗(yàn)證，該方法檢測(cè)結(jié)果與qPCR具有較高的符合率。

基于核酸的檢測(cè)方法已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PRV的常用方法。其中，PCR方法因其靈敏度高、特異性好、支持高通量和早期檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于PRV檢測(cè)。但是，常規(guī)PCR需要使用瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察結(jié)果，易造成氣溶膠污染；熒光定量PCR和數(shù)字PCR雖然簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程并且具有更優(yōu)異的檢測(cè)性能，但目前其相關(guān)試劑及儀器成本依然較高，難以推廣給資源條件有限的用戶(hù)；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不同于PCR，無(wú)須依賴(lài)特殊設(shè)備進(jìn)行循環(huán)變溫?cái)U(kuò)增，且結(jié)果呈現(xiàn)方式多樣，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)PRV提供了新的可選工具支持。但目前，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系成熟度以及可重復(fù)性等方面仍有待提升，現(xiàn)有方法難以兼顧靈敏度和特異性。隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步和多學(xué)科技術(shù)的交叉融合，期待未來(lái)相關(guān)技術(shù)能不斷發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)PRV快速、精準(zhǔn)檢測(cè)提供有力工具支持。

3 結(jié)論

目前，在不同場(chǎng)景及應(yīng)用需求下，基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法（包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫層析技術(shù)以及熒光微球免疫檢測(cè)方法等）以及基于核酸的檢測(cè)方法（包括基于PCR的方法以及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等）為PRV檢測(cè)提供了多種可選工具支持?；诿庖邔W(xué)的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易于操作，可以監(jiān)測(cè)抗體水平。但這類(lèi)方法容易受到抗原抗體交叉反應(yīng)影響，存在潛在的誤判率?；赑CR的檢測(cè)方法靈敏、特異，結(jié)果可靠。但這些方法對(duì)樣品的預(yù)處理和設(shè)備檢測(cè)等具有一定要求，且不適用于欄邊檢測(cè)。核酸等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)設(shè)備要求大為簡(jiǎn)化，且快速便捷，但在技術(shù)成熟度等方面仍有待進(jìn)一步提升。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和多學(xué)科的融合創(chuàng)新，相關(guān)技術(shù)將不斷進(jìn)步，同時(shí)，基于免疫學(xué)和核酸的檢測(cè)方法也將不斷實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為快速、精準(zhǔn)地檢測(cè)PRV提供更加靈敏、特異、便捷的方法，以便更好地滿(mǎn)足臨床實(shí)踐中多樣化的實(shí)際檢測(cè)需求。