文冠果XsSCL6基因克隆及表達分析

趙雅欣,陳雨欣,盧涵冰,顏秉舟,敖 妍*

(1 北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室,北京 100083;2 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心,北京 100083;3 遼寧文冠實業(yè)開發(fā)有限公司,遼寧朝陽 122000)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)屬于無患子科文冠果屬植物,種子含油量高,是中國特有的木本油料樹種,分布在東北、西北和華北地區(qū)[1]。文冠果雌雄同株異花,花分為雌能花和雄能花,雌能花的雌蕊發(fā)育正常并且可結(jié)實,但雄蕊退化不能散粉;雄能花的雄蕊發(fā)育正常,雌蕊退化敗育[2-3]。文冠果的頂芽多發(fā)育為雌能花,側(cè)芽多發(fā)育為雄能花。因此,雌能花的數(shù)量遠少于雄能花,導(dǎo)致文冠果綜合利用產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原料供應(yīng)受到制約[4]。因此,減少雄花雌蕊敗育能夠提高雌雄花比例,對解決文冠果產(chǎn)量低的瓶頸問題具有重要意義。通過克隆轉(zhuǎn)錄組中篩選到的文冠果雌蕊發(fā)育的關(guān)鍵差異基因XsSCL6,結(jié)合生物信息學(xué)解析其作用機制,旨在為進一步研究文冠果雄花雌蕊敗育的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

GRAS家族是植物特有的一類重要轉(zhuǎn)錄因子,在植物大多數(shù)的生長發(fā)育過程中均能發(fā)揮作用[5]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特征,GRAS家族蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)特征分為SHR、SCR、LISCL、PAT1、SCL、DELLA、LS和HAM等亞家族[6]。HAM亞家族蛋白(scarecrow-like 6,SCL6)能夠參與調(diào)控激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]、脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]、根系發(fā)育[9]、葉片形成[10]、花芽分化[11]、生殖生長的轉(zhuǎn)化[12]和花器官發(fā)育[13]等多種生長發(fā)育進程。研究發(fā)現(xiàn)HAM的功能缺失促使植物莖端分生組織(shoot apical meristem,SAM)發(fā)生分化,導(dǎo)致植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)換至生殖生長,開花提前[12]。例如,擬南芥(Arabidopsisthaliana)3個HAM同源基因SCL6、SCL22和SCL27缺失表現(xiàn)出開花提前和花器官部分缺失等表型[14]。矮牽牛(Petuniahybrida)的HAM基因缺失突變體ham中表現(xiàn)出類似的表型[13]。竹子(Bambusoideae)中HAM類同源基因DlSCL6在擬南芥中異位表達,表現(xiàn)出開花延遲[15]。在水稻(Oryzasativa)中,scl6-IIb突變體表現(xiàn)為產(chǎn)量顯著降低、開花延遲[16]。因此,SCL6在植物開花、花發(fā)育和生殖生長等過程中有重要作用。

MicroRNA(miRNA)是大約21個核苷酸的非編碼RNA,能夠通過堿基互補配對原則抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。研究發(fā)現(xiàn),miR171能夠靶向GRAS基因,通過抑制SCL6、SCL22和SCL27等基因的表達控制植物發(fā)育過程[18]。擬南芥中,miR171a在花序中表達量最高,并且通過裂解SCL6基因降低其表達量[19]。過表達MIR171c的擬南芥與scl6突變體具有相似的表型,表現(xiàn)出分枝減少,開花提前等特征[20]。黃瓜(Cucumissativus)Csa-MIR171a的擬南芥過表達植株表現(xiàn)出花器官增大、果實增大和開花提前等特征,AtSCL6基因表達量顯著下調(diào)[21]。因此,SCL6基因可能會受到miR171的負調(diào)控而發(fā)揮不同的作用。

然而,XsSCL6基因在文冠果雌蕊發(fā)育中的作用尚不清晰,文冠果雌蕊中的miR171是否靶向XsSCL6基因發(fā)揮作用尚不明確。本研究在獲得文冠果雌蕊敗育全轉(zhuǎn)錄組和文冠果參考基因組的基礎(chǔ)上,利用PCR擴增得到4個XsSCL6基因的CDS全長序列,并構(gòu)建主效作用基因pBI121-XsSCL6a-GFP表達載體進行亞細胞定位,驗證XsSCL6a是否為轉(zhuǎn)錄因子。利用生物信息學(xué)分析XsSCL6基因序列結(jié)構(gòu)和染色體定位;預(yù)測XsSCL6基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和二、三級結(jié)構(gòu)特性;分析XsSCL6基因啟動子順式作用元件功能;預(yù)測miR171和XsSCL6的靶向作用關(guān)系,解析miR171和XsSCL6基因在雌蕊敗育過程中的表達模式。此外,利用qRT-PCR技術(shù)驗證XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在文冠果雌蕊敗育過程的中表達模式。研究結(jié)果可為后續(xù)進一步解析XsSCL6轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控文冠果雌蕊發(fā)育的分子機制提供理論參考,為增加文冠果雌花數(shù)量和果實產(chǎn)量提供了新的策略。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2021年4月19至5月7日在遼寧省朝陽市文冠果試驗基地(120°16′E,41°25′N)11號優(yōu)良無性系中采集。采樣期內(nèi)每天從東西南北方向選取頂芽、側(cè)芽為材料,分別取出雌蕊組織(圖1)經(jīng)液氮速凍后存入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?月21日、4月26日和4月29日的雌蕊樣品分別命名為雌蕊敗育前期(B)、雌蕊敗育中期(C)和雌蕊敗育后期(E),每個樣品包含3組生物學(xué)重復(fù),用于全轉(zhuǎn)錄組測序和檢測基因表達量。mRNA和sRNA測序基于HiSeq平臺完成,cDNA文庫構(gòu)建、sRNA文庫構(gòu)建和 Illumina 測序均委托北京百邁客生物科技有限公司(Biomarker)完成。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中建立了FPKM(fragments per kilobase million)表達矩陣以篩選差異表達基因,TPM(transcripts per million)表達矩陣用于篩選差異miRNA。根據(jù)文冠果雌蕊全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和Swissprot、Gene Ontology(GO)、KEGG Ortholog(KEGG)、Protein family(Pfam)等數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果,篩選出4個在雌雄花中差異表達的XsSCL6基因,分別命名為XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d(基因ID分別為EVM0021236.1;EVM0013538.1;EVM0011858.1;EVM0009975.1)。所有基因序列和氨基酸序列根據(jù)本課題組文冠果雌蕊轉(zhuǎn)錄組和NCBI文冠果參考基因組下載?！臼稀療煵?Nicotianabenthamiana)為亞細胞定位的受體材料。

圖1 文冠果的雌花和雄花

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取以及cDNA逆轉(zhuǎn)錄

按照RN52-EASYspin通用植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)的方法提取文冠果雌蕊總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000(thermo fisher scientific,MA,USA)檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。使用Takara PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)合成文冠果cDNA第一鏈。

1.2.2 文冠果XsSCL6基因克隆

利用軟件Primer 5.0設(shè)計XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因ORF上、下游引物(表1),并委托上海生工生物技術(shù)股份有限公司進行合成。

表1 研究所用的引物序列

表2 XsSCL6基因信息及編碼蛋白的理化性質(zhì)

以上述cDNA為模板進行擴增,PCR程序:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,36個循環(huán),最后再72 ℃延伸10 min。擴增得到DNA片段使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。DNA片段經(jīng)過回收純化后,連接到pTOPO-Blunt載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10進行PCR鑒定后測序,使用30%甘油保存測序正確的菌株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 文冠果XsSCL6基因生物信息學(xué)分析

使用在線工具ProtParam預(yù)測XsSCL6蛋白理化性質(zhì),利用SOPMA預(yù)測XsSCL6蛋白二級結(jié)構(gòu),并使用WoLF PSORT預(yù)測XsSCL6蛋白的亞細胞定位。利用SWISS-MODEL建模XsSCL6蛋白三維結(jié)構(gòu)。使用在線網(wǎng)站(http://mg2c.iaski.n/mg2c_v2.1/)對XsSCL6基因進行染色體定位。用在線軟件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析XsSCL6基因結(jié)構(gòu)。使用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)及MEME 網(wǎng)站(http://meme.nbcr.net/meme/)分析XsSCL6基因保守結(jié)構(gòu)域和保守基序(motif)。利用Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與XsSCL6基因同源的其他物種的相關(guān)序列,并用DNAMAN 8進行蛋白序列同源性分析,在MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建進化樹。利用Plant-CARE 數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析XsSCL6基因啟動子序列中的順式作用元件。

1.2.4 文冠果XsSCL6基因表達分析

基于XsSCL6基因全長序列及保守域的分析,使用Primer 5.0設(shè)計熒光定量PCR引物(表1),UBQ作為內(nèi)參基因。上述cDNA稀釋10倍作為qRT-PCR反應(yīng)模板,總反應(yīng)體系20 μL,各組分及體積:cDNA 2 μL;TB Green Premix Ex TaqⅡ(Til RNaseH Plus,TaKaRa)10 μL;Rox Reference Dye(Til RNaseH Plus,TaKaRa) 0.4 μL;正向引物及反向引物各 0.4 μL;RNase-free Water 6.8 μL。在Step One Plus(Applied Biosystems)中以如下反應(yīng)程序設(shè)置3次重復(fù):95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量,使用Origin 2022對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖。使用Excel和SPSS軟件統(tǒng)計分析相對表達量,采用單因素方差分析(one-way ANOVO)對其進行顯著性分析。

1.2.5 文冠果XsSCL6基因亞細胞定位

以測序正確XsSCL6a-pTOPO-Blunt大腸桿菌菌液為模板,BamHI-XsSCL6a-F和KpnI-XsSCL6a-R為引物(表1)擴增目的片段。使用BamHⅠ和KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切pBI121-GFP空載。擴增的目的片段和pBI121-EGFP空載線性載體進行同源重組后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)。

使用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取pBI121-EGFP和pBI121-XsSCL6a-GFP表達載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài),PCR驗證陽性單克隆菌株并測序。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法,將pBI121-EGFP和pBI121-XsSCL6a-GFP導(dǎo)入煙草葉片中,培養(yǎng)3 d后使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)觀察‘本氏’煙草葉片中的GFP熒光信號并拍照。

1.2.6 miR171和XsSCL6靶向關(guān)系分析

使用psRNA Target(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/),分別上傳xso-miR171s成熟體序列和XsSCL6基因序列進行靶向關(guān)系預(yù)測。根據(jù)文冠果雌蕊敗育轉(zhuǎn)錄組中xso-miR171s(TPM)和XsSCL6基因的表達量(FPKM),使用TBtools繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果XsSCL6基因的克隆

以文冠果雌蕊cDNA為模板,通過設(shè)計引物進行PCR擴增得到XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d完整的ORF序列(圖2),結(jié)果表明擴增片段的長度與預(yù)期相符。XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d的ORF測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)符合,表明文冠果XsSCL6基因存在4個同源基因。

M. DL5000.

2.2 XsSCL6基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

文冠果XsSCL6蛋白中XsSCL6a蛋白序列最長,由751個氨基酸編碼。而XsSCL6b蛋白序列最短,由669個氨基酸編碼。文冠果XsSCL6蛋白的相對分子量介于74 673.21～82 326.59 D之間,理論等電點介于5.67～6.33之間。文冠果XsSCL6蛋白的親水性平均系數(shù)介于(-0.397)～(-0.204)之間,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于53.69～61.7之間,均屬于親水不穩(wěn)定蛋白。

2.3 XsSCL6蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析

4個文冠果XsSCL6蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,其蛋白的高級結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲和α-螺旋為主(圖3),XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d的二級結(jié)構(gòu)曲線趨勢最相似。如表3所示,XsSCL6b和XsSCL6d的不規(guī)則卷曲占比更高,達到56%左右,而XsSCL6a和XsSCL6c蛋白不規(guī)則卷曲占比為52%左右。XsSCL6c蛋白的α-螺旋占比最高,達到36.26%,而XsSCL6d蛋白的α-螺旋占比最低,為29.43%;此外,XsSCL6蛋白的β-轉(zhuǎn)角均占比為3%左右。4個XsSCL6蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成(圖4),建模結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。

表3 文冠果XsSCL6蛋白二級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位預(yù)測

A. XsSCL6a;B. XsSCL6b;C. XsSCL6c;D. XsSCL6d.

亞細胞預(yù)測(表3)顯示,4個文冠果XsSCL6蛋白都定位在細胞核中。經(jīng)過煙草表皮細胞的亞細胞定位驗證(圖5),pBI121-GFP侵染煙草表皮細胞后細胞膜和細胞核中都有綠色熒光,融合表達載體pBI121-XsSCL6a-GFP在細胞核上集中檢測到綠色熒光,說明XsSCL6a蛋白定位在細胞核。

2.4 XsSCL6染色體分布及基因結(jié)構(gòu)分析

文冠果的4個XsSCL6基因分布在2條染色體上,其中XsSCL6a和XsSCL6d位于第1條染色體,XsSCL6b和XsSCL6c位于第11條染色體上(圖6,A)。文冠果XsSCL6基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,XsSCL6b和XsSCL6c基因序列中均包含內(nèi)含子區(qū)域,其他XsSCL6基因序列只包含UTR區(qū)和外顯子區(qū)(圖6,B);同時,結(jié)合motif和domain分析發(fā)現(xiàn)這4個XsSCL6基因motif類型及排列順序較為保守,都包含motif8、motif6、motif10、motif3、motif4、motif2、motif7和motif1,并且均具有GRAS保守結(jié)構(gòu)域;但是XsSCL6b基因中的GRAS結(jié)構(gòu)域為超家族,推測其功能與其他XsSCL6基因有所不同(圖6,C)。

A. XsSCL6基因在文冠果染色體的定位;B. XsSCL6基因的結(jié)構(gòu);C. XsSCL6蛋白的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域。

2.5 XsSCL6蛋白質(zhì)的同源比對和進化分析

圖7為文冠果和銀白楊(Populusalba)、白梨(Pyrusxbretschneideri)、大豆(Glycinemax)、黃瓜(Cucumissativus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)、萵筍(Lactucasativa)、本氏煙草(Nicotianatabacum)、蒂羅花(Telopeaspeciosissima)、阿月渾子(Pistaciavera)、克萊門柚(Citrusclementina)、甜橙(Citrussinensis)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的SCL6同源蛋白的系統(tǒng)進化樹。

圖7 XsSCL6與其他植物SCL6蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

結(jié)果表明,文冠果XsSCL6a、XsSCL6d和克萊門柚CcSCL6b、甜橙CsiSCL6a的親緣關(guān)系最近,其次是和銀白楊PaSCL6a、PaSCL6c和PaSCL6b的親緣關(guān)系近,文冠果XsSCL6b、XsSCL6c和克萊門柚CcSCL6a、甜橙CsiSCL6b和阿月渾子PvSCL6親緣關(guān)系最近。如圖8所示,文冠果XsSCL6蛋白和親緣關(guān)系最近的蛋白質(zhì)多序列比對發(fā)現(xiàn),蛋白序列總相似度為60.32%。文冠果XsSCL6a、XsSCL6d和CcSCL6b、甜橙CsiSCL6a蛋白序列總相似度為77.48%,文冠果XsSCL6b、XsSCL6c和克萊門柚CcSCL6、甜橙CsSCL6蛋白序列總相似度為77.68%。

圖8 XsSCL6與不同物種SCL6蛋白的氨基酸序列比對

2.6 XsSCL6啟動子分析

在文冠果4個XsSCL6基因的啟動子中,順式作用元件主要包括光信號響應(yīng)元件、植物發(fā)育相關(guān)作用元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件4個種類(圖9,A)。其中,XsSCL6基因的啟動子中逆境響應(yīng)元件和光信號響應(yīng)元件占比都較高,植物發(fā)育相關(guān)作用元件占比較少。對比4個XsSCL6基因發(fā)現(xiàn),XsSCL6a基因的啟動子中包含的元件數(shù)量最多,而XsSCL6d基因的啟動子中包含的元件數(shù)量最少;此外,XsSCL6基因所有啟動子中都包含激素響應(yīng)元件,XsSCL6a基因的啟動子中響應(yīng)激素元件數(shù)量最多。

A. XsSCL6基因的啟動子中順式作用元件的數(shù)量;B. 響應(yīng)不同激素的作用元件數(shù)量。

對激素相關(guān)順式作用元件進行分類有助于進一步分析XsSCL6基因在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(圖9,B)。XsSCL6基因的啟動子激素響應(yīng)元件主要包括茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、赤霉素(GA)和生長素(IAA)等響應(yīng)元件,說明XsSCL6可能應(yīng)答多種激素信號參與文冠果雌蕊生長發(fā)育。其中,4個XsSCL6基因的啟動子中都包含ABA和SA響應(yīng)元件,而JA和GA相關(guān)順式作用元件僅存在于XsSCL6a基因的啟動子中;另外,XsSCL6a基因的啟動子中激素響應(yīng)元件種類最多,僅沒有IAA響應(yīng)元件;XsSCL6d基因的啟動子中激素響應(yīng)元件種類最少,XsSCL6b和XsSCL6c基因的啟動子中激素響應(yīng)元件種類相同。

2.7 文冠果XsSCL6基因雌蕊敗育過程中表達模式分析

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組FPKM數(shù)據(jù)(圖10),利用qRT-PCR驗證了文冠果雌雄花的雌蕊組織中XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在不同雌蕊敗育時期的表達量(圖11)。

圖10 文冠果XsSCL6基因轉(zhuǎn)錄組FPKM數(shù)據(jù)分析

*表示同時期雌花和雄花中存在顯著差異(P<0.05)。

如圖10和圖11所示,該過程中,XsSCL6a基因在雌花中FPKM值和相對表達量均表現(xiàn)為降低趨勢;XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,與相對表達量的趨勢基本相同。在雄花中,XsSCL6a基因的FPKM值和相對表達量都隨著雌蕊敗育過程逐漸升高;XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因的FPKM值和相對表達量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。qRT-PCR實驗結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)保持良好的一致性,驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的有效性和準(zhǔn)確性。

圖11為XsSCL6基因在雌蕊敗育前期、雌蕊敗育中期和雌蕊敗育后期在雌雄花中的表達量對比結(jié)果。在雌蕊敗育的3個時期,XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在雄花中的表達量顯著高于雌花,表明XsSCL6基因可能參與了雌蕊敗育過程,并主要在雄花中發(fā)揮作用。此外,在雌蕊敗育后期,XsSCL6a基因在雄花中的表達量顯著高于其他基因;XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d在雌花的表達量均降至最低。

2.8 xso-miR171和XsSCL6基因靶向關(guān)系分析

基于已鑒定的xso-miR171a/b/c/d-3p成熟序列,利用psRNA target得到xso-miR171和XsSCL6基因靶向關(guān)系(表4)。預(yù)測結(jié)果顯示,xso-miR171a/b/c/d-3p均能夠靶向XsSCL6的4條同源基因,抑制方式均為裂解,每個XsSCL6基因可能被裂解的CDS區(qū)域一致。xso-miR171a-3p和xso-miR171d-3p對XsSCL6基因的錯配率均為1.5,xso-miR171b-3p和xso-miR171c-3p對XsSCL6基因的錯配率均為1,說明不同的xso-miR171對靶基因XsSCL6的作用強度可能存在差異。

表4 xso-miR171和XsSCL6基因靶向關(guān)系預(yù)測

圖12為基于轉(zhuǎn)錄組xso-miR171和XsSCL6基因TPM、FPKM繪制的表達量熱圖,雌蕊敗育過程中,xso-miR171a/b/c/d-3p在雌花中的表達量逐漸升高,而XsSCL6a在雌花中的表達量逐漸降低,XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d表達量也存在降低趨勢,同時,xso-miR171a/b/c/d-3p在雄花中的表達量逐漸降低,而XsSCL6a在雄花中的表達量逐漸升高,XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d表達量也存在升高趨勢。xso-miR171和XsSCL6基因相反的表達趨勢說明xso-miR171可能對XsSCL6基因存在靶向作用。

B、C和E分別表示雌蕊敗育前期、中期和后期;a表示雌花;b表示雄花。

3 討 論

植物GRAS轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、抗逆性和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的生物學(xué)功能,在多種植物中都有報道[22-25]。HAM亞家族與GRAS其他亞家族明顯不同,其基因序列上都包含高度匹配miR171的位點,并受到miR171的抑制調(diào)控作用[26]。大多數(shù)植物種HAM亞家族存在多個功能冗余的同源基因,其中1個基因出現(xiàn)突變不會出現(xiàn)明顯的表型變化[24]。例如擬南芥的HAM亞家族基因SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ突變體表現(xiàn)出側(cè)芽的數(shù)量少、葉和花發(fā)育不正常的表型,與過表達miR171c的表型[11]相似。本研究克隆得到4個文冠果XsSCL6基因序列都包含miR171靶向位點(GAT-ATTGGCGCGGCTCAATCA),說明XsSCL6基因?qū)儆贕RAS家族HAM亞家族,推測XsSCL6基因在文冠果雌蕊發(fā)育過程中共同發(fā)揮作用,并受到miR171的靶向調(diào)控。

對文冠果XsSCL6基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,XsSCL6a、XsSCL6c和XsSCL6d基因均包含GRAS保守結(jié)構(gòu)域,并且XsSCL6蛋白和其他物種的SCL6蛋白一致性高,和克萊門柚及甜橙的親緣關(guān)系最近,這與已報道的文冠果進化分析結(jié)果[27-28]相同。這說明XsSCL6基因可能和其他HAM亞家族具有相似的基因功能,推測能夠調(diào)控文冠果的側(cè)芽發(fā)育、花發(fā)育等。此外,4個XsSCL6蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成,文冠果XsSCL6蛋白為親水不穩(wěn)定蛋白,這與其他物種中SCL6的結(jié)構(gòu)特征及蛋白疏水性特征[15,24,29]類似。文冠果XsSCL6蛋白和其他物種蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相似也說明它們的功能可能具有相似性。本研究通過亞細胞定位的方式預(yù)測并驗證了關(guān)鍵XsSCL6a蛋白主要在細胞核中表達,表明XsSCL6a可能參與功能重要的復(fù)合物合成[30],確定XsSCL6a基因為在細胞核表達的轉(zhuǎn)錄因子,為后續(xù)在植物轉(zhuǎn)化體系對其進行深入功能研究提供理論基礎(chǔ)。

文冠果XsSCL6基因的啟動子中激素響應(yīng)類元件占比大,XsSCL6基因除了能對外界環(huán)境的光、低溫和干旱等信號做出響應(yīng),還可能主要通過應(yīng)答激素來參與文冠果雌蕊發(fā)育過程。每個XsSCL6基因的啟動子元件中都包含SA響應(yīng)元件,而SA在植物性別分化調(diào)控中具有重要作用,能夠影響花器官發(fā)育和分化[31-32]。特別是XsSCL6a基因啟動子的激素元件數(shù)量明顯多于其他基因,并包含了JA、SA和GA響應(yīng)元件。JA會影響植物花器官的形成和花朵開放[33-34],赤霉素途徑作為植物成花誘導(dǎo)的4條主要途徑之一,對植物生殖生長和花器官發(fā)育意義重大[35-37]。因此,推測XsSCL6a基因能夠響應(yīng)激素信號,并且是文冠果SCL6基因中發(fā)揮主要作用的基因。

植物SAM是保證植物持續(xù)生長和器官發(fā)育的重要基礎(chǔ),WUS/CLV3負反饋系統(tǒng)是SAM活性維持的核心[38-40],有很多其他基因共同參與植物SAM活性維持的自主調(diào)控系統(tǒng)。在石榴(Punicagranatum)中,發(fā)現(xiàn)PgWUS基因在兩性花中的表達量高于功能性雄花,在雌蕊中的表達量顯著高于雄蕊和莖尖[41]。本研究中的4個文冠果XsSCL6基因可能具有與其他植物類似的調(diào)控SAM狀態(tài)、影響開花和器官發(fā)育等功能。對文冠果XsSCL6基因qRT-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),4個XsSCL6基因的表達模式相似,在雌蕊敗育的3個時期,4個XsSCL6基因在雄花中的表達量顯著高于在雌花中。推測文冠果XsSCL6基因在雄能花的雌蕊中顯著高表達,影響了該部位的SAM活性維持的自主調(diào)控系統(tǒng)和其他調(diào)控基因,共同導(dǎo)致了雌蕊敗育的發(fā)生。此外,有研究發(fā)現(xiàn)甘菊ClSCL6a基因在花粉成熟前期表達量達到最高,在花粉發(fā)育中起重要作用[24]。Huang等[42]在土豆(Solanumtuberosum)miR171和靶基因的功能研究中也報道了HAM亞家族能夠參與雄蕊發(fā)育。文冠果XsSCL6基因在雄能花顯著高表達,表達量隨雌蕊敗育總體呈現(xiàn)出升高趨勢,可能是由于XsSCL6基因還具有促進雄蕊發(fā)育的作用,在一定程度上抑制了雌蕊的發(fā)育。綜上所述,XsSCL6基因在文冠果的花發(fā)育中的作用機制仍需要通過進行植物過表達等方法繼續(xù)研究,進一步解析并驗證XsSCL6基因的重要功能。