草魚肌纖維原代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基篩選

張浩，龍鮮梅，陳旺旺，胡廣文，譚青松

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430070）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、草魚屬，具有生長快、肉質(zhì)鮮美、價格親民等特點(diǎn)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1]。隨著水產(chǎn)業(yè)發(fā)展和配合飼料的普及，草魚產(chǎn)量大幅度提升，養(yǎng)殖效益逐年遞增，但草魚肌肉品質(zhì)也有所降低[2]。骨骼肌是魚體可食部分的主要組成，占魚體總質(zhì)量的30%～80%，肌肉的基本組成單位是肌纖維，肌纖維特性是肉質(zhì)的組織學(xué)基礎(chǔ)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、肌纖維密度、橫截直徑和面積等都會影響肌肉品質(zhì)[3]。隨著動物細(xì)胞體外培養(yǎng)研究的深入，骨骼肌細(xì)胞為動物肌肉生長研究提供了重要技術(shù)手段[4]。1965 年，GRAVELL 等[5]對黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）建立了第一株魚類肌肉細(xì)胞系—FHM，F(xiàn)HM目前仍是魚類肌細(xì)胞相關(guān)實驗的首選細(xì)胞系。草魚的肝原代細(xì)胞[6]、前體脂肪細(xì)胞[7]以及腸上皮細(xì)胞[8]等組織細(xì)胞已被分離培養(yǎng)，并應(yīng)用到病理學(xué)、營養(yǎng)代謝及遺傳育種等研究，但草魚肌肉細(xì)胞用于營養(yǎng)生理、肌肉品質(zhì)等研究仍然缺乏。

目前DMEM、M199、DMEM/F12、L-15 以及F12等普遍應(yīng)用于魚類細(xì)胞培養(yǎng)[9]，而在魚類原代細(xì)胞培養(yǎng)中，最常用的培養(yǎng)基是L-15 和M199[10]。這些培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，但不含蛋白質(zhì)、脂類或任何生長因子，需要添加血清以支持長期培養(yǎng)。其中M199 培養(yǎng)基含有較多氨基酸、維生素以及其它營養(yǎng)成分，且含有胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷等獨(dú)有成分，因此M199 培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)多種種屬來源的細(xì)胞，現(xiàn)也常用于淡水魚類細(xì)胞的培養(yǎng)。DMEM（高糖型）是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，普遍適用于生長快、主要以糖代謝為主的組織細(xì)胞的培養(yǎng)[11]。L-15 培養(yǎng)基用半乳糖作為碳源，有利于減少細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生對細(xì)胞有毒性的酸性代謝副產(chǎn)物，而且其培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是由磷酸鹽和高濃度的堿性氨基酸組成，這些特性使得L-15 培養(yǎng)基不需要在CO2環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，更加簡化了細(xì)胞培養(yǎng)條件，近些年廣泛應(yīng)用于魚類細(xì)胞培養(yǎng)[12]。不同培養(yǎng)基的物質(zhì)組成比例及含量存在較大區(qū)別，關(guān)于不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維原代培養(yǎng)的作用效果缺乏直接研究。為了確定草魚肌纖維原代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，本實驗選用3 種應(yīng)用范圍較廣的M199、DMEM 和L-15 培養(yǎng)基進(jìn)行草魚肌纖維的培養(yǎng)，通過探究在不同培養(yǎng)基條件下的培養(yǎng)情況，從而篩選適合進(jìn)行草魚肌肉細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗所用草魚均來自黃岡市太白湖漁場。在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖缸里統(tǒng)一飼養(yǎng)一段時間。在實驗開始前挑選無病無傷，體質(zhì)健康，體長10～15 cm 的草魚苗。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基M199、DMEM、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Gibico 公司；二甲亞砜（DMSO）、培養(yǎng)基L-15 購自浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；硫慶大霉素、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、噻唑藍(lán)（MTT）購自Sigma 公司。

AIM 培養(yǎng)基：以體積比計，在（DMEM、M199 或L-15）培養(yǎng)基中加入5%的青霉素/鏈霉素雙抗溶液，5%的兩性霉素B（250 μg/mL）和1%的硫慶大霉素（10 mg/mL）；完全培養(yǎng)基配置：以體積比計，在DMEM、M199 或L-15 培養(yǎng)基中加入2%的青霉素/鏈霉素雙抗溶液，5%的兩性霉素B（250 μg/mL）和1%的硫慶大霉素（10 mg/mL），20%的胎牛血清；MTT 溶液配置：500 mg 的MTT 溶于100 mL 的PBS。

1.3 方法

草魚肌肉原代細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng) 用解剖針破壞魚腦，并用75%酒精消毒。剪取魚體側(cè)線以上白肌，置于盛有AIM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)消毒。后將組織塊切成1 mm3的小塊，接種于25 mL 培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于28 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，使組織小塊貼附瓶底，然后將殘余液體吸出，再加入4～5 mL 完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d 換液一次。待細(xì)胞出現(xiàn)大量集落，即進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%的融合時，棄培養(yǎng)液，剝離組織塊，PBS 清洗去除死細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，立即加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，收集單細(xì)胞懸液，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，加10 mL 含20%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照1∶1 傳代，培養(yǎng)條件與原代培養(yǎng)相同。

1.3.1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對草魚肌纖維生長情況及形態(tài)的影響

分別用DMEM、L-15 和M199 三種完全培養(yǎng)基培養(yǎng)草魚肌纖維，在倒置顯微鏡下觀察組織塊細(xì)胞在小塊貼壁后開始沿瓶壁向外生長的時間以及細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)細(xì)胞開始遷出組織塊和達(dá)到第一次傳代條件（即培養(yǎng)瓶中的肌細(xì)胞達(dá)到80%～90%的融合狀態(tài)）所需時間。

1.3.2 不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維增殖的影響

分別取用DMEM、L-15 和M199 三種完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的P2代生長良好的草魚肌纖維，向培養(yǎng)瓶里加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化，離心分離制成細(xì)胞懸液，以5.0×105/mL 接種于24 孔板，每孔0.5 mL，接種時間記0 h，自接種時算起，每24 h 用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)3 孔細(xì)胞密度，算出均值，繪制細(xì)胞生長曲線。另取三種完全培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的P2代生長良好的草魚肌纖維細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以4.2×104/mL 接種于12 孔板，每種培養(yǎng)基3孔，72 h 取樣，用流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，計算不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的草魚肌纖維的擴(kuò)增倍數(shù)（擴(kuò)增倍數(shù)＝n 代收獲的細(xì)胞數(shù)/n 代接種的細(xì)胞數(shù)）。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對草魚肌細(xì)胞貼壁的影響

分別取用DMEM、M199 和L-15 培養(yǎng)基培養(yǎng)的P3代草魚肌纖維，用0.25%胰蛋白酶消化，以2.0×105/mL 濃度接種于24 孔板中，每孔2 mL，置于28℃5% CO2培養(yǎng)箱中；每隔2 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并計算貼壁率，貼壁率（%）＝貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞對細(xì)胞活力的影響

分別取用DMEM、M199 和L-15 培養(yǎng)基培養(yǎng)的P3代草魚肌纖維，以2.0×106/mL 濃度接種于96 孔板，每孔150 μL。用無血清培養(yǎng)基設(shè)置對照組。各處理細(xì)胞放入5%CO2，28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，采用MTT 法檢測細(xì)胞活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來表示。實驗數(shù)據(jù)在Excel 2019 中初步處理后，采用SPSS 25.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）判定處理的效果，若組間有顯著性差異，再進(jìn)行Duncan’s 多重比較。P<0.05 被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚肌肉細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)及傳代后的形態(tài)學(xué)觀察

用DMEM和M-199 培養(yǎng)6 d 后，組織塊周圍逐漸有細(xì)胞遷移出來，遷出細(xì)胞貼壁生長良好，透明折光性好，細(xì)胞多呈上皮樣、少數(shù)呈不規(guī)則星形，上皮樣細(xì)胞的分裂速度較快，生長迅速；培養(yǎng)至10 d后，貼壁細(xì)胞開始逐漸向周圍呈放射狀增大鋪開，形成生長暈，邊緣細(xì)胞排列疏密大小不等；培養(yǎng)至14 d 后，肌纖維細(xì)胞開始形成比較均一的細(xì)胞群落，細(xì)胞形態(tài)明顯變細(xì)長，貼壁細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底；培養(yǎng)至22 d 后，離組織塊近的區(qū)域比邊遠(yuǎn)區(qū)域細(xì)胞生長密集，使得不同區(qū)域單層細(xì)胞的密度顯著不同，少數(shù)細(xì)胞因發(fā)生接觸抑制而凋亡。而L-15組在培養(yǎng)6 d 后，未見細(xì)胞從組織塊邊緣遷出；在10 d 后，組織塊邊緣遷出比DMEM 和L-15 中貼壁細(xì)胞透明的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞不及DMEM 和L-15 培養(yǎng)基明顯，細(xì)胞長勢緩慢；培養(yǎng)22 d 后，肌纖維才形成比較均一的細(xì)胞群落（圖1）。

圖1 草魚肌肉組織塊細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中肌細(xì)胞的生長情況（×4）Fig.1 The growth of muscle cells of grass carp in different media

圖2 為肌纖維在經(jīng)過第一次傳代后在不同培養(yǎng)基中的生長情況，傳代后培養(yǎng)3 天的細(xì)胞大部分貼壁生長，部分細(xì)胞死亡懸浮在培養(yǎng)液里面。細(xì)胞形態(tài)為主要呈上皮樣。

圖2 草魚肌肉組織塊細(xì)胞首次傳代后在不同培養(yǎng)基中的生長情況（×4）Fig.2 The growth of muscle cells of grass carp muscle in different media after the first passage

2.2 不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維遷出時間和第一次傳代時間的影響

M199 原代培養(yǎng)的草魚肌肉組織開始遷出細(xì)胞的耗時最短，平均時間為（4.00±0.82）d，其次為DMEM組的（5.50±0.58）d，而L-15 組耗時最長，平均為（10.00±1.83）d（P<0.05）。同時，不同培養(yǎng)基對第一次傳代時間的影響結(jié)果顯示，M199 培養(yǎng)的草魚肌纖維在（15.50±1.29）d 時達(dá)到首次傳代的亞融合狀態(tài)（80%～90%），而用DMEM和L-15 培養(yǎng)的草魚肌纖維分別在（24.75±1.50）d 和（30.00±1.83）d 后達(dá)到首次傳代的亞融合狀態(tài)，且三者之間相互差異顯著（P<0.05，圖3）。

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對草魚肌纖維遷出時間和達(dá)到首次傳代時間的影響Fig.3 Effects of different media on the time of muscle fiber migration and first passage of grass carp

2.3 不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維貼壁率的影響

草魚肌纖維在接種2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h 后的貼壁率情況如圖4 所示。不同培養(yǎng)基的貼壁率曲線均呈現(xiàn)先快速后逐漸變緩的上升趨勢，均在10 h達(dá)到最大值（P<0.05）。對比同一時間節(jié)點(diǎn)不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的貼壁率，可以看出，在各個時間節(jié)點(diǎn)M199 和DMEM 的草魚肌纖維貼壁率顯著高于L-15，而除2 h 和6 h 的時間點(diǎn)外，M199 要顯著高于DMEM（P<0.05）。

圖4 不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維貼壁率的影響Fig.4 The effect of different media on the adhesion rate of grass carp muscle fibers

2.4 不同培養(yǎng)基對草魚肌纖維生長的影響

由圖5 可見，DMEM、M199 和L-15 培養(yǎng)的P2代草魚肌纖維細(xì)胞生長曲線基本都呈S 型，DMEM、M199 和L-15 培養(yǎng)的細(xì)胞分別在5 d、3 d、5 d 進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞密度快速升高，分別在6 d、5 d、6 d 達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢（P<0.05）。不同培養(yǎng)基的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量不同，對比同一培養(yǎng)基不同時間點(diǎn)的細(xì)胞密度，在進(jìn)入第4 d 以后，均以L-15 培養(yǎng)的最低，M199 最高，DMEM居中（P<0.05）。

圖5 草魚肌纖維在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.5 Growth curve of grass carp muscle fibers

如圖6 所示，M-199 和DMEM培養(yǎng)的草魚肌纖維72 h 平均擴(kuò)增倍數(shù)分別為（20.58±4.67）和（18.66±4.33），二者差異不顯著，但均顯著高于L-15 組的（8.19±4.17，P<0.05）。

圖6 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對草魚肌纖維增殖的影響Fig.6 The effect of different media on the proliferation of grass carp muscle fibers

2.5 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對細(xì)胞活力的影響

不同培養(yǎng)基在培養(yǎng)草魚肌纖維72 h 后的細(xì)胞活力結(jié)果顯示，M199 培養(yǎng)的草魚肌纖維平均OD 值為（1.03±0.17，P<0.05），顯著高于DMEM 和L-15的平均OD 值（0.06±0.02）和（0.05±0.02）（P<0.05），而后兩者吸光度值沒有明顯區(qū)別（圖7）。

圖7 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對細(xì)胞活力的影響Fig.7 The effect of different culture media cultures on cell viability

3 討論

用于魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有酶消化法和組織塊法。組織塊法簡單、高效、便捷，適合于各種組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)。組織塊給細(xì)胞提供了適宜的生存環(huán)境，使遷出的細(xì)胞更容易貼壁和生長[13]，與酶消化法相比，組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞具有更高的增殖速率和細(xì)胞活力[14]。這得益于組織塊培養(yǎng)的細(xì)胞減少了機(jī)械分離所帶來的損害，沒有離開穩(wěn)定的生長環(huán)境，較好地保存了細(xì)胞的完整性[15]，且組織塊可以釋放促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長的生長因子和細(xì)胞因子到培養(yǎng)液中刺激細(xì)胞生長[16]。但組織塊培養(yǎng)存在培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)液的浮力容易使部分組織塊浮起而致細(xì)胞活力喪失等不足[17]。此外，組織塊剪切的大小以及組織塊之間的間距也會對培養(yǎng)效果造成較大影響[18]。

在細(xì)胞體外培養(yǎng)的諸多影響因素中，培養(yǎng)基是最直接的影響因素，對細(xì)胞生長狀態(tài)和增殖潛力都有明顯影響，因此，尋求適合草魚肌纖維體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基以在短時間內(nèi)得到細(xì)胞形態(tài)好、數(shù)量較多的草魚肌纖維用于草魚營養(yǎng)生理，肌肉品質(zhì)等的研究就顯得異常關(guān)鍵。實驗表明，DMEM（高糖）、M199和L-15 三種培養(yǎng)基均能夠促進(jìn)草魚肌纖維的貼壁和生長增殖，但不同培養(yǎng)基中的草魚肌纖維細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞開始遷出時間、第一次傳代時間、細(xì)胞增殖速度、貼壁率以及細(xì)胞活力等方面都存在差異。其中M199 促進(jìn)草魚肌纖維貼壁以及生長增殖的效果最好，表現(xiàn)在較高的細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)以及OD 值。譚風(fēng)霞[19]在胭脂魚肌肉細(xì)胞原代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)M199 和L-15 中的肌肉細(xì)胞培養(yǎng)效果最好，且兩者細(xì)胞培養(yǎng)效果沒有明顯差異；祝冬梅[20]發(fā)現(xiàn)，相比 于L-15、DMEM-F12、MEM 和RPMI-1640 四種培養(yǎng)基，團(tuán)頭魴肌肉細(xì)胞在M199 中增殖速度最快，培養(yǎng)效果最好；而付思思等[21]用L-15 原代培養(yǎng)錦鯉肌肉組織15 d 后，肌肉細(xì)胞才開始從組織塊中遷移出來，這與本實驗結(jié)果類似，可以看出L-15 并不是魚類肌肉細(xì)胞的首選培養(yǎng)基；焦健剛[26]發(fā)現(xiàn)，草魚肌肉細(xì)胞在20%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基中正常貼壁，增殖適中，通過提高DMEM 高糖培養(yǎng)基中FBS 的濃度，細(xì)胞的增殖速度會相應(yīng)提高。本實驗發(fā)現(xiàn)在含20%FBS 的M199、DMEM和L-15 三種培養(yǎng)基中，草魚肌肉細(xì)胞的原代培養(yǎng)在M199 培養(yǎng)基中增殖速度快，可以縮短草魚肌肉細(xì)胞原代培養(yǎng)時間。

細(xì)胞培養(yǎng)需要足夠的維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞生長需求。氨基酸作為蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子，在細(xì)胞培養(yǎng)中是不可缺少的成分。氨基酸的缺乏會造成蛋白質(zhì)的合成受阻，進(jìn)而影響到這些蛋白質(zhì)所承載的生理功能，對細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞高密度的維持，以及蛋白產(chǎn)量等方面都產(chǎn)生重要影響。而維生素是一類維持細(xì)胞生長增殖的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝方面有重要作用[22]，如在細(xì)胞中形成酶的輔酶或輔基，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進(jìn)行。血清是氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，但是許多合成培養(yǎng)基中添加了各種氨基酸和維生素以適合更多的細(xì)胞系生長。相比于DMEM 和L-15 培養(yǎng)基，M199 培養(yǎng)基中添加了更多種類的氨基酸和維生素，含有22 種氨基酸和17 種維生素。據(jù)有關(guān)研究表明，氨基酸和維生素品類豐富的培養(yǎng)基更加有利于細(xì)胞生長[23]。

培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。對于單糖而言，細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低，但培養(yǎng)基高濃度的葡萄糖添加會對細(xì)胞生長產(chǎn)生影響。高濃度葡萄糖代謝會產(chǎn)生較多對細(xì)胞有毒性的酸性的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH，破壞細(xì)胞生存環(huán)境，從而抑制了細(xì)胞的生長[24]。而較低濃度的葡萄糖在提供給細(xì)胞充足能量的同時又減少了酸性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，有利于細(xì)胞的生長增殖，減少細(xì)胞的凋亡[25]。焦健剛[26]在進(jìn)行草魚肌肉組織的原代培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，DMEM高糖培養(yǎng)基不利于草魚肌肉細(xì)胞的生長，而草魚肌肉細(xì)胞在低糖乃至無糖的DMEM中可以較好生長。L-15 用半乳糖替代葡萄糖作為碳源，可以有效減少培養(yǎng)液中乳酸累積的濃度，維持細(xì)胞正常生長的生理pH,有利于細(xì)胞生長。但是在用半乳糖作為替代碳源的情況下，會對細(xì)胞產(chǎn)物的表達(dá)和糖基化修飾造成不利影響，這可能與細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足以及細(xì)胞代謝產(chǎn)生較高濃度的氨有關(guān)[27]。本實驗中M199、DMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度分別為1 000 mg/L 和4 500 mg/L，而L-15 用半乳糖替代葡萄糖，這可能是造成細(xì)胞生長分化能力在不同培養(yǎng)基中出現(xiàn)較大差異的原因之一。

綜上所述，培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要生長環(huán)境，本實驗表明，相比于DMEM和L-15，M199 對于草魚肌纖維的生長具有更好的促進(jìn)作用，是比較適合草魚肌纖維的原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基。