桃兒七種子休眠解除過(guò)程中細(xì)胞壁代謝及種皮超微結(jié)構(gòu)的變化

久西加,陳紅剛,2,王惠珍,2,曾翠云,2,杜 弢,2*

(1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 和政藥用植物園,甘肅 和政,731200;2 西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心,蘭州,730000)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]為小檗科(Berberidaceae)桃兒七屬(SinopodophyllumYing)多年生草本植物,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其果實(shí)及根莖均能入藥,具有調(diào)經(jīng)活血、祛風(fēng)除濕的作用[1]。藥理學(xué)研究表明桃兒七中含有的木脂素類成分鬼臼毒素及其衍生物具有明顯的抗腫瘤活性,可用于肺癌、肝癌、疣狀癌及尖銳濕疣等的治療[2],且以其衍生物制成的依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)已在臨床上廣泛應(yīng)用[3-4]。但是由于桃兒七種子所具有的休眠特性及市場(chǎng)需求的進(jìn)一步增加已導(dǎo)致其野生資源匱乏,目前被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[5]。

種子休眠是制約桃兒七規(guī)?；a(chǎn)的主要障礙,目前已有學(xué)者圍繞桃兒七種子休眠原因進(jìn)行了一系列研究,認(rèn)為桃兒七種子中的厚壁胚乳及內(nèi)源抑制物是其休眠產(chǎn)生的主要原因[6],且已有證據(jù)表明具有厚壁胚乳的種子通常伴隨著胚乳弱化才能完成萌發(fā),如萵苣種子胚乳細(xì)胞壁劇烈加厚,只有吸漲后細(xì)胞壁持續(xù)松弛,胚乳機(jī)械強(qiáng)度降低,才能最終完成萌發(fā)[7]。通常認(rèn)為細(xì)胞壁的松弛有兩種機(jī)制,一是酶促機(jī)制,即多個(gè)細(xì)胞壁降解酶的共同作用,二是非酶促機(jī)制,包括擴(kuò)張蛋白及活性氧等[8-9],細(xì)胞壁降解酶作用于細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等主要成分,影響細(xì)胞壁的剛性結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度,進(jìn)而影響種子的休眠和萌發(fā)[10]。研究表明,經(jīng)赤霉素處理的黃精種子內(nèi)細(xì)胞壁降解酶β-甘露聚糖酶、β-半乳糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶活性顯著升高,進(jìn)而導(dǎo)致胚乳細(xì)胞壁松弛,機(jī)械強(qiáng)度降低,促進(jìn)萌發(fā)[11],而活性氧則可以直接攻擊細(xì)胞壁多糖,從而導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛,促進(jìn)萌發(fā),如使用外源H2O2處理蘋(píng)果[12]和向日葵[13]的休眠種子時(shí),能有效促進(jìn)其萌發(fā)。

研究表明桃兒七種子在萌發(fā)過(guò)程中其細(xì)胞壁水解酶會(huì)上升積累,從而削弱厚壁胚乳對(duì)其萌發(fā)的阻礙[14];同時(shí),轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明,桃兒七種子的萌發(fā)也伴隨著水解酶基因的高表達(dá)[15],但對(duì)于層積過(guò)程中桃兒七種子內(nèi)的細(xì)胞壁代謝是否與休眠解除存在聯(lián)系,以及如何對(duì)休眠解除發(fā)揮作用等尚不明確。因此,本研究通過(guò)低溫層積解除桃兒七種子休眠,分析休眠解除過(guò)程中種子不同部位細(xì)胞壁組分及相關(guān)代謝酶的變化,同時(shí)利用掃描電鏡對(duì)種皮的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,以期建立細(xì)胞壁代謝與休眠解除的聯(lián)系,進(jìn)一步明確低溫層積影響桃兒七種子休眠解除的生理因素,更深入探究和理解桃兒七種子休眠機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]種子于2021年9月采于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園(35°15′48″N,103°24′21″E),并由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定確認(rèn),先經(jīng)清水浸泡,揉搓后去掉果肉,再過(guò)篩剔除癟粒,自然陰干,置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及試劑

試驗(yàn)儀器主要包括島津LC-20A高效液相色譜儀, KH5200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司), EX224ZH型電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司)及BT125D型1/100000電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。試劑對(duì)照品對(duì)羥基苯甲醛(B20327)、香草醛(100491-201902)和丁香醛(B20302),均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%;甲醇(019318)、乙腈(0211128)為色譜純,均購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司;娃哈哈純凈水(天水娃哈哈食品有限公司)。

1.3 種子低溫層積處理

將河沙洗凈過(guò)篩(40目),高壓滅菌鍋滅菌(121 ℃,30 min),鋪至距容器底部3～4 cm處,將桃兒七種子裝入紗布網(wǎng)袋平鋪于河沙之上,再蓋河沙至距容器底部6～8 cm處,保證種子處于容器中部,沙子濕度為9%～11%,用保鮮膜封住容器,打孔透氣,將容器置于4 ℃冰箱中。在層積處理0,15,30,45,60,75,90 d定期取樣,每次取種子30 g,然后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 種皮掃描電鏡觀察

隨機(jī)取各層積階段的種子 10 粒,全部觀察,挑選其中視野效果好,具代表性種子,借助掃描電鏡(SEM)對(duì)桃兒七種孔處以及近胚根處種皮縱切面進(jìn)行觀察。(1)取材固定:新鮮組織確定取材部位,盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷,1～3 min內(nèi)取樣,組織塊面積不超過(guò) 3 mm2,用 PBS 輕輕漂洗掉樣本表面污漬,保護(hù)好需要掃描的面并做好標(biāo)記,迅速投入電鏡固定液室溫固定2 h,再轉(zhuǎn)移至 4 ℃保存。(2)后固定:固定好的樣品經(jīng) 0.1 mol/L 磷酸緩沖液 PB(pH 7.4)漂洗 3 次,每次 15 min;0.1 mol/L磷酸緩沖液 PB(pH 7.4)配制 1%鋨酸室溫避光固定 1～2 h;0.1 mol/L 磷酸緩沖液 PB(pH 7.4)漂洗 3 次,每次15 min。(3)脫水:組織依次放入 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精,每次15 min,乙酸異戊酯15 min;(4)干燥:將樣本放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。(5)樣本導(dǎo)電處理:將樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上,放入離子濺射儀樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金30 s 左右;(6)掃描電子顯微鏡下觀察采圖。

1.5 種子細(xì)胞壁組分含量及相關(guān)代謝酶活性測(cè)定

桃兒七種子纖維素含量、半纖維素含量、果膠含量以及纖維素酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、多聚半乳糖醛縮酶、果膠甲酯酶、苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性均采用試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測(cè)定,具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 木質(zhì)素單體含量測(cè)定

1.6.1 細(xì)胞壁組分的分離

將桃兒七種子胚乳及種皮分離并風(fēng)干,直到含水量恒定,液氮研磨。按如下步驟提取細(xì)胞壁組分:向50 mL離心管中添加1.0 g粉末,添加35 mL 50 mmol/L NaCl并超聲處理30 min,然后在4 000g下離心樣品2 min,去除溶劑,繼續(xù)分別添加35 mL 80%乙醇、丙酮和甲醇,超聲處理30 min,離心并去除溶劑。在50 ℃下通過(guò)烘箱干燥材料,直到樣品含水量穩(wěn)定。

1.6.2 樣品制備

將提取的干樣品取0.2 g懸浮在3 mL,2 mol/L氫氧化鈉和0.5 mL硝基苯于50 mL消化管中混合;將樣品置于微波消解儀(Multiwave 3000),于170 ℃恒定溫度下處理1 h,當(dāng)溫度降至60 ℃時(shí),取出消化管;然后將反應(yīng)混合物在5 000g下離心2 min,并將頂部的水相轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中;再用乙酸乙酯(40 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,利用氮吹儀(Termovap Sample Concentrator)去除溶劑,樣品加入25 mL色譜級(jí)甲醇,并過(guò)0.22微孔濾膜待測(cè)。

1.6.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛3種對(duì)照品各5.15 mg、5.00 mg、2.45 mg,置于 10 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,分別得到對(duì)照品系列濃度儲(chǔ)備液。

1.6.4 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(4.6mm×250mm)。流動(dòng)相A為含5%乙腈的0.02 mol/L NaH2PO4的水(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.9),流動(dòng)相B為甲醇/乙腈(50%V/50%V)。梯度洗脫,0～5 min,5%～15%B;5～8 min,15%～20%B;8～10 min,20%～25%B;10～12 min,25%～27%B;12～15 min,27%B;15～20 min,27%～30%B;20～25 min,30%～60%B;25～30 min,60%～80%B;30～35 min,80%～100%B;35～45 min,100%B;45～50 min,100%～5%B;50～55 min,5%B。流速為1.0 mL/min,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為90 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm。

1.6.5 方法學(xué)考察

(1)精密度試驗(yàn):取 1.6.3節(jié)混合對(duì)照品溶液,按1.6.4節(jié)色譜條件檢測(cè)指紋圖譜,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積RSD值。計(jì)算得到對(duì)羥基苯甲醛RSD為0.70%,香草醛RSD為0.50%,丁香醛RSD為0.66%,表明儀器精密度良好。(2)重復(fù)性試驗(yàn):取同一樣品,按 1.6.2節(jié)制備方法平行制備6份供試品溶液,按1.6.4節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè),記錄各成分峰面積,計(jì)算各成分含量RSD分別為0.72%、0.62%、0.16%,表明樣品重復(fù)性良好。(3) 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一樣品,按1.6.2節(jié)方法制備供試品溶液,按1.6.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),分別在0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣。記錄色譜圖,并計(jì)算各成分峰面積RSD值為0.13%、0.80%、1.10%。表明該供試液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。(4)線性關(guān)系考察:取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,經(jīng)適當(dāng)稀釋,得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液,按1.6.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,以濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸, 得回歸方程與線性范圍見(jiàn)表 1。(5)加樣回收試驗(yàn):取已知對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛含量的同一樣品9份,每份0.1 g,精密稱定,分別加入一定量的對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛對(duì)照品溶液,使加入量為樣品中對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛含量的 80%(3份)、100%(3份)和120%(3份)。按1.6.2節(jié)方法平行制備供試品溶液9份,按1.6.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄各成分峰面積,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛的平均加樣回收率為 97.36%(RSD為1.5%,n=9),表明該測(cè)定方法的回收率良好,準(zhǔn)確度滿足要求。

表1 對(duì)照品峰面積與濃度線性方程

1.7 種子發(fā)芽率測(cè)定

隨機(jī)選取各層積時(shí)期桃兒七種子150粒,用1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min,蒸餾水沖洗3～5次,播于沙床上(鋪沙3～5 mm),每皿播種50粒,3次重復(fù),在25 ℃全光照條件下培養(yǎng),每天加水1 mL,并記錄萌發(fā)種子數(shù)(以胚根突破種皮為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)),最后據(jù)觀察結(jié)果計(jì)算發(fā)芽率(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2019作圖,SPSS 17.0進(jìn)行方差分析,利用SPSSAU平臺(tái)進(jìn)行逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同層積階段桃兒七種子萌發(fā)率

圖 1顯示,桃兒七種子發(fā)芽率隨層積時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì),休眠逐漸解除,種子發(fā)芽率由初始的34.81%逐漸升高至87.22%,最終趨于穩(wěn)定,且層積階段間多差異顯著(P<0.05)。

不同小寫(xiě)字母表示層積階段間在0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 不同層積階段桃兒七種子細(xì)胞壁代謝特征

2.2.1 纖維素含量及纖維素酶活性

由圖 2,A可知,纖維素含量在桃兒七種子胚乳和種皮中較多,而在種胚中遠(yuǎn)低于胚乳和種皮。在整個(gè)層積過(guò)程中,其種胚和種皮中纖維素含量均整體表現(xiàn)出先降后升的相似變化趨勢(shì),種胚中纖維素含量在層積45 d時(shí)降至最低(7.85 mg/g),種皮中纖維素含量在層積60 d時(shí)降至最低(16.69 mg/g),并與大多數(shù)層積時(shí)間差異顯著;胚乳中纖維素含量的變化較為平穩(wěn),但在層積45 d出現(xiàn)最低值,也與大多數(shù)層積時(shí)間差異顯著。同時(shí),桃兒七種皮、胚乳及種胚中纖維素酶活性均較低,基本在0.01～0.30 U/g范圍內(nèi)浮動(dòng),仍以種皮在三者中最低;各部分纖維素酶活性隨著層積時(shí)間的變化趨勢(shì)與纖維素含量的變化趨勢(shì)相互對(duì)應(yīng),均先升后降,且均在層積45 d或60 d時(shí)出現(xiàn)峰值(圖2,B)。

圖2 不同層積階段桃兒七種子纖維素含量及纖維素酶活性變化

2.2.2 半纖維素含量及相關(guān)代謝酶活性

圖3,A顯示,半纖維素含量在桃兒七種子種胚和種皮中較高,而在胚乳中明顯較低。在整個(gè)層積過(guò)程中,種胚和種皮中半纖維素含量的變化總體上較為一致,均呈先降后升的趨勢(shì),種皮中半纖維素含量在層積60 d時(shí)下降至最低值,并與其余層積時(shí)間差異顯著,而種胚中半纖維素含量分別在層積45 d和90 d時(shí)出現(xiàn)兩次低值,也與其余層積時(shí)間差異顯著;胚乳中半纖維素含量除在層積30 d時(shí)顯著升高外,其余各階段間均無(wú)顯著變化。同時(shí),在種子層積過(guò)程中,桃兒七種皮、胚乳及種胚中甘露聚糖酶活性均處于較低水平,基本在0.14～1.33 U/g范圍內(nèi)浮動(dòng),并以種皮中最低;種胚和胚乳中甘露聚糖酶活性變化比較平穩(wěn),而種皮中甘露聚糖酶活性總體呈上升趨勢(shì),并在層積45 d時(shí)達(dá)到峰值(圖3,B)。另外,在種子層積過(guò)程中,木糖苷酶活性在桃兒七種胚和胚乳中較高,在種皮中明顯較低。種胚中木糖苷酶活性在層積0 d時(shí)最高,并與其余層積階段均有顯著差異;胚乳中木糖苷酶的活性變化幅度較小,在層積45 d時(shí)達(dá)到峰值,僅與層積0 d和15 d時(shí)差異顯著;種皮中木糖苷酶活性在0.16～0.32 U/g間浮動(dòng),在層積45 d時(shí)活性最高,但僅與層積30 d時(shí)差異顯著(圖3,C)。

圖3 不同層積階段桃兒七種子半纖維素含量及甘露聚糖酶和木糖苷酶活性變化

2.2.3 果膠含量及相關(guān)代謝酶活性

由圖4,A可知,桃兒七種胚中果膠含量明顯較種皮和胚乳高;在整個(gè)種子層積過(guò)程中,種胚中果膠含量分別在層積45 d、75 d和90 d時(shí)顯著低于其余層級(jí)時(shí)段,種皮和胚乳中果膠含量變化較為一致,總體隨著層積時(shí)間呈先升后降的變化趨勢(shì),在層積15 d時(shí)均顯著升高,而在層積60 d和90 d時(shí)均顯著下降。同時(shí),層積過(guò)程中桃兒七種皮、胚乳及種胚中多聚半乳糖醛縮酶活性的變化幅度均較小;種胚中酶活性在層積45 d時(shí)顯著降低,在其余各階段間均無(wú)顯著變化,種皮和胚乳中酶活性的變化趨勢(shì)相似,均在層積后期呈上升趨勢(shì)(圖 4,B)。此外,層積過(guò)程中桃兒七種皮、胚乳及種胚中果膠甲酯酶活性的變化相似,均呈先升后降的趨勢(shì),且都在層積45 d時(shí)出現(xiàn)峰值,并與其余時(shí)間段存在顯著差異(圖4,C)。

圖4 不同層積階段桃兒七種子果膠含量、多聚半乳糖醛縮酶及果膠甲酯酶活性變化

2.2.4 木質(zhì)素含量及相關(guān)代謝酶活性

由圖5,A 和表2可知,桃兒七種皮和胚乳中木質(zhì)素單體的組成比例具有明顯區(qū)別,種皮中以G-木質(zhì)素含量最高,而在胚乳中以H-木質(zhì)素含量最高;在整個(gè)層積過(guò)程中,種皮和胚乳內(nèi)3種木質(zhì)素單體含量均隨著層積時(shí)間呈下降趨勢(shì);從層積0～90 d,種皮中G-木質(zhì)素含量變化幅度最大,由0.83 mg/g降至0.07 mg/g,胚乳中H-木質(zhì)素含量變化最大,由0.33 mg/g降至0.09 mg/g。同時(shí),在整個(gè)種子層積過(guò)程中,桃兒七苯丙氨酸解氨酶活性在種皮中較高,而在胚乳中較低;其活性隨著層積時(shí)間變化趨勢(shì)在種皮和胚乳中相似,但種皮中酶活性在層積15 d和75 d時(shí)顯著降至最低,而胚乳中酶活性在層積90 d時(shí)顯著降至最低(12.10 mg/g)(圖 5,B)。另外,在整個(gè)種子層積過(guò)程中,桃兒七種皮和胚乳中肉桂醇脫氫酶的活性較低且變化趨勢(shì)平穩(wěn),均在0.16～0.77 U/g范圍內(nèi)浮動(dòng),且種皮明顯低于同期胚乳(圖5,C)。

在圖A中S、R、Z分別表示混合對(duì)照品、胚乳、種皮,1、2、3分別表示對(duì)羥基苯甲醛、香草醛和丁香醛。

2.3 不同層積階段桃兒七種子的活性氧代謝特征

桃兒七超氧化物歧化酶在種胚、胚乳及種皮中的活性均較高,且種胚和胚乳中其活性變化趨勢(shì)相似,在層積75 d和90 d時(shí)均顯著升至最高,并與其余時(shí)間段差異顯著;種皮中超氧化物歧化酶活性的變化幅度較小,在層積30 d和75 d時(shí)最低,其余各階段間均無(wú)顯著差異(圖6,A)。桃兒七種胚內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性變化幅度較大,呈現(xiàn)升-降-升-降-升的波動(dòng)變化趨勢(shì),在層積60 d和90 d時(shí)顯著較高,并與其余時(shí)段差異顯著;胚乳中過(guò)氧化氫酶活性在整個(gè)層積過(guò)程中變化較為平穩(wěn),但在層積60 d和90 d時(shí)出現(xiàn)峰值;種皮中過(guò)氧化氫酶活性總體呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì),在層積90 d時(shí)最高,并較其余各階段均存在顯著差異(圖6,B)。在整個(gè)層積過(guò)程中,種胚內(nèi)過(guò)氧化物酶活性變化也較大,與過(guò)氧化氫酶較為相似,呈現(xiàn)升-降-升-降的波動(dòng)變化趨勢(shì),在層積15 d和60 d時(shí)顯著升高,但在層積75 d和90 d時(shí)顯著下降,并與其余時(shí)間段差異顯著,在層積90 d時(shí)已降至32.96 U/g;胚乳中過(guò)氧化物酶活性呈小幅上升趨勢(shì),層積60 d時(shí)出現(xiàn)峰值;種皮中過(guò)氧化物酶活性在層積90 d時(shí)顯著升至最高,并與其余各階段差異顯著,其余時(shí)間段間均無(wú)顯著差異(圖6,C)。

2.4 不同層積階段桃兒七種皮表面及縱截面的超微結(jié)構(gòu)變化

桃兒七種皮主要由角質(zhì)層、柵狀石細(xì)胞層及海綿組織層3層構(gòu)成(圖7)。最外層為角質(zhì)層,結(jié)構(gòu)致密;角質(zhì)層內(nèi)層為一列排列緊密,縱向分布,細(xì)胞壁不均勻加厚的柵狀石細(xì)胞層;最內(nèi)層為橫向排列,由10層以上細(xì)胞構(gòu)成的海綿組織層。整個(gè)層積過(guò)程中,角質(zhì)層和柵狀石細(xì)胞層變化不大,種皮表面及種子內(nèi)部海綿組織變化明顯(圖7、8)。桃兒七種子在低溫層積30 d時(shí),種皮表面開(kāi)始出現(xiàn)破損(圖8,C、J),種皮細(xì)胞中的黏質(zhì)開(kāi)始分泌,此時(shí)種皮內(nèi)部海綿組織開(kāi)始膨脹疏松(圖7,E、F)。在低溫層積60 d后,種皮開(kāi)始凸起,表面破損加劇并出現(xiàn)明顯裂縫(圖8,E、L), 此時(shí)種皮內(nèi)海綿組織層膨脹加劇,繼續(xù)向外施壓破壞種皮(圖7,I、J)。在低溫層積 90 d時(shí),海綿組織間隙進(jìn)一步增大,膨脹加劇(圖7,L),種皮表面進(jìn)一步皺縮,裂紋加深且增多,種皮表面黏質(zhì)大量分泌(圖8,G、N)。

A、B.層積0 d;C、D.層積15 d;E、F.層積30 d;G、H.層積45 d;I、J.層積60 d;K.層積75 d;L.層積90 d;Ma.角質(zhì)層;Pa.柵狀石細(xì)胞層;Qa.海綿組織層。

A、H.層積0 d;B、I.層積15 d;C、J.層積30 d;D、K.層積45 d;E、L.層積60 d;F、M.層積75 d;G、N.層積90 d。

2.5 桃兒七種子萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞壁代謝主要影響因素分析

將不同層積階段種子不同部位的細(xì)胞壁組分含量及相關(guān)代謝酶活性作為自變量(x),種子萌發(fā)率作為因變量(y),通過(guò)Stepwise法進(jìn)行逐步回歸分析,以探究影響桃兒七種子萌發(fā)率的主要影響因素。結(jié)果(表3)顯示,經(jīng)過(guò)模型自動(dòng)識(shí)別,最終余下胚乳S-木質(zhì)素含量(x1)和種皮S-木質(zhì)素含量(x2)共2項(xiàng)在模型中,回歸方程為y=1.161-0.307x1-0.121x2,R2值為0.924,意味著胚乳S-木質(zhì)素含量和種皮S-木質(zhì)素含量可以解釋92.4%的種子萌發(fā)率變化,模型擬合良好。而且模型通過(guò)F檢驗(yàn)(F=24.243,P<0.05),說(shuō)明模型有效。另外,針對(duì)模型的多重共線性進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型中VIF值(均為1.012)均小于5,意味著不存在著共線性問(wèn)題,并且D-W值(1.992)在2附近,說(shuō)明模型不存在自相關(guān)性,樣本數(shù)據(jù)之間并沒(méi)有關(guān)聯(lián)關(guān)系,模型較好。胚乳S-木質(zhì)素含量回歸系數(shù)值(-0.307)和種皮S-木質(zhì)素的回歸系數(shù)值(-0.121)的t測(cè)驗(yàn)值分別為-6.266(P<0.01)和-3.704(P<0.05),意味著胚乳S-木質(zhì)素和種皮S-木質(zhì)素會(huì)對(duì)桃兒七種子萌發(fā)率產(chǎn)生顯著的負(fù)向影響。

表3 逐步回歸分析結(jié)果

3 討 論

植物種子在成熟過(guò)程中,其種皮中的薄壁細(xì)胞會(huì)逐漸分化形成角質(zhì)層、蠟質(zhì)層、柵欄層等具有支撐保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)[16],雖然這些結(jié)構(gòu)使得種子在應(yīng)對(duì)惡劣的氣候條件時(shí)占據(jù)一定的有利條件,但是也阻礙了種子的透氣透水性;另外,這些結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁通常呈現(xiàn)一定程度的加厚,導(dǎo)致種子的萌發(fā)受到更大的機(jī)械束縛。研究表明,低溫層積處理能破壞大花四照花種皮表層結(jié)構(gòu),同時(shí)還能破壞種皮內(nèi)部柵欄層,從而促進(jìn)休眠解除[17]。本研究表明,桃兒七種皮主要由3層構(gòu)成,分別為角質(zhì)層、柵狀石細(xì)胞層及海綿組織層,在休眠解除的過(guò)程中,種皮內(nèi)部的海綿組織逐步疏松膨脹,并向外施壓破壞種皮,種皮表面裂紋逐漸加深增多,種皮內(nèi)黏質(zhì)大量向外分泌,種皮結(jié)構(gòu)的破壞減少了種子萌發(fā)所受到的機(jī)械約束;另外,海綿組織層的疏松可能導(dǎo)致種子吸水能力的增強(qiáng),最終導(dǎo)致種子休眠的解除。

纖維素是由β-D-吡喃葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而成的無(wú)分支長(zhǎng)鏈,是植物中最廣泛的骨架多糖,約占植物細(xì)胞壁的30%～40%[18]。通常高纖維素含量意味著高機(jī)械強(qiáng)度,這對(duì)種子萌發(fā)具有不利影響,如休眠的柳葉刺廖(PolygonumpennsylvanicumL.)種子胚乳中纖維素含量更高[19]。半纖維素成分多樣,主要包括木聚糖 (xylan)、木葡聚糖(xyloglucan)、甘露聚糖 (mannan) 和它們的衍生物,其中木葡聚糖能通過(guò)氨鍵與纖維素微纖維相互作用,促進(jìn)纖維素網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)完整性,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械支撐作用[20],但過(guò)多的半纖維素積累會(huì)阻礙種子的透氣透水性,如半纖維素(尤其是木聚糖)在種皮部位的沉積造成紅木(BixaorellanaL.)種子的高度不透水性[19]。果膠是植物細(xì)胞壁的第三類多糖物質(zhì),廣泛存在于植物細(xì)胞壁的初生壁和中膠層中,在單、雙子葉植物的細(xì)胞壁中果膠含量最高可達(dá)35%,果膠在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著多重作用,如促進(jìn)細(xì)胞黏附、提供結(jié)構(gòu)支撐、為植物生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)提供寡糖、維持細(xì)胞壁流動(dòng)性等[21]。細(xì)胞壁的松弛是大多數(shù)植物種子轉(zhuǎn)向萌發(fā)的必然過(guò)程,而通過(guò)細(xì)胞壁降解酶發(fā)揮作用,促使細(xì)胞壁組分發(fā)生變化,破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),進(jìn)而減少種子萌發(fā)的機(jī)械約束是其內(nèi)在的機(jī)制之一,通常細(xì)胞壁降解酶包括纖維素酶、甘露聚糖酶、多聚半乳糖醛縮酶、果膠甲酯酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶等。纖維素酶能打斷β-1,4-糖苷鍵從而降解羧甲基纖維素,促進(jìn)細(xì)胞壁松弛,如用纖維素酶處理月季種子能顯著提高其發(fā)芽率,打破休眠[22];甘露聚糖酶可以催化水解半纖維素中主要含有的半乳甘露聚糖,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橹参镄枰幕次镔|(zhì),如曼陀羅種子在胚乳破裂前,甘露聚糖酶活性顯著增加,說(shuō)明其與胚乳弱化具有密切的關(guān)系[23];木糖苷酶則可以徹底降解半纖維素中另一主要成分木聚糖[24];多聚半乳糖醛縮酶在果膠甲酯酶的參與下能催化水解果膠分子中α-(1,4)-多聚半乳糖醛酸,從而促進(jìn)細(xì)胞壁松弛[25]。

本研究結(jié)果表明,桃兒七種子不同部位的細(xì)胞壁組分具有明顯差異,種胚中以半纖維素和果膠為主,胚乳中以纖維素為主,而種皮中則以半纖維素為主,這意味著桃兒七種子的不同部位具有不同的機(jī)械強(qiáng)度,同時(shí)胚乳中的高纖維素含量說(shuō)明其細(xì)胞壁可能存在一定程度的加厚。在整個(gè)低溫層積過(guò)程中,桃兒七種胚、種皮和胚乳中的纖維素含量均在層積中期(45 d和60 d)降至最低,同樣種胚和種皮內(nèi)的半纖維素含量也在此時(shí)顯著下降,3個(gè)部位的纖維素酶活性在層積中期(45 d和60 d)對(duì)應(yīng)升高,種皮中甘露聚糖酶活性和木糖苷酶活性也在層積中期時(shí)達(dá)到最大,說(shuō)明層積中期種子內(nèi)的纖維素和半纖維素逐步降解,導(dǎo)致細(xì)胞壁進(jìn)一步松弛,從而加速休眠的解除,但種胚內(nèi)甘露聚糖酶活性和木糖苷酶活性在整個(gè)層積過(guò)程中無(wú)顯著變化,又說(shuō)明種胚內(nèi)的半纖維素降解可能主要不是由酶解造成。桃兒七種子3個(gè)部位的果膠含量均在層積后期(75 d和90 d)時(shí)顯著下降,同時(shí)種皮和胚乳中多聚半乳糖醛縮酶活性也相應(yīng)在層積后期升高,但3個(gè)部位的果膠甲酯酶活性在層積45 d時(shí)顯著升高,這可能是果膠降解首先需要果膠甲酯酶去甲基后才能被多聚半乳糖醛縮酶降解的緣故。另外,3個(gè)部位的果膠含量在層積后期顯著下降也說(shuō)明細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞,種子內(nèi)的機(jī)械約束逐漸減弱。

木質(zhì)素是植物次生壁的重要組成部分之一,可與細(xì)胞壁中的半纖維素、纖維素等成分相互交連,從而形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì),增強(qiáng)植物細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度,同時(shí)木質(zhì)素也具有疏水性,使水分不易通過(guò)植物細(xì)胞,為植物形成一層有效的物理屏障[26]。但對(duì)于種子萌發(fā)而言,過(guò)多的木質(zhì)素積累會(huì)造成吸水障礙和機(jī)械約束,不利于種子萌發(fā),如使用外源木質(zhì)素酶處理藍(lán)紫倒距蘭[Anacamptismorio(L.) R.M.Bateman]種子能顯著提高其種子吸水性,并促進(jìn)萌發(fā)[27]。本研究中,桃兒七種皮和胚乳內(nèi)木質(zhì)素單體的組成比例具有明顯區(qū)別,且3種木質(zhì)素單體含量均隨層積時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低,種皮和胚乳中的苯丙氨酸解氨酶作為木質(zhì)素單體合成途徑的關(guān)鍵控制酶,其活性在層積15 d和75 d時(shí)均顯著降低,但種皮和胚乳中肉桂醇脫氫酶活性一直保持在較低水平且變化平穩(wěn)。此外,本研究逐步回歸分析的結(jié)果也表明胚乳和種皮中的S-木質(zhì)素對(duì)種子萌發(fā)存在顯著的負(fù)向影響關(guān)系,說(shuō)明木質(zhì)素(尤其是S-木質(zhì)素)含量的降低可能進(jìn)一步破壞了種皮和胚乳細(xì)胞壁的剛性結(jié)構(gòu),從而加速種子休眠的解除。

種子中活性氧代謝對(duì)細(xì)胞壁松弛、胚乳弱化、細(xì)胞的程序性死亡及種子休眠等諸多方面起到重要的作用[28],如三葉鬼針草(BidenspilosaL.)種子經(jīng)可產(chǎn)生羥基自由基的試劑處理后,可以有效解除其種子休眠[29]。然而過(guò)量的活性氧會(huì)造成細(xì)胞的損傷和種子老化,維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的穩(wěn)態(tài)對(duì)于種子萌發(fā)極為重要,通常植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)SOD、CAT和 POD等將H2O2進(jìn)一步分解為H2O和O2,而且研究也證實(shí)SOD可以促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)[30],POD活性的降低有利于葡萄芽休眠的釋放[31]。本研究發(fā)現(xiàn),桃兒七種胚內(nèi)POD活性在層積過(guò)程中呈現(xiàn)升-降-升-降的波動(dòng)變化趨勢(shì),胚乳內(nèi)POD活性在層積60 d時(shí)出現(xiàn)峰值,而后活性明顯下降;同時(shí),種胚內(nèi)CAT活性也呈現(xiàn)升-降-升-降-升的波動(dòng)變化趨勢(shì),并在層積60 d和90 d時(shí)出現(xiàn)兩次峰值,而其活性在胚乳中則變化平穩(wěn),說(shuō)明種胚內(nèi)活性氧代謝較胚乳旺盛,種胚和胚乳中可能存在大量活性氧攻擊細(xì)胞壁多糖,加速細(xì)胞壁松弛,促進(jìn)種胚伸長(zhǎng)和胚乳弱化,從而導(dǎo)致休眠解除。另外,桃兒七種胚和胚乳內(nèi)SOD活性在層積后期顯著上升以及CAT活性在層積60 d和90 d時(shí)出現(xiàn)上升則說(shuō)明活性氧對(duì)于細(xì)胞壁多糖的攻擊可能是間歇性的,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)多活性氧時(shí),為避免其帶來(lái)的細(xì)胞損傷,抗氧化酶活性會(huì)急劇升高以維持種子內(nèi)的活性氧代謝穩(wěn)態(tài)。

本研究中桃兒七種胚和胚乳內(nèi)POD活性在層積75 d和90 d時(shí)明顯下降,說(shuō)明層積后期可能存在大量活性氧攻擊種胚和胚乳中的細(xì)胞壁多糖,加速細(xì)胞壁的松弛,促進(jìn)種胚伸長(zhǎng)和胚乳弱化,從而導(dǎo)致休眠解除,而種胚和胚乳內(nèi)SOD活性在層積后期(75 d、90 d)顯著上升以及CAT活性在層積60 d和90 d時(shí)出現(xiàn)的上升則可能是為了減輕過(guò)量的活性氧帶來(lái)的毒害作用。

4 結(jié) 論

桃兒七種皮主要由角質(zhì)層、柵狀石細(xì)胞層及海綿組織層構(gòu)成,在低溫層積解除休眠的過(guò)程中,其細(xì)胞壁剛性結(jié)構(gòu)組分纖維素、半纖維素及木質(zhì)素在維素酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、多聚半乳糖醛縮酶和果膠甲酯酶等共同作用下逐步酶解,同時(shí)種胚和胚乳中的大量活性氧進(jìn)一步攻擊細(xì)胞壁多糖,從而導(dǎo)致種皮內(nèi)部的海綿組織逐步疏松膨脹,并向外施壓破壞種皮,種皮表面裂紋逐漸加深增多直至破裂,種皮內(nèi)黏質(zhì)大量向外分泌,促使種子萌發(fā)的機(jī)械束縛力降低,透性提高、胚根生長(zhǎng)能力增強(qiáng),最終導(dǎo)致其種子休眠的解除。其間,桃兒七種子胚乳和種皮中的S-木質(zhì)素對(duì)種子萌發(fā)存在顯著的負(fù)向影響,木質(zhì)素(尤其是S-木質(zhì)素)含量的降低可能進(jìn)一步破壞了種皮和胚乳細(xì)胞壁的剛性結(jié)構(gòu),從而加速種子休眠的解除。