絲素蛋白-明膠-殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架的制備及性能評估

谷明西, 王常成, 田豐德, 郝瑞胡, 安 寧, 郭 林

(1.北京大學深圳醫(yī)院 內科,深圳 518000; 2.大連理工大學 醫(yī)學部,大連 116081; 3.大連大學附屬中山醫(yī)院 膝關節(jié)與骨腫瘤科,大連 116001)

關節(jié)軟骨主要由嵌有軟骨細胞的細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)組成,具有承載和緩沖作用,覆蓋和保護骨骼免受數(shù)倍于身體質量的承重力的影響[1]。與大多數(shù)其他組織不同,軟骨組織結構特殊,由于缺乏血管化和神經支配,軟骨細胞少、增殖能力低,導致軟骨損傷后的自我修復能力差,當損傷從軟骨表層延伸到軟骨下骨時,即發(fā)生全層軟骨缺損(Full-Thickness Cartilage Defect,FTAC)[2]。組織工程(Tissue Engineering,TE)是一種結合了工程學和細胞生物學的跨學科方法,旨在恢復、改善和維持組織功能[3],已成為軟骨組織再生和重建最常用的方法之一。種子細胞、支架材料及生長因子是制約軟骨組織工程的三個關鍵性制約因素,其中作為組織形成模板的支架材料在TE中起著最重要的作用[4]。

絲素蛋白(Silk Fibroin,SF)是一種具有出色機械性能、生物降解性、生物相容性和生物可吸收性的天然蛋白質[5]。殼聚糖(Chitosan,CS)是唯一帶正電荷的天然多糖,與ECM中發(fā)現(xiàn)的葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)相似,不僅能夠與帶負電的GAG發(fā)生靜電相互作用,而且還能促進軟骨特異性蛋白表達[6]。明膠(Gelatin,Gel)是膠原蛋白的水解產物,具有高度的親水性和出色的生物相容性,這有助于支架中的營養(yǎng)輸送和細胞黏附[7]。羥基磷灰石(Hydroxyapatite,Hap)是天然骨骼的礦物質成分,具有骨傳導特性、骨誘導特性、骨結合能力和原位降解緩慢等優(yōu)勢,已成功應用于臨床骨修復[8]。然而由單一成分制成的支架在水和生理條件下的穩(wěn)定性差,因此,可以將兩種或多種聚合物混合以獲得新材料[9-10]。

本研究為了構建理想的組織工程支架,充分恢復關節(jié)軟骨的原始成分、結構、力學和生物功能,以明膠、殼聚糖、絲素蛋白和羥基磷灰石為基礎材料,通過真空冷凍干燥和化學交聯(lián)開發(fā)一種能夠滿足骨軟骨ECM和成骨成軟骨雙向分化要求的三維多孔支架,探索其用于修復軟骨缺損的可行性。

1 方 法

1.1 材 料

蠶繭(西北養(yǎng)蠶工業(yè)基地);甲苯胺藍染色液、透析袋(北京索萊寶科技有限公司);脫乙酰度≥95%的殼聚糖、明膠、溴化鋰、N-羥基琥珀酰亞胺、碳酰二亞酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(?？寺yclone生物科技公司);澳洲胎牛血清(美國賽默飛公司Gibco胎牛血清);CCK-8細胞增殖試劑盒、活死細胞染色試劑盒(Abbkine亞科因生物技術有限公司);碳酸氫鈉(國藥集團藥業(yè)有限公司),II型膠原酶(百普賽斯Bioshap生物科技公司)

1.2 主要實驗溶液的配制

1.2.1 殼聚糖溶液

稱取3 g殼聚糖(脫乙酰度≥95%)粉末溶解于100 mL 1%醋酸溶液中,磁力攪拌4 h直至完全溶解,然后過濾溶液以除去雜質。

1.2.2 明膠溶液

稱取3 g生物明膠溶解于50 ℃ 100 mL超純水中,水浴加熱并持續(xù)攪拌至完全溶解。

1.2.3 絲素蛋白溶液

1) 脫膠:挑選優(yōu)質干凈的蠶繭,將切好的繭塊加入沸騰的0.5% Na2CO3溶液中,煮沸60 min,然后用蒸餾水浸泡洗滌10 min,重復2～3次后烘干。2) 溶解:按照1︰6的比例將脫膠蠶絲在60 ℃條件下溶解于9.3 mol/L LiBr溶液中。3) 過濾離心:冷卻至室溫,使用不銹鋼過濾網過濾去除較大顆粒雜質,以9 000 r/min速度離心10 min。4) 透析:將離心后的絲素蛋白溶液轉移至截留相對分子質量12 000±2 000的透析袋中,超純水持續(xù)透析3 d,直至透析袋內水位不再變化。5) 濃縮:將含絲素蛋白溶液的透析袋放入質量分數(shù)10%的聚乙二醇溶液中進行濃縮12 h,保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 SF-CS-Gel-nHap支架的制備

將質量分數(shù)為3%的SF溶液、CS溶液、Gel溶液分別以1︰1︰1體積比混合均勻,調整Hap的量,根據Hap在混合溶液質量分數(shù)的不同,SF-CS-Gel-nHap復合溶液分為5組(Hap-1%、Hap-2%、Hap-3%、Hap-4%、Hap-5%),磁力攪拌60 min混合均勻,然后以每孔1 mL轉移至48孔板內。在-20 ℃預凍過夜,放入-80 ℃冰箱中繼續(xù)冷凍24 h,然后真空冷凍干燥48 h,經第一次塑形得到規(guī)則、圓柱狀的冷凍干燥支架。冷凍干燥后每孔中加入2 mL交聯(lián)劑,交聯(lián)劑各成分分別為碳化二亞胺鹽50 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺25 mmol/L。在4 ℃條件下充分交聯(lián)過夜,然后用75%乙醇和去離子水清洗數(shù)次,加入75%乙醇溶液浸泡24 h,1 mol/L NaOH溶液浸泡中和6 h,去離子水洗凈。再次放于-20 ℃冷凍過夜,-80 ℃冷凍24 h后行真空干燥48 h,進行第二次塑形。干燥完成后,將支架收集密封,置于4 ℃冰箱,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 物理性能表征

1.4.1 大體外觀

將不同類型的3D支架從48孔板中取出進行拍照觀察。

1.4.2 掃描電鏡觀察

使用手術刀片將每個支架樣品切成合適厚度,常規(guī)涂覆金膜后,通過Regulus 8100掃描電子顯微鏡(日本日立公司)對支架的內部結構和形貌進行分析;采用ImageJ圖像可視化軟件對樣品進行孔徑分析,平均孔徑是通過測量在樣品中心部分至少隨機選擇的20個孔的最大和最小直徑來獲得。

1.4.3 X射線衍射(XRD)分析

將支架研磨成粉末,使用D8 advance全自動X射線衍射儀(美國布魯克海文儀器公司)對粉末樣品進行表征,X射線衍射儀在35 kV和10 mA的條件下用Cukα輻射(λ=1.542)記錄樣品的衍射圖,掃描2θ角范圍為5°～60°,掃描速率為5°/min。

1.4.4 溶脹率

用常規(guī)重量法測定各組支架的吸水溶脹率。將冷凍干燥后的支架后稱重記為M1,然后浸泡于PBS緩沖液(pH 7.4)中24 h后,取出樣品,用紗布吸去支架表面多余的水分,稱重記為M2。每組實驗進行3次。吸水溶脹率S計算如下式所示:

(1)

1.4.5 孔隙率

采用比重瓶法測定各組復合支架的孔隙率。用手術刀片將各支架切成統(tǒng)一大小的樣品,以無水乙醇為液體介質,稱量充滿無水乙醇的比重瓶,質量記為M1,將干重M0的支架浸入無水乙醇中,真空脫泡30 min,直至支架完全被無水乙醇所飽和,加入乙醇直至比重瓶充滿相同刻度,再次稱重,記為M2。取出充盈乙醇的樣品,稱量剩余的液體與比重瓶質量,記為M3。支架孔隙率ε計算如下式所示:

(2)

1.4.6 生物降解率

支架的體外酶降解實驗根據支架在含酶的磷酸鹽緩沖液中孵育后的殘留量百分比來評價支架的降解行為。真空干燥后的支架質量記錄為M1,然后用含10 mg/mL溶菌酶的PBS緩沖液(pH 7.4)37 ℃浸泡4周。在規(guī)定的時間間隔(7、14、21、28 d)取出樣品,真空干燥24 h,稱重記為Mt。生物降解率δ計算如下式所示:

(3)

1.4.7 機械性能

使用ETM系列通用萬能試驗機(深圳萬測試驗設備有限公司)進行壓縮機械測試。在每次測試之前測量樣品大小,支架樣品為直徑約10 mm、高15～18 mm的圓柱體,水平頭速度設定為2 mm/min,當壓縮位移達到10 mm時停止加壓。然后繪制應力-應變曲線以評估支架的機械性,應力-應變曲線初始線性階段的斜率為彈性模量,每組3個平行樣。

1.5 生物性能表征

1.5.1 軟骨細胞的提取和鑒定

本研究經大連大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(倫理審查批件2021073-1),并獲得所有研究對象的知情同意。納入2021年11月因骨關節(jié)炎行全膝關節(jié)置換術的患者1例(年齡52歲,職業(yè)木工)。收集膝關節(jié)置換術中切除的股骨髁軟骨,無菌條件下轉移至在超凈工作臺,使用含無菌PBS緩沖液連續(xù)漂洗2～3次,分離出光滑透亮的透明軟骨組織薄片,切成2 mm大小的組織塊,之后使用5倍體積的0.2% Ⅱ型膠原酶消化過夜(37 ℃和5% CO2恒溫培養(yǎng)箱)。消化結束后使用100 μm細胞濾器過濾,然后終止消化,將獲得的細胞懸液在室溫下以1 500 r/min的速度離心5 min,收集細胞沉淀,重懸后接種到T 25 cm2培養(yǎng)瓶,在37 ℃和5% CO2的細胞孵箱中培養(yǎng),24 h后更換一次培養(yǎng)液以去除未貼壁的細胞。此后每3 d換液一次,建立原代培養(yǎng),當貼壁細胞達到90%匯合時,用無菌PBS緩沖液洗滌后使用胰蛋白酶(含EDTA)進行消化處理并將細胞以1︰2的傳代比例重新接種以進行傳代培養(yǎng),直到細胞達到第2代,使用甲苯胺藍染色對軟骨細胞進行鑒定。

1.5.2 支架接種前的處理

將支架樣品切成直徑10 mm、厚度1～2 mm的薄片,在紫外光下用75%酒精消毒過夜,然后用無菌PBS緩沖液徹底沖洗3次。在細胞培養(yǎng)之前,通過在37 ℃的培養(yǎng)箱中浸入DMEM中2 h將支架預潤濕。

1.5.3 黏附率

取傳代培養(yǎng)至第2代的軟骨細胞懸液,將含有105個/mL細胞(A0)的細胞懸液100 μL接種在預先潤濕的支架上,然后添加培養(yǎng)基至300 μL,并在接種2、4、6 h后測量黏附率。從孔中取出支架,用細胞計數(shù)板(A1)計數(shù)細胞數(shù),去除所有培養(yǎng)基溶液后,消化并計算黏附在孔壁上的細胞(A2)。細胞黏附率θ計算如下式所示:

(4)

每組進行3次實驗,得到平均黏附率。

1.5.4 增殖率

使用CCK-8法檢測支架上軟骨細胞的增殖,將軟骨細胞接種在支架上(每個支架104個細胞),48孔板每孔添加培養(yǎng)基至300 μL。每3天更換一次培養(yǎng)基,經過1、4、7、10 d培養(yǎng)后,30 μL CCK-8的反應溶液加入到每個孔中,并在37 ℃溫育4 h。然后將100 μL含有CCK-8反應液的培養(yǎng)基轉移到96孔細胞培養(yǎng)板中,使用Biotek 800TS酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)在450 nm處讀取吸光度,繪制生長曲線,所有實驗一式三份進行。

1.5.5 活死細胞染色

細胞接種3 d后使用Live/Dead試劑盒進行染色,觀察細胞在支架樣品上的分布。該試劑盒分別用碘化丙啶和Calcein AM對死細胞、活細胞進行染色,并在細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后,使用TXM-500C熒光顯微鏡(上海天省光學儀器有限公司)觀察。

1.6 統(tǒng)計分析

多組樣本間的比較使用SPSS 20.0軟件進行ANOVA單因素方差分析,然后進行Tukey’s檢驗,以確定組間測量數(shù)據的差異。獨立樣本數(shù)據的比較使用t檢驗,重復測量數(shù)據使用球形檢驗,認為p<0.05具有統(tǒng)計學意義。置信度記號標為:*表示p<0.05,** 表示p<0.01,*** 表示p<0.001)。

2 結果和分析

2.1 物理性能

2.1.1 大體外觀

5組SF-CS-Gel-nHap多孔支架均為直徑10 mm左右的白色圓柱體,隨著支架內Hap質量分數(shù)的增加,支架底部可見少量沉積的羥基磷灰石,質量分數(shù)越高沉積越多,如圖1所示。

圖1 SF-CS-Gel-nHap多孔支架大體外觀

2.1.2 掃描電鏡觀察

各組支架掃描電鏡圖像如圖2所示。由圖2可見,Hap-1%支架、Hap-2%支架、Hap-3%支架、Hap-4%支架具有多孔結構,Hap-1%支架的平均孔徑最大,為(225.14±53.63) μm;Hap-2%支架、Hap-3%支架、Hap-4%支架的孔徑分別為(212.89±62.22) μm、(171.30±31.87) μm、(169.73±26.19) μm;Hap-5%支架的平均孔徑最小,為(136.11±20.46) μm。當支架內Hap的質量分數(shù)在1%～4%變化時,支架能保持高度多孔的網絡結構和良好的孔間聯(lián)通性,隨著Hap在支架中質量分數(shù)的增加,多孔材料的孔徑有所減小,支架的聯(lián)通性下降;當Hap的質量分數(shù)達到5%及以上時,可以明顯看到過量的羥基磷灰石沉積在多孔支架的孔壁上,逐漸堵塞支架的孔道。合適的微觀結構和孔徑,能夠提供遷移細胞、運輸營養(yǎng)物質和代謝物、信號分子和細胞廢物[11-12]。

圖2 SF-CS-Gel-nHap多孔支架電鏡圖像

2.1.3 XRD晶型分析

通過XRD對SF-CS-Gel-nHap多孔支架的晶型結構進行了分析,SF-CS-Gel-nHap支架的XRD圖譜如圖3所示。由圖3可見,2θ在25.7°、32.2°、33.0°、34.3°、40.3°、46.6°和49.6°附近能觀察到羥基磷灰石的特征峰。對比低質量分數(shù)和高質量分數(shù)Hap的復合支架材料的XRD圖譜,還可以觀察到羥基磷灰石少量水解和新的磷酸鈣化合物生成。這是因為冰乙酸溶解殼聚糖為溶液提供了酸性環(huán)境,微酸條件下部分羥基磷灰石發(fā)生水解,從而形成新的磷酸鈣化合物(2θ=28.4°和29.1°),有研究指出磷酸鈣化合物的存在不會干擾支架的生物活性或生物相容性[10,13]。

圖3 SF-CS-Gel-nHap支架XRD圖譜

2.1.4 元素分析

電鏡掃描和XRD晶型分析證實,在多孔復合材料表面沉積層中存在結晶簇聚集體,如圖2(f)所示。為了確保添加的Hap顆粒確實存在于復合材料中,本研究對SF-CS-Gel-nHap多孔支架進行了元素分析。X射線能譜分析儀(Energy Dispersive Analysis of X-rays,EDAX)元素檢測的結果表明,結晶簇的主要元素是Ca和P,如圖4所示。檢測到的結晶簇聚集體內的Ca/P比值約為1.74,其值與化學計量羥基磷灰石中的Ca/P比值1.67接近[14-15],據文獻報道穩(wěn)定的Hap相對應的Ca/P比值在1.3～1.8[16],表明Hap在支架基質內能夠穩(wěn)定存在。

圖4 SF-CS-Gel-nHap多孔支架元素分析

2.1.5 吸水溶脹率

支架的保水性能對組織工程有重要意義,吸水溶脹率影響細胞的遷移、增殖和分化,也影響營養(yǎng)物質的運輸和機械性能[17]。SF-CS-Gel-nHap多孔支架的吸水溶脹率如圖5所示,5組支架吸水溶脹率之間的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Hap-1%支架和Hap-2%支架的吸水溶脹率最高,分別為1 466%±179%和1 286%±114%;Hap-5%支架的吸水膨脹率最低,為771%±89%。隨著SF-CS-Gel-nHap復合支架內羥基磷灰石質量分數(shù)的增加,支架的吸水溶脹率明顯降低,即使是Hap-5%支架的平均溶脹率依然大于700%。

圖5 SF-CS-Gel-nHap多孔支架溶脹率比較

2.1.6 孔隙率

多孔復合支架的營養(yǎng)運輸能力除了受材料本身親水性能的影響外,還與支架的孔隙率、孔徑大小及孔道聯(lián)通性密切相關[17-18]。因此孔隙率也是組織工程支架的重要特征之一。SF-CS-Gel-nHap復合支架的孔隙率如圖6所示,5組支架孔隙率之間的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。SF-CS-Gel-1%Hap支架的孔隙率最高,約為87.25%±2.28%。Hap-2%的支架和Hap-3%的支架具有相似的孔隙率,分別為76.52%±2.31%和72.27%±2.28%。Hap-5%支架的孔隙率最低,只有49.41%±5.92%,多孔支架的孔隙率隨著支架內部Hap質量分數(shù)的增加而明顯降低。分析認為,這是隨著復合支架內羥基磷灰石質量分數(shù)的增加,過量的羥磷灰石會沉積在多孔支架的孔壁內,堵塞孔徑,使多孔支架結構通道的聯(lián)通性降低,從而導致支架的孔隙率下降。孔隙率大于70%的多孔支架被認為是細胞生存的良好空間和維持細胞生長的營養(yǎng)運輸通道[18],高度多孔的結構可以提供足夠的營養(yǎng)和氣體交換,以及足夠的空間供細胞增殖和附著[19-20]。摻雜低質量分數(shù)Hap的SF-CS-Gel-nHap的多孔支架,不僅可以提供高度多孔的結構,為細胞的黏附、遷移和生長提供了很大的表面積,還能兼顧保持Hap的生物活性和促成骨作用,也許更適合骨軟骨缺損的修復。

圖6 SF-CS-Gel-nHap多孔支架孔隙率比較

2.1.7 生物降解率

本研究使用溶菌酶對SF-CS-Gel-nHap多孔支架進行了體外降解實驗,如圖7所示,5組支架生物降解率之間的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Hap-1%支架降解率最高41.8%±2.47%,Hap-5%支架的降解率最低24.89%±1.16%,支架生物降解率隨著羥基磷灰石質量分數(shù)的增加而降低。這一結果與軟骨下骨層多孔支架孔隙率結果一致,這可能是因為低質量分數(shù)Hap的復合支架具有較高的孔隙率,多孔結構提供了較大的比表面積,導致溶菌酶更容易滲透進支架內部與殼聚糖、明膠等有機材料發(fā)生反應;另一個可能的原因是羥基磷灰石是天然骨骼的礦物質成分,本身具有優(yōu)良的結合能力和原位降解緩慢等優(yōu)勢[14-15],因此適當添加Hap可以改善多孔復合支架降解速度快的缺點,從而使多孔支架的生物降解速度與組織的再生重建相匹配。

圖7 SF-CS-Gel-nHap多孔支架的生物降解率(p<0.05)

2.1.8 機械性能

機械強度也是評估軟骨修復生物材料性能的最關鍵因素之一,SF-CS-Gel-nHap支架的應力-應變曲線如圖8所示。這次實驗通過比較多孔支架的彈性模量(線性應力-應變部分的斜率)和20%形變量的抗壓強度評價多孔支架的力學性能,SF-CS-Gel-1%Hap支架的抗壓強度最低(14.44 kPa),SF-CS-Gel-5%Hap支架的抗壓強度最高(40.28 kPa),SF-CS-Gel-nHap多孔支架抗壓強度隨Hap的質量分數(shù)增加而增大,高質量分數(shù)的Hap的有助于提高支架的抗壓強度。然而SF-CS-Gel-nHap支架的彈性模量變化與抗壓強度變化并不完全一致,此次實驗結果顯示SF-CS-Gel-1%Hap支架的彈性模量最低,Hap質量分數(shù)在2%～5%的多孔支架擁有相似的彈性模量,并不隨Hap質量分數(shù)的增加而發(fā)生明顯改變。支架的機械性能影響細胞的增殖和分化,在較硬結構上生長的細胞比在較軟基質上的細胞增殖更快,遷移更慢[20]。因此用于軟骨修復的支架需要足夠堅固、有彈性和堅韌,以容納種子細胞或從宿主組織遷移的細胞,同時具有足夠的容量以抵抗反復的動態(tài)沖擊而不會倒塌或壓碎[21-22]。

圖8 SF-CS-Gel-nHap多孔支架的應力-應變曲線

2.2 生物性能

理想組織工程支架需要具備多種能力,如高度水合的三維結構和高含水量、合適的孔徑和孔隙率、材料交換能力、良好的生物降解性和優(yōu)越的機械性能,并能提供合適的微環(huán)境和高效的生物相容性和高強度[22]。綜合本研究的物理性能檢測結果,SF-CS-Gel-2%Hap支架更符合全層軟骨缺損修復的要求。該支架具有(212.89±62.22) μm大小的孔徑結構、76.52%±2.31%的孔隙率、良好的吸水溶脹率1 286%±114%及37.09%±1.41%生物降解速率與良好的機械性能。因此將SF-CS-Gel-2%Hap支架與骨關節(jié)炎患者的軟骨細胞共培養(yǎng),以進一步檢測支架材料的生物性能。

2.2.1 軟骨細胞的培養(yǎng)和鑒定

原代軟骨細胞形態(tài)大多為梭形和多角形,細胞在貼壁2 d后開始較好地附著在細胞培養(yǎng)瓶表面并開始增殖,并在7～9 d后達到90%的匯合狀態(tài)。傳代細胞表現(xiàn)出相似的形態(tài),絕大數(shù)細胞表現(xiàn)為多角形,表面多樹突狀突起,隨著培養(yǎng)時間增加,樹突狀突起伸展為細長觸絲,如圖9所示。使用甲苯胺藍對提取的原代細胞進行染色,細胞核被染成紫藍色,胞核偏向一側,未見肥大樣細胞,符合軟骨細胞的特征,如圖9(c)所示。

圖9 軟骨細胞的培養(yǎng)及鑒定

2.2.2 黏附率

理想的生物支架可以改善細胞黏附、細胞分化和與周圍天然組織的整合[10]。本研究比較了SF-CS-Gel-2%Hap支架在接種細胞2、4、6 h后的黏附率,如圖10所示。由圖10可見,軟骨細胞能與支架良好黏附,細胞種板后6 h內可成功黏附于支架網狀纖維上,表明SF-CS-Gel-2%Hap支架很好地保持材料優(yōu)良的生物活性。

圖10 細胞黏附率

2.2.3 增殖率

本研究使用CCK-8法檢測軟骨細胞在SF-CS-Gel-2%Hap支架的增殖表達,如圖11所示。由圖11可見,單純軟骨細胞組增殖曲線呈S形,而仿生支架共培養(yǎng)組軟骨細胞在連續(xù)共培養(yǎng)10 d后,生長增殖曲線仍然呈明顯上升趨勢,保持有良好的細胞活力,未觀察到明顯的接觸抑制效應。這主要是因為軟骨細胞在普通培養(yǎng)皿表面貼壁生長,細胞增殖存在明顯的接觸抑制效應,但是三維立體培養(yǎng)可以避免這種效應。結果表明,本研究制備的SF-CS-Gel-2%Hap多孔支架具有良好細胞相容性,能夠為種子細胞提供良好的生長微環(huán)境,三維立體培養(yǎng)比二維平面擴展生長具有更大的增殖效率。

圖11 細胞增殖率

2.2.4 活死染色

為了直觀地觀察細胞在支架上的狀態(tài)和活性,共培養(yǎng)一段時間后使用Live/Dead試劑盒進行染色,然后通過熒光顯微鏡觀察(10×10倍),如圖12所示,綠色代表活細胞,而紅色代表死細胞。由圖12可見,SF-CS-Gel支架上的大部分細胞呈現(xiàn)綠色熒光,少見死細胞,支架上細胞表現(xiàn)出高存活率和低細胞毒性,表明本研究所制備的多孔支架具有良好的生物相容性。

圖12 活/死細胞染色

3 結 論

基于明膠、殼聚糖、絲素蛋白和納米羥基磷灰石制備的SF-CS-Gel-nHap三維多孔復合支架不僅可以模擬天然骨軟骨的ECM,而且具有良好的生物相容性,能夠為營養(yǎng)物質的轉運和細胞附著、增殖和立體生長提供良好的網狀骨架,從而為全層軟骨缺損的治療提供新的選擇。

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