加味獨(dú)活寄生合劑對膝骨關(guān)節(jié)炎兔骨代謝的影響

郭俊剛，鄺 濤

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以進(jìn)行性膝關(guān)節(jié)軟骨退變、膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥、膝關(guān)節(jié)間隙變窄、膝關(guān)節(jié)軟骨下骨代謝異常等病理表現(xiàn)為主的骨關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床癥狀早期以疼痛為主，這種疼痛多在休息時減輕，夜晚或活動后加重，同時還伴有一定程度的關(guān)節(jié)腫脹、皮溫升高、活動障礙，后期則可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形而導(dǎo)致殘廢［1］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨的骨代謝失衡，尤其是骨吸收的增強(qiáng)在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生改變之前就已經(jīng)發(fā)生，膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的改變與重塑可能是KOA發(fā)病的始動因素［2-3］，因此，從調(diào)控軟骨下骨代謝異常和骨重塑出發(fā)來治療KOA 已逐漸成為研究熱點(diǎn)［4］。加味獨(dú)活寄生合劑是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科的協(xié)定處方，以《備急千金藥方》中的獨(dú)活寄生湯為基礎(chǔ)加減化裁而來，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用［5］。曾凡等［6］研究表明，加味獨(dú)活寄生合劑可以降低患者關(guān)節(jié)內(nèi)相關(guān)炎癥因子水平，改善關(guān)節(jié)活動度。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從軟骨下骨代謝的角度進(jìn)一步探索加味獨(dú)活寄生合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 3 月齡成年健康雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量（2.25±0.25）kg，購自湖南太平生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可編號：SYXK（湘）2020-0005。實(shí)驗(yàn)中對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)（室溫25 ℃，濕度60%，食物水源充足）1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 加味獨(dú)活寄生合劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號20180625，每瓶250 ml，每毫升含生藥0.664 g。木瓜蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，批號G8430，規(guī)格：每瓶25 g。水合氯醛購自青島宇龍海藻有限公司，批號H37022673，規(guī)格：每瓶500 g。硫酸氨基葡萄糖購自山西同達(dá)藥業(yè)有限公司，批號H20090316，規(guī)格：每粒0.25 mg。0.9%氯化鈉注射液購自湖南康源制藥有限公司，批號H20103461，規(guī)格：每瓶100 ml。兔Ⅰ型膠原C 端肽（CTX-Ⅰ）試劑盒（貨號：ml036844）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）試劑盒（貨號：ml027225）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）試劑盒（貨號：ml036768）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 動物分組與造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將32 只雌性新西蘭大白兔隨機(jī)分為4 組：空白組、模型組、中藥組、陽性對照組，每組8 只。除空白組外，余組均參照文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行造模，模型組、中藥組、陽性對照組的新西蘭大白兔于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，先用棉簽蘸取碘伏于兔耳緣靜脈周圍畫圈消毒2 次，用注射器抽取5%水合氯醛溶液（用量為75 mg/kg）沿兔耳緣靜脈緩慢注射，邊注射邊觀察兔的呼吸頻率和心率。深度麻醉后，用棉簽蘸取碘伏在兔右膝關(guān)節(jié)附近消毒2次，接下來用注射器將0.5 ml 1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液緩慢注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每隔3 d 注射1 次，共注射3次。在造模過程中，每日上午10點(diǎn)、下午4點(diǎn)將新西蘭大白兔放置于空曠場地驅(qū)趕，強(qiáng)迫活動30 min?？瞻捉M注射等量0.9%氯化鈉溶液，其余操作與其他組相同。

2.2 給藥 參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［8］附錄中的動物與人的等效劑量折算表，換算出新西蘭大白兔的給藥劑量。中藥組灌胃給予加味獨(dú)活寄生合劑，劑量為3.237 g/kg；陽性對照組灌胃給予硫酸氨基葡萄糖，劑量為0.048 g/kg；模型組、空白組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液；各組灌胃量均為10 ml/kg。灌胃從造模結(jié)束后第1 d開始，共灌胃8周。

2.3 骨代謝標(biāo)志物檢測 灌胃結(jié)束后，沿兔耳緣靜脈注射5%水合氯醛溶液（用量為75 mg/kg），麻醉成功后取腹主動脈血10 ml放入抗凝管中，在室溫下靜置1 h，通過離心機(jī)離心分離上血清，將標(biāo)本置于-80 ℃的環(huán)境中保存，按照試劑盒說明進(jìn)行ELISA檢測。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊性用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，多組間進(jìn)行比較采用LSD分析；若方差不齊則采用Tamhance’s T2 法分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料則使用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組動物一般情況 造模前，各組新西蘭大白兔精神狀態(tài)良好，靈活敏捷，體重?zé)o明顯變化，進(jìn)食、飲水正常，雙膝關(guān)節(jié)皮溫正常，皮色正常。造模第10 d，空白組新西蘭大白兔與造模前無明顯差別，模型組、中藥組、陽性對照組新西蘭大白兔則表現(xiàn)為精神倦怠，不喜活動，食欲稍減退，查看膝關(guān)節(jié)發(fā)現(xiàn)右側(cè)膝關(guān)節(jié)較左側(cè)明顯腫脹，皮溫升高，局部青紫，被動活動其右膝關(guān)節(jié)時可誘發(fā)疼痛反射。灌胃8 周后，與模型組相比，中藥組和陽性對照組大白兔的食欲、精神狀態(tài)、膝關(guān)節(jié)腫脹程度均有所改善。

3.2 各組新西蘭大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b 水平比較 見表1。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的CTX-Ⅰ、TRACP-5b水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組與陽性對照組的CTX-Ⅰ、TRACP-5b 水平顯著降低（P＜0.05）；中藥組與陽性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 各組新西蘭大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b水平比較（）

表1 各組新西蘭大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b水平比較（）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

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3.3 各組新西蘭大白兔血清中MMP-3水平比較 見表2。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的MMP-3 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比較，中藥組與陽性對照組的MMP-3水平顯著降低（P＜0.05）；中藥組與陽性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組新西蘭大白兔MMP-3水平比較（）

表2 各組新西蘭大白兔MMP-3水平比較（）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

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4 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎的病理改變主要是軟骨損傷、軟骨下骨和半月板的改變以及骨贅的形成，國內(nèi)外大部分關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎的研究都著眼于軟骨的損傷和半月板的病變，然而近年來軟骨下骨的病理改變引起了越來越多研究者的關(guān)注［9-10］。膝關(guān)節(jié)軟骨下骨包括骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)，兩者緊密相連，不僅可以吸收關(guān)節(jié)應(yīng)力、緩沖震蕩，還具有保護(hù)和營養(yǎng)軟骨組織的作用，軟骨下骨和軟骨相互影響共同構(gòu)成一個功能復(fù)合單元［11］，在生理?xiàng)l件下，軟骨下骨的重塑依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互協(xié)調(diào)作用［12］。若膝關(guān)節(jié)長期遭受異常應(yīng)力反復(fù)作用，則會打破協(xié)調(diào)，出現(xiàn)軟骨下骨重塑異常，降低軟骨下骨吸收應(yīng)力和保護(hù)軟骨的作用。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨病理改變初期，破骨細(xì)胞活性提高，骨吸收活躍，大量分泌鈣-膦酸鹽復(fù)合物，導(dǎo)致軟骨退變，軟骨下骨厚度降低，生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)的改變繼發(fā)導(dǎo)致骨形成代償性活躍。在異常的骨形成與吸收背景下，雖然表現(xiàn)為軟骨下骨的骨量增加，但是單位骨密度總體是降低的；因此，有效調(diào)控軟骨下骨代謝，使骨有充分時間礦化，才能完成骨組織的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)過程［13］。

Ⅰ型膠原是骨基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)的主要成分，約占90%以上，在骨組織的礦化和鈣化中起到重要作用，其含量對骨的強(qiáng)韌度有一定的影響。MMP-3 可通過影響骨細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原和非膠原的代謝來調(diào)控骨的重塑，其通過與骨橋蛋白結(jié)合激活前體MMP-3，并形成復(fù)合物，參與到Ⅰ型膠原骨代謝的過程，影響骨的礦化，參與軟骨下骨的骨代謝［13］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨在關(guān)節(jié)炎的中晚期分泌的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子明顯增多，可促進(jìn)新血管的生成。骨髓內(nèi)的基質(zhì)干細(xì)胞沿新生成的血管附著于軟骨表面并分化為成骨細(xì)胞，分泌Ⅰ型膠原，導(dǎo)致鈣磷沉積形成骨贅［14-15］。另外，骨小梁重塑過程中還會引起骨質(zhì)硬化，增加了軟骨承受的應(yīng)力，加速了軟骨的退變，在重塑過程中關(guān)節(jié)面的形態(tài)也隨之發(fā)生改變，影響了關(guān)節(jié)面接觸面積，同樣也會加速軟骨的磨損，導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［16］。由于膝關(guān)節(jié)軟骨無感覺神經(jīng)分布，因而該區(qū)域的損傷并不會引起疼痛。有研究表明，膝關(guān)節(jié)軟骨下骨分布著大量降鈣素基因相關(guān)肽陽性感覺神經(jīng)纖維，提示膝骨關(guān)節(jié)炎的疼痛主要來源于軟骨下骨區(qū)域［17-18］。有學(xué)者在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)軟骨下骨成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活躍時，會分泌致痛因子，導(dǎo)致小鼠疼痛增加［19］；在去卵巢的高骨轉(zhuǎn)換小鼠模型基礎(chǔ)上用碘乙酸鈉注射膝關(guān)節(jié)腔進(jìn)行膝骨關(guān)節(jié)炎造模，其高骨轉(zhuǎn)化狀態(tài)同樣也引起了小鼠膝關(guān)節(jié)疼痛加?。?0］，這充分地說明了軟骨下骨代謝的異常是膝骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生疼痛的主要原因之一，通過調(diào)控骨代謝的異?？赡苁歉纳苹颊呦リP(guān)節(jié)疼痛的重要途徑。

目前市場上主要調(diào)控骨代謝異常的藥物包括降鈣素、雙膦酸鹽類、雌激素類等藥物，但此類藥物大多需長期堅(jiān)持服用，極容易導(dǎo)致肝腎功能損害等不良反應(yīng)的發(fā)生，而且價格較為昂貴。中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎具有療效顯著、不良反應(yīng)少、價格低等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到重視，是國內(nèi)治療膝骨關(guān)節(jié)炎的主要手段之一［21］。Zhu 等［22］研究表明，在關(guān)節(jié)炎早期關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變之前，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收就開始出現(xiàn)增強(qiáng)，導(dǎo)致骨量減少，出現(xiàn)軟骨下骨結(jié)構(gòu)的改變、生物力學(xué)以及生物化學(xué)信號異常，從而影響骨形成相關(guān)通路的異常，造成軟骨下骨骨代謝異常、骨質(zhì)增生、軟骨退變。通過這一病理特點(diǎn)可為早期干預(yù)軟骨下骨的異常吸收，防治膝骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是一種主要存在于破骨細(xì)胞中的蛋白分子，骨吸收時TRACP參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物降解，TRACP-5b 是其中的一種分型，其主要來源于破骨細(xì)胞，特異性較高，是一種重要的骨吸收標(biāo)志物［23］。Ⅰ型膠原為異質(zhì)三聯(lián)體蛋白，是骨組織合成與代謝的重要指標(biāo)，當(dāng)其分泌到細(xì)胞外后，在蛋白酶的作用下切除氨基端和羧基端肽成為膠原分子，再進(jìn)一步組裝成不溶性膠原纖維。在氨基端和羧基端末端，一個Ⅰ型膠原分子非螺旋末端肽部分與另一分子螺旋區(qū)域形成分子間交聯(lián)。交聯(lián)的形成保證膠原纖維有序排列及結(jié)構(gòu)完整，構(gòu)成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。膠原降解過程中，交聯(lián)部位脫落，作為重要的骨轉(zhuǎn)移或骨吸收指標(biāo)，血清CTX-Ⅰ在骨代謝性疾病中具有重要的參考意義［24-25］。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組新西蘭大白兔血清中TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平明顯升高，提示模型組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨吸收增強(qiáng)，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，經(jīng)加味獨(dú)活寄生合劑治療后，模型兔血清中TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平降低，表明加味獨(dú)活寄生合劑能減少骨質(zhì)吸收，對膝骨關(guān)節(jié)炎起到一定的治療或預(yù)防作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）是基質(zhì)金屬蛋白酶中的一類，貫穿于膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的始終，它產(chǎn)生于滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，能主導(dǎo)細(xì)胞外的基質(zhì)降解。當(dāng)膝骨關(guān)節(jié)炎病變時，軟骨MMP-3分泌增加，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖、骨連接蛋白、彈性蛋白以及各種膠原蛋白發(fā)生降解，使軟骨厚度變薄，同時MMP-3還能激活其他基質(zhì)金屬蛋白酶，如MMP-1、MMP-8等，從而發(fā)生退行性病變［26-28］。除了作為炎性標(biāo)志物誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，在骨代謝的過程中MMP-3同樣也發(fā)揮著作用，MMP-3可以與骨橋蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，既能刺激成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成，又能刺激破骨細(xì)胞，加快骨吸收，從而使骨轉(zhuǎn)換率升高，影響骨組織局部微環(huán)境，改變骨基質(zhì)；但是骨轉(zhuǎn)化率異常升高容易導(dǎo)致骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，應(yīng)力結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。通過抑制MMP-3 的表達(dá)，可以有效降低骨轉(zhuǎn)化率，改善軟骨下骨的骨組織結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組新西蘭大白兔血清中MMP-3 含量較空白組明顯升高，提示膝關(guān)節(jié)內(nèi)可能發(fā)生劇烈的炎癥反應(yīng)，骨組織局部微環(huán)境遭到破壞。經(jīng)加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)后，血清中MMP-3的含量明顯降低，提示加味獨(dú)活寄生合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎可能是通過抑制炎癥反應(yīng)，改善膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨代謝來實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)通過膝關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶的方法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，并運(yùn)用加味獨(dú)活寄生合劑進(jìn)行干預(yù)，研究其血清中Ⅰ型膠原C 端肽、MMP-3 以及抗酒石酸酸性磷酸酶5b含量的變化，在一定程度上揭示了加味獨(dú)活寄生合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎對機(jī)體骨代謝以及炎癥水平的影響，取得了部分研究成果。但在實(shí)驗(yàn)的過程中仍存在一定的局限性，如在實(shí)驗(yàn)過程中只注重了實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)尾的對比，對于實(shí)驗(yàn)過程中相關(guān)指標(biāo)的變化情況未予以追蹤，后續(xù)將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。