兔竇房結(jié)切片制作方法的探究和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的觀察

袁慧杰,潘昭良,袁廣明,馮煉強(qiáng),陳大堤,秦麗娜

中山大學(xué) 中山醫(yī)學(xué)院,廣州 510080

竇房結(jié)(SAN)是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分,位于上腔靜脈口與右心房交界處,在界溝上端的心外膜下,是心臟最高級(jí)的起搏組織[1-2]。竇房結(jié)由起搏細(xì)胞(P細(xì)胞)、過度細(xì)胞(T 細(xì)胞)、心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞等實(shí)質(zhì)以及竇房結(jié)動(dòng)脈、神經(jīng)、血管和膠原、網(wǎng)狀、彈性纖維等間質(zhì)共同組成[3]。由于竇房結(jié)組織不規(guī)則,形態(tài)不典型,不同種屬動(dòng)物SAN位置變異多等因素,該類標(biāo)本的取材和制作是難點(diǎn)。而標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范的組織學(xué)切片不僅是保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的前提,對(duì)科研及臨床都是必不可少的[4]。本研究采用連續(xù)切片的方法獲得兔SAN 石蠟切片,并采用不同的染色方法對(duì)竇房結(jié)切片進(jìn)行染色,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)獲得了較滿意的染色效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔10只,雌雄不拘,3月齡,體質(zhì)量2.5～3.0 kg,SPF級(jí),由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2011-0029。飼養(yǎng)條件:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨意進(jìn)食、自由飲水,室內(nèi)環(huán)境溫度在20～25 ℃,相對(duì)濕度35%～75%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由中山大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

組織包埋機(jī)(Thermo HISTOSTAR),石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235,德國Leica公司),光學(xué)顯微鏡(Motic BA210Digital)。戊巴比妥鈉溶液(w=3%),多聚甲醛溶液(φ=4%),鹽酸酒精分化液(φ=1%),伊紅水溶液(w=0.5%),磷鉬酸溶液(w=1%),醋酸苯胺藍(lán)液(φ=2%),冰醋酸水溶液(φ=1%)。Harris蘇木素液,Bouin氏固定液,天青石藍(lán)液,Mayer蘇木精液,麗春紅酸性品紅溶液(以上溶液均為自備)[5]。

1.3 兔SAN組織取材和切片

取健康新西蘭大白兔,戊巴比妥鈉溶液(w=3%)以1 mL/kg的劑量進(jìn)行靜脈注射麻醉,之后固定于兔臺(tái)上,從耳緣靜脈注入空氣栓塞致死,于胸前進(jìn)行脫毛、消毒,后迅速剖開心腔,剪開心包,找到右上腔靜脈,用白色縫合線標(biāo)記,取出完整心臟。然后將心室橫向剪去一半,用生理鹽水沖出心腔積液,剪開上、下腔靜脈,取上腔靜脈與右心房交界處的界溝組織,下至下腔靜脈口區(qū)域(即包括界溝組織與上、下腔靜脈根部)。將切取的兔SAN 組織標(biāo)本迅速用多聚甲醛溶液(φ=4%)固定48 h,之后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室修塊。大小視組織形狀,按2 cm×2 cm×0.5 cm的原則置于包埋盒內(nèi),鉛筆寫上標(biāo)志。多聚甲醛溶液(φ=4%)再固定一定時(shí)間后,用φ=70%、80%、90%、95%的乙醇及無水乙醇依次進(jìn)行梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,用LEICA RM2235切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片,切片厚度5 μm。

1.4 SAN組織染色

每10張取1張切片進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察是否含有SAN 組織;取含有SAN 組織的陽性切片,每相鄰的2張切片為一組;一張進(jìn)行常規(guī)HE染色,一張進(jìn)行改良Masson三色染色;中性樹膠封固后,在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.1 兔SAN 組織HE染色

石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡脫蠟各10 min,再經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ和φ=95%、90%的乙醇各浸泡5 min,φ=80%、70%的乙醇和蒸餾水各浸泡2 min水化;Harris蘇木素染色10 min使細(xì)胞核著色,自來水流水洗5 min藍(lán)化;鹽酸酒精分化液(φ=1%)分化數(shù)秒,分化后的切片再流水洗30

min反藍(lán);之后將切片放入伊紅水溶液(w=0.5%)中染色5 min,蒸餾水稍洗;再經(jīng)φ=70%、80%、90%的乙醇及無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ浸泡各2 min,進(jìn)行上行梯度脫水;最后切片入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明處理各10 min,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察[6-7]。

1.4.2 兔SAN 組織改良Masson三色染色

石蠟切片經(jīng)二甲苯、酒精等常規(guī)脫蠟至水化(參照HE染色);置入Bouin氏固定液室溫作用一晚進(jìn)行媒染,然后流水沖洗至切片上的黃色消失;天青石藍(lán)液滴染2 min,蒸餾水稍洗1 min;Mayer蘇木精液滴染5 min,蒸餾水稍洗;鹽酸酒精分化液(φ=1%)分化3 s,流水沖洗10～20 min;麗春紅酸性品紅溶液滴染5 min,蒸餾水稍洗;磷鉬酸溶液(w=1%)處理5 min——根據(jù)需要可適當(dāng)延長時(shí)間;甩去磷鉬酸溶液不洗,滴醋酸苯胺藍(lán)液(φ=2%)復(fù)染5 min;冰醋酸水溶液(φ=1%)處理2 min,去除上液;切片經(jīng)φ=70%、80%、90%、95%的乙醇溶液脫水各5 s,再經(jīng)無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水各10 s,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各2 min,中性樹膠固封,光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 兔SAN的位置及形態(tài)

根據(jù)兔SAN 的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)來定位取材,觀察連續(xù)切片。結(jié)果表明,兔SAN 主要位于上腔靜脈與右心房界溝的靜脈竇側(cè),結(jié)的長軸與界溝平行。光學(xué)顯微鏡下觀察,兔心臟SAN 區(qū)域組織結(jié)構(gòu)較為疏松,染色也比較淺淡,與周圍的心房肌等界限清晰、易于區(qū)分,且SAN 靠近心外膜,與心內(nèi)膜之間隔以右心房的心肌而不直接相鄰(見圖1)。

圖1 兔SAN組織連續(xù)切片結(jié)果(改良Masson三色染色)

2.2 兔SAN動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

竇房結(jié)中心有一條較粗的竇房結(jié)動(dòng)脈,圍繞該動(dòng)脈周圍的細(xì)小的肌纖維構(gòu)成竇房結(jié)的主體。本實(shí)驗(yàn)中的10例大白兔SAN 區(qū)均觀察到了SAN 動(dòng)脈,為1～3條不等,動(dòng)脈壁外膜含有豐富的膠原纖維,這使得SAN動(dòng)脈壁顯著增厚,動(dòng)脈壁膠原纖維與結(jié)內(nèi)膠原纖維網(wǎng)相互連接,外圍常見P細(xì)胞、T細(xì)胞圍繞(見圖2)。

圖2 兔SAN內(nèi)動(dòng)脈和膠原纖維

2.3 兔SAN內(nèi)的細(xì)胞類型和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

SAN內(nèi)部主要由起搏細(xì)胞(P 細(xì)胞)、移行細(xì)胞(T 細(xì)胞)和少量心房肌細(xì)胞構(gòu)成。P 細(xì)胞多位于SAN的中央,外形呈圓形、橢圓形或多邊形,散在或成群分布;細(xì)胞核大,約占細(xì)胞直徑的二分之一,多呈圓形或橢圓形,可見1～2各核仁;核周有空泡狀,胞漿透亮,染色淺淡,無肌紋。T 細(xì)胞又稱過渡細(xì)胞,數(shù)量較少,主要位于竇房結(jié)的外周,結(jié)的中央亦會(huì)有少量散在分布,其大小、形態(tài)、位置等均介于 P細(xì)胞與心房肌細(xì)胞之間,有中間過渡性質(zhì);T細(xì)胞多呈不規(guī)則長圓柱形,比一般心房肌細(xì)胞短,界限不清晰,核長形或橢圓形;細(xì)胞內(nèi)含肌原纖維,偶見橫紋,染色也介于 P 細(xì)胞與心房肌細(xì)胞之間。普通心房肌細(xì)胞,主要位于心內(nèi)膜側(cè),為長柱形或長梭形,有明顯橫紋,胞核較長且位于細(xì)胞中央,胞漿染色較深(見圖3)。

圖3 兔SAN內(nèi)的P細(xì)胞、T細(xì)胞、心肌細(xì)胞(HE染色)

2.4 兔SAN間質(zhì)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

兔心臟SAN組織中還含有大量的膠原纖維和纖維細(xì)胞,膠原纖維與肌纖維的鑒別染色是病理特殊染色中的重要方法。Masson三色法染色結(jié)果顯示:兔SAN內(nèi)部以藍(lán)色的膠原纖維為支架,交錯(cuò)成網(wǎng),各種細(xì)胞成分就散布于網(wǎng)狀支架的間隙中,胞核呈黑藍(lán)色。SAN動(dòng)脈管壁也含有豐富的膠原纖維,使管壁增厚,這些膠原纖維與周圍組織中的膠原纖維網(wǎng)相互連接,將結(jié)細(xì)胞分隔成許多細(xì)胞群。在HE染色中除了細(xì)胞核藍(lán)染以外,所有組織均紅色,膠原纖維等成分不易觀察。而Masson三色染色中膠原纖維被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色,肌纖維被酸性品紅染成紅色,胞核呈黑藍(lán)色,SAN中各結(jié)構(gòu)分層、分類顯示,清晰明了(見圖2A)。

3 討論

兔心臟SAN 由于位置隱蔽,通過肉眼難以觀察,根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道,不同種屬動(dòng)物SAN 位置雖然有差異[8],但都位于心臟上腔靜脈和右心房的交界區(qū)域[9-12]。本實(shí)驗(yàn)通過在體打結(jié)的方法標(biāo)記右上腔靜脈,取兔心臟上腔靜脈與右心房交界處的界溝組織進(jìn)行連續(xù)切片,成功獲得兔SAN 切片。說明上腔靜脈在體打結(jié)法能夠保證心臟離體后SAN定位的準(zhǔn)確性,縮短取材的時(shí)間,而SAN 組織包埋于心肌組織中的特點(diǎn)也決定了只能通過連續(xù)切片才能獲得SAN切片。

本實(shí)驗(yàn)通過HE染色和改良Masson三色染色法對(duì)兔SAN進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。傳統(tǒng)HE染色能很好地顯示SAN各細(xì)胞結(jié)構(gòu),但是在HE染色中除了細(xì)胞核藍(lán)染以外,所有組織均紅色,膠原纖維等成分不易觀察。而改良Masson三色染色中,膠原纖維被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色,肌纖維被酸性品紅染成紅色,胞核呈黑藍(lán)色,對(duì)于成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的結(jié)締組織分層、分類顯示,紅藍(lán)相間,清晰明了,更好的顯示了SAN結(jié)構(gòu)。兩種方法可相互補(bǔ)充,相互支持,對(duì)于兔SAN區(qū)的鑒定均具有重要的作用。

在改良Masson三色染色法中,采用天青石藍(lán)液和Mayer蘇木精液代替原本方法中的Weigert鐵蘇木精染液進(jìn)行細(xì)胞核染色,該兩液穩(wěn)定性好,染色效果佳,染液保存時(shí)間也更長。原法采用比布列西猩紅和伊紅混合液進(jìn)行肌纖維染色,由于比布列西猩紅比較難購得,且用前需要過濾,本法用麗春紅酸性品紅溶液代替。磷鉬酸水溶液(w=1%)的作用一方面使染上紅色的膠原纖維分化成無色或淡紅色,而肌纖維、纖維素仍保持鮮紅,另一方面對(duì)膠原纖維又起媒染作用,使膠原纖維與大分子染料的苯胺藍(lán)液較易結(jié)合。苯胺藍(lán)液染色后用冰醋酸(φ=1%)處理,目的是除去附于原漿內(nèi)的藍(lán)色,使染色鮮艷和清晰。用低濃度梯度酒精,代替三缸φ=95%的酒精,分色清悅,預(yù)防了因溶液交替更換所產(chǎn)生的破片龜裂、霧化之現(xiàn)象。

在兔SAN 形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)方面,與其他哺乳動(dòng)物SAN成分的報(bào)道也基本一致[13-15]。主要由SAN 動(dòng)脈、P細(xì)胞、T細(xì)胞、少量心房肌細(xì)胞以及包裹在動(dòng)脈和細(xì)胞周圍的結(jié)締組織等構(gòu)成。找到SAN 動(dòng)脈是SAN定位的關(guān)鍵因素,結(jié)內(nèi)的各種細(xì)胞成分形態(tài)也有明顯區(qū)分,P細(xì)胞最小、核大,胞漿透亮且染色最淺;心肌細(xì)胞細(xì)長,有橫紋,染色最深;T細(xì)胞主要位于結(jié)的外圍區(qū),形態(tài),染色深淺均介于P細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間。

綜上所述,本方法能夠準(zhǔn)確的得到兔SAN 切片并且很好觀察兔SAN 的不同結(jié)構(gòu),填補(bǔ)了教學(xué)標(biāo)本空白,適用于病理學(xué)、組織胚胎學(xué)等學(xué)科的教學(xué),同時(shí)為研究多種因素對(duì) SAN 的損傷奠定了可靠的技術(shù)保障,具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。