木犀草素-聚乙二醇 400/PVP k30固體分散體的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià)

呂鑫科,曾愛(ài)國(guó)

1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430071;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,西安 710061

木犀草素化學(xué)名為3’,4’,5,7四羥基黃酮(3’,4’,5,7-tetralydroxyflanone),是典型的黃酮類(lèi)化合物,廣泛存在于荊芥、野菊花、金銀花、白毛夏枯草、洋薊等中藥材中[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,木犀草素具有抗氧化[4]、抗炎[5-6]、抗腫瘤[7]、抑菌[8]、抗過(guò)敏[9]以及增加冠狀動(dòng)脈血流量和降低冠狀動(dòng)脈血管阻力[10]等作用。但木犀草素的水溶性差,不易吸收,生物利用度低,限制了其在臨床上的應(yīng)用[11]。

提高難溶性藥物的溶解度一般用減小藥物粒徑、成鹽、固體分散體、包合物、前藥修飾、改變晶型等方法[12-13]。目前,固體分散體是提高難溶性藥物溶解度和溶出度、改善體內(nèi)吸收和生物利用度的常用方法[14-15]。鄧向濤等[16]和吳春等[17]以乙醇為溶劑,分別用溶劑法、溶劑-熔融法制備木犀草素-PVP k30固體分散體,增大木犀草素的溶解度,提高體內(nèi)生物利用度。以乙醇為溶劑制備固體分散體,在除去乙醇時(shí),易造成環(huán)境污染,且制備的固體分散體易析晶。本研究擬以聚乙二醇(PEG) 400為溶劑,在85 ℃溶解木犀草素,加入PVP k30在150 ℃充分?jǐn)嚢?制備木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體。用該方法制備固體分散體時(shí),不需要除去PEG 400,可簡(jiǎn)化制備過(guò)程且不會(huì)污染環(huán)境。PEG 400作為載體成分,還可起到增塑作用,降低PVP k30玻璃轉(zhuǎn)變溫度,提高固體分散體的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AY 120型電子天平、傅里葉紅外分析儀、LC-20A型色譜系統(tǒng)均購(gòu)自日本Shimadzu公司;Mapada UV-1200型紫外分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司);DSC 822e型差示掃描量熱儀(Mettler Toledo有限公司);D8 Advance型X線衍射儀(Bruker有限公司);ZRS-8G型智能溶出試驗(yàn)儀(上海雙旭電子有限公司);98-1-C型數(shù)字電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

木犀草素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,西安冠宇生物技術(shù)有限公司);木犀草素對(duì)照品、芹菜素對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>99.9%,均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;PEG 400、PVP k30均購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純,均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;肝素鈉(天津生物化學(xué)制藥有限公司);羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三蒸水為自制;其他試劑均為分析純,均購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠,體質(zhì)量為(280±20) g,購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCKX(陜)0073276。

2 方法

2.1 木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的制備

取適量木犀草素,加入PEG 400中,85 ℃攪拌至溶解;按一定比例加入PVP k30,150 ℃攪拌10 min,室溫冷卻;粉碎,過(guò)80目篩,得粒徑為50～100 μm的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體,置于干燥器中避光保存,備用。

取PEG 400,按一定比例加入PVP k30,150 ℃攪拌10 min,室溫冷卻,粉碎,過(guò)80目篩;加入木犀草素,混合均勻,即得物理混合物,置于干燥器中避光保存。

2.2 差示掃描量熱法曲線的繪制

精密稱(chēng)取2.0 mg木犀草素以及相當(dāng)于2.0 mg木犀草素的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物測(cè)定差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)曲線。差示掃描量熱儀用銦和鋅進(jìn)行溫度和焓值校正,以空鋁坩堝作為參比物,在氮?dú)饬飨聫?5 ℃升溫至350 ℃,升溫速率為10 ℃·min-1。

2.3 粉末X線衍射分析

稱(chēng)取適量的木犀草素、木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物在室溫下測(cè)定各樣品的粉末X線衍射圖譜。粉末X線衍射條件:銅靶,管壓為40 kV,管電流為30 mA,步長(zhǎng)為0.02°,掃描速度為每分鐘2.0°,持續(xù)時(shí)間為0.06 s,掃描范圍為10°～40°。

2.4 溶出實(shí)驗(yàn)

以蒸餾水為溶出介質(zhì),用槳法(2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0931第二法)測(cè)定木犀草素的溶出度。分別精密稱(chēng)取5.0 mg木犀草素以及相當(dāng)于5.0 mg木犀草素的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物,加入200 mL水中,溫度為(37.5±0.5) ℃,轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。分別于5、10、15、30、60、120、180、240 min取樣5 mL,立即用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾,同時(shí)補(bǔ)充5 mL同溫度的蒸餾水。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在254 nm處測(cè)定溶出樣品的吸光度值,計(jì)算溶出樣品中木犀草素的含量,并繪制溶出曲線。

2.5 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)

2.5.1試藥的配制 木犀草素混懸液:精密稱(chēng)取0.25 g木犀草素,置于50 mL量瓶中,加入適量5 g·L-1CMC-Na水溶液,用蒸餾水定容至刻度,即得5 mg·mL-1的木犀草素混懸液。

木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體混懸液:精密稱(chēng)取木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體(10%載藥量)2.5 g,置于50 mL量瓶中,加入適量5 g·L-1CMC-Na水溶液,用蒸餾水稀釋至刻度,即得5 mg·mL-1的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體溶液。

2.5.2血漿樣品的采集 取SD雄性大鼠10只,隨機(jī)分為2組,每組5只,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食但不禁水。分別以木犀草素混懸液和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體混懸液?jiǎn)未喂辔附o藥,給藥量為40 mg·kg-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別于給藥前和給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、720 min頸靜脈取血0.30 mL,置于肝素離心管中,以3 000 r·min-1離心5 min,取上層血漿冷凍備用。

2.5.3血漿樣品的預(yù)處理 取血漿100 μL,加入2 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)(芹菜素)甲醇溶液20 μL,再加入100 μL 3 mol·L-1的稀鹽酸溶液,于80 ℃水浴鍋中加熱1.5 h,冷卻后加入1 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩1 min,以3 000 r·min-1離心10 min,取1 mL上清液,氮?dú)獯蹈?100 μL流動(dòng)相復(fù)溶,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液進(jìn)樣分析。

2.5.4色譜條件 色譜柱為T(mén)ianhe C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸(30∶5∶65);流速為1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;進(jìn)樣量為20 μL;柱溫為30 ℃。

3 結(jié)果

木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的PXRD圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),木犀草素在2θ為12.68°、14.04°、15.81°、21.37°、25.40°、26.16°、27.38°、28.40°處具有較強(qiáng)的特征衍射峰,而在木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體PXRD圖中木犀草素的特征衍射峰消失,物理混合物在2θ為12.68°、14.04°、15.81°、21.37°、26.16°處有較強(qiáng)的木犀草素特征衍射峰,表明木犀草素以無(wú)定形狀態(tài)或分子形式分散于載體材料中。

圖1 木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的PXRD圖

木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的DSC曲線見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),木犀草素的熔融峰在350 ℃;在木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體DSC曲線中,木犀草素熔融峰消失,只在載體和木犀草素之間出現(xiàn)一個(gè)熔融峰,表明木犀草素與載體在固體分散體中形成共熔體,并以無(wú)定形狀態(tài)或分子形式分散于載體材料中。物理混合物在190 ℃左右出現(xiàn)吸熱峰,而木犀草素熔融峰消失,這可能是因?yàn)檩d體PEG 400和PVP k30熔融后,木犀草素溶解在二者的熔融液中;在固體分散體的制備過(guò)程中,木犀草素在85 ℃時(shí)能溶解在PEG 400中也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖2 物理混合物、木犀草素及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的DSC曲線

在水溶性介質(zhì)中,木犀草素在4 h內(nèi)達(dá)平衡時(shí)的溶解度僅為0.60 μg·mL-1,溶出率僅為2.41%。相比之下,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體中的木犀草素在30 min達(dá)到平衡時(shí),溶解度為25.06 μg·mL-1,約為木犀草素的40倍,溶出率高達(dá)100%。物理混合物的溶解度僅為4.03 μg·mL-1左右,溶出率僅為16%。物理混合物的溶解度和溶出率高于木犀草素,可能是由于水溶性載體PEG 400和PVP k30改善了木犀草素的潤(rùn)濕性。以上結(jié)果表明,固體分散體可顯著改善木犀草素的溶出速度和溶解度,使其具有更快的釋放速度和更大的溶出率。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 木犀草素、物理混合物和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的溶出曲線(n=5)

用HPLC法測(cè)定木犀草素在大鼠血漿樣品中的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明,芹菜素的保留時(shí)間為16.05 min,木犀草素的保留時(shí)間為9.67 min,血漿樣品中芹菜素和木犀草素的主峰保留時(shí)間與對(duì)照溶液中的保留時(shí)間一致;在該色譜條件下,血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不影響木犀草素和芹菜素的測(cè)定,且具有較好的分離度,見(jiàn)圖4。木犀草素在0.01～5.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=0.907 2x+0.010 6(r=0.999 5)。檢測(cè)限為0.20 ng(信噪比為S/N=3),定量限為1.00 ng(信噪比為S/N=10)。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(0.05、1.00、5.00 μg·mL-1)的回收率分別為114.20%、96.42%、105.31%,RSD值分別為9.42%、5.41%、6.25%。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液室溫放置24 h、凍融循環(huán)以及-20 ℃放置30 d內(nèi)藥物在血漿中的穩(wěn)定性良好,回收率在94.81%～108.25%范圍內(nèi),RSD值小于5.57%。

注:1.木犀草素;2.芹菜素。

木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn),木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的達(dá)峰濃度(Cmax)藥時(shí)曲線下面積(AUC)均顯著大于木犀草素原料藥。用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件包自動(dòng)擬合數(shù)據(jù),主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的達(dá)峰時(shí)間(tmax)為28.12 min,Cmax為3.01 μg·min-1,是木犀草素原料藥Cmax的5倍,表明木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在體內(nèi)能快速釋放和溶出,且體內(nèi)吸收較快。木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的AUC0→12 h為(1.74±0.44) min·mg·mL-1,顯著高于木犀草素原料藥,相對(duì)生物利用度為915.82%。體外溶出度結(jié)果顯示,固體分散體能明顯提高木犀草素的溶解度和溶出速率,而體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明,固體分散體能促進(jìn)木犀草素在體內(nèi)的吸收,生物利用度顯著提高,表明木犀草素的溶解和溶出是其在體內(nèi)吸收的限速步驟,固體分散體是改善木犀草素溶解性和體內(nèi)生物利用度的有效方法。

表1 木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=5)

圖5 木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的藥時(shí)曲線(n=5)

4 討論

固體分散體的制備工藝有熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法、研磨法和熱熔擠出法等。鄧向濤等[16]和吳春等[17]用溶劑法、溶劑-熔融法制備木犀草素-PVP k30固體分散體,提高木犀草素的溶出度和生物利用度。但是,以乙醇為溶劑制備固體分散體,易導(dǎo)致藥物重結(jié)晶,使分散度下降,且乙醇揮發(fā)會(huì)污染環(huán)境。木犀草素為黃酮類(lèi)化合物,具有較多的羥基,在PEG 400中有較好的溶解度,因此本文以PEG 400作為溶劑,采用溶劑-熔融法制備木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體,使用該方法完全可以避免環(huán)境污染和析晶問(wèn)題。此外,PEG 400不用除去,而作為固體分散體載體成分,可以起到增塑作用,降低PVP k30玻璃轉(zhuǎn)變溫度,不僅可以降低制備過(guò)程中的熔融溫度,還可提高固體分散體的穩(wěn)定性。體外溶出實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在體內(nèi)能快速釋放和溶出,且體內(nèi)吸收速度較快,能極大地改善木犀草素的體內(nèi)生物利用度,表明以PEG 400作為溶劑,用溶劑-熔融法制備固體分散體是改善木犀草素溶解度和生物利用度的有效方法。