產婦康煎劑對孕期大鼠胎盤的影響 *

李瑞麗 柏 貞 王雪嫄 王晶爍 林佳微 傅金英

（河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

胎盤植入是產科的嚴重并發(fā)癥之一，指胎盤絨毛侵入子宮肌層，導致產后胎盤無法從宮腔剝離；根據(jù)胎盤絨毛侵入子宮肌層深度，可分為胎盤粘連、胎盤植入、穿透性胎盤植入［1］。胎盤植入是導致嚴重產后出血、子宮切除、產褥期感染的主要原因，嚴重威脅孕產婦的生命安全和生活質量［2］。近年來，隨著剖宮產率的增長，高齡產婦人數(shù)的增多及人工流產、引產病例的增多，胎盤植入有逐年增多的趨勢，發(fā)病率增加了10倍［3，4］。研究［5］表明，胎盤植入的發(fā)生率為1%～23%，而穿透性胎盤植入的發(fā)生率為0.3%。中國是世界剖宮產率較高的國家之一，高達40%～50%，由此可以推斷，中國胎盤植入的發(fā)病人數(shù)應遠遠高于世界平均水平。隨著生活水平的提高、國家“三胎”政策的放開以及人們觀念的轉變，保留生育功能、成功保守治療胎盤植入，已成為臨床亟待解決的問題之一。

我們在前期研究［6-10］中發(fā)現(xiàn)，自擬“產婦康煎劑”對治療胎盤植入效果顯著。本研究擬通過建立妊娠大鼠模型，觀察孕鼠用藥后胚胎生長數(shù)量、外周血人絨毛膜促性腺激素（HCG）水平、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平、胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 和Bax 的表達水平等指標，探討產婦康煎劑對妊娠大鼠胎盤作用的影響及其作用機制，初步闡明產婦康煎劑治療胎盤植入的機制，為臨床提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級健康成年雌性SD大鼠36只，雄性SD 大鼠18 只，體質量（200±30）g，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，合格證號：SCXK（豫）2019-0002，在通風，濕度、溫度適宜的河南省中醫(yī)院中心實驗室動物室內喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品制備產婦康煎劑組方（成人每天用量）：黃芪30 g，益母草30 g，莪術20 g，天花粉50 g，姜黃20 g，紫草30 g，當歸12 g，蜈蚣2條（10 g），赤芍12 g，炮姜12 g，甘草6 g，茯苓15 g。所用生藥飲片由河南省中醫(yī)院制劑室提供，按照院內制劑標準濃煎、過濾，所煎藥液濃縮至每毫升含生藥2.47 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑RIPA 裂解液（Servicebio 公司，貨號：G2002），PMSF（100 mmol）（Servicebio 公司，貨號：G2008），磷酸化蛋白酶抑制劑（Servicebio 公司，貨號：G2007），BCA蛋白定量檢測試劑盒（Servicebio公司，貨號：G2026），蛋白Marker（Servicebio 公司，貨號：26617），PVDF 膜（0.45 μm）（Servicebio 公司，貨號：G6015-0.45），吐溫20（Tween 20）（Servicebio 公司，貨號：WGT8220），普通ECL 化學發(fā)光試劑盒（Servicebio公司，貨號：G2014），β-actin 內參鼠抗體（Servicebio公司，貨號：GB12001），HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體（Servicebio 公司，貨號：GB23301），HRP 標記山羊抗大鼠（Servicebio 公司，貨號：GB23302），普通轉膜緩沖液（Servicebio 公司，貨號：G2017），Tris-甘氨酸 SDSPAGE 普通電泳緩沖液（Servicebio 公司， 貨號：G2018），TBS 緩沖液（Servicebio 公司，貨號：G0001-2L），TRizol RNA 提取液（Servicebio 公司，貨號：G3013-100ML），逆轉錄酶（Servicebio 公司，貨號：G3337-50Rxns），熒光染料SYBR Green（Servicebio 公司，貨號：G3326-15ML），GADPH 引物（Servicebio 公司，貨號：GYW00012）。

1.1.4 主要儀器酶標儀（Rayto 公司，型號：RT-6100），研磨儀（Servicebio 公司，型號：KZ-II），臺式高速冷凍離心機（DRAGONLAB 公司，型號：D3024R），掌上離心機（Servicebio 公司，型號：D1008E），渦旋混合器（Servicebio 公司，型號：MX-F），磁力攪拌器（Servicebio 公司，型號：MS-PB），脫色搖床（Servicebio公司，型號：TSY-B），垂直電泳儀（Servicebio 公司，型號：BV-2），轉印電泳儀（Servicebio 公司，型號：BT-2），超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物公司，型號：JY92-11N），灰度分析軟件（Alpha Innotech 公司，型號：alphaEaseFC），圖像分析軟件（Adobe 公司，型號：Adobe PhotoShop），熒光定量PCR 儀（Bio-rad 公司，型號：CFX Connect）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立選用8 周鼠齡、SPF 級雌性SD大鼠36 只，未產；雄性SD 大鼠18 只；清潔級飼養(yǎng)，喂以標準大鼠飼料。適應性喂養(yǎng)1 周后，將雌雄大鼠按2∶1 合籠（每籠3 只）：頭天傍晚5 點將雌鼠放入雄鼠籠中，次日晨8 點前取出；雌鼠進行陰道分泌物涂片檢查，將分泌物涂于干凈載玻片上，放置顯微鏡下，見雄鼠精子滿視野，視為妊娠第1 日，取出單獨飼養(yǎng)；未孕者仍與雄鼠合籠，直至受孕。

1.2.2 動物模型的分組與干預方法將36只受孕雌鼠隨機分為中藥組、生理鹽水組、空白對照組，每組12 只。各組大鼠給藥方法如下：中藥組：妊娠第6 天開始至妊娠第19 天，連續(xù)14 d，每日上午8∶00 給予產婦康煎劑濃縮液灌胃10 mL/kg，所含生藥量為2.6 g/mL，相當于成人等效劑量的6 倍。生理鹽水組：妊娠第6 天開始至妊娠第19 天，連續(xù)14 d，每日上午8∶00 給予生理鹽水灌胃10 mL/kg?？瞻讓φ战M不處理。中藥組和生理鹽水組在妊娠第0、6、10、14、18天稱體質量，并按體質量調整給藥量。

1.2.3 實驗指標和檢測方法

1.2.3.1 胎盤生長數(shù)量妊娠第19 天麻醉處死孕鼠后，統(tǒng)計3組孕鼠胎盤數(shù)量。

1.2.3.2 ELISA 法測定外周血HCG 及ALT 與AST 檢測（1）取全血標本用離心機離心20 min獲取血清，按HCG 試劑盒要求立即檢測。以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線；用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

（2）取全血標本4 ℃過夜后，用離心機在8 ℃下，離心15 min 取上清，按ALT 與AST 試劑盒要求立即檢測，余步驟同上。

1.2.3.3 Realtime PCR 法檢測胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 和Bax 的mRNA 表達取各組孕鼠胚胎組織，剪碎、研磨、離心后，TRizol 提取總RNA，溶于無RNA 酶的滅菌超純水中，用Nanodrop 2000 型超微量分光光度計（Thermo 公司）測定總RNA 的濃度和純度，同時采用瓊脂糖電泳觀察其完整性。將RNA 稀釋成1 mg/L，-80 ℃保存。逆轉錄酶作用下完成逆轉錄（Promega），將熒光染料SYBR Green 和目的基因Bcl-2（Servicebio 公司）和Bax（Servicebio 公司）引物與內參基因GADPH 的引物（引物序列見表1）混勻后，加入檢測板、密封、上機（熒光定量PCR 儀）檢測。采用反應條件：94 ℃預變性；94 ℃ 50 s、55 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s、72 ℃ 10 min，共30 個循環(huán)。每個循環(huán)在60℃延伸時收集熒光值，測定達到熒光閾值時的最小循環(huán)次數(shù)（Ct 值），根據(jù)PCR反應信號強度Ct 值計算每個樣本目的基因mRNA 的相對表達量。完成后進行溶解曲線測定，溶解曲線程序設置為：95 ℃ 10 s，65～95 ℃，每0.5 ℃進行1 次溶解曲線分析。

表1 檢測基因引物序列

以GADPH 為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，其中ΔΔCt=（Ct 目的基因-Ct GADPH）處理組-（Ct 目的基因-Ct GADPH）對照組。記錄數(shù)據(jù)并分析實驗結果。

1.2.3.4 Western blot 法檢測胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 和Bax蛋白表達取各組孕鼠胎盤與子宮剝離面滋養(yǎng)細胞相對豐富部位胎盤組織，經蛋白提取、濃度測定、蛋白變性、電泳分離及轉膜后進行免疫印跡，經封閉、加抗體、洗膜，用增強化學發(fā)光劑進行發(fā)光后再行曝光顯影，將顯影條帶放Adobe PhotoShop 圖像分析處理系統(tǒng)，利用Adobe PhotoShop 軟件，電腦直接掃描測定顯影條帶積分光密度值，條帶的積分光密度值即表示蛋白的表達量，計算每份樣本中Bax 與Bcl-2 蛋白的相對表達水平（目的蛋白/β-actin）。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布的，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；不符合正態(tài)分布的，轉化為正態(tài)分布，再進行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用x2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組孕鼠胎盤生長數(shù)量比較3組孕鼠胎盤生長數(shù)量比較，F(xiàn)值為3.89，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組孕鼠胎盤生長數(shù)量的比較（±s）

表2 3組孕鼠胎盤生長數(shù)量的比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.05；與中藥組比較，2）P＜0.05。

胎盤數(shù)量/個10.42±0.511）12.08±2.27 12.00±1.652）組別中藥組生理鹽水組空白對照組鼠數(shù)12 12 12

2.2 3 組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 和Bax 的mRNA 相對表達量比較3 組孕鼠Bcl-2 mRNA 相對表達量比較，F(xiàn)值為7.20，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3 組之間Bax mRNA 相對表達量比較，F(xiàn)值為4.39，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA相對表達量比較（±s）

表3 3組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA相對表達量比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.05；與中藥組比較，2）P＜0.05。

組別中藥組生理鹽水組空白對照組Bax mRNA 1.10±0.281）0.94±0.30 0.89±0.162）鼠數(shù)12 12 12 Bcl-2 mRNA 1.34±0.231）1.68±0.06 1.76±0.432）

2.3 3組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2 和Bax 蛋白相對表達水平比較 3 組孕鼠Bcl-2 蛋白表達的影響，F(xiàn)值為39.21，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3 組孕鼠Bax 蛋白表達的影響，F(xiàn)值為80.83，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 3組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2和Bax蛋白相對表達水平比較（±s）

表4 3組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞Bcl-2和Bax蛋白相對表達水平比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.05；與中藥組比較，2）P＜0.05。

組別中藥組生理鹽水組空白對照組Bax 1.17±0.021）0.92±0.05 0.97±0.042）鼠數(shù)12 12 12 Bcl-2 0.43±0.031）0.63±0.12 0.65±0.032）

2.4 3組孕鼠外周血HCG、ALT 和AST 水平比較3組孕鼠的外周血ALT 值水平比較，F(xiàn)值0.83，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組孕鼠的外周血AST 值水平比較，F(xiàn)值為1.43，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組孕鼠的外周血HCG值水平比較，F(xiàn)值為34.46，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 3組孕鼠外周血HCG、ALT和AST水平比較（±s）

表5 3組孕鼠外周血HCG、ALT和AST水平比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.05；與中藥組比較，2）P＜0.05。

AST/（U/L）148.83±8.81 156.92±17.54 150.92±7.60組別中藥組生理鹽水組空白對照組鼠數(shù)12 12 12 HCG/（mU/mL）63.67±3.851）71.00±9.16 71.75±7.202）ALT/（U/L）52.75±3.65 54.50±4.02 52.83±3.59

3 討論

在妊娠過程中，胎盤最早形成，是母胎交換的惟一器官，對妊娠期胚胎的發(fā)育和生長起到至關重要的作用［11］。滋養(yǎng)細胞作為胎盤的重要組成細胞，與胎盤的形成及其功能密不可分。外周血HCG 主要由胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌，血HCG 水平越高，反映滋養(yǎng)層細胞活力越強，胎盤與母體連接可能越緊密。滋養(yǎng)細胞的凋亡受多通路、多因素影響，受細胞內多個因子的調控［12］。Bcl-2 蛋白家族對細胞凋亡有重要調節(jié)作用，該家族主要由促凋亡的Bax、Bak、Bad 和抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w 組成，Bcl-2 和Bax 是相互對立的一對基因，參與細胞凋亡的調控。Bcl-2 是一種原癌基因，位于18 號染色體q21，有3 個外顯子；其產物是分子量26 kDa 的蛋白質，能夠阻止或延遲細胞凋亡，延長細胞壽命。Bax是一種凋亡調控基因，定位于19 號染色體q133-q134，含有6 個外顯子，基因全長45 bp，可以加速細胞凋亡。Bcl-2 高表達，凋亡指數(shù)低，可以抑制細胞凋亡；Bax 高表達，凋亡指數(shù)高，可以促進細胞凋亡；二者主要通過調節(jié)線粒體膜的通透性來調節(jié)細胞活性，進而在細胞的凋亡過程中起重要作用［13-16］。滋養(yǎng)細胞凋亡異常是多種胎盤相關性疾病發(fā)生的機制，其中，胎盤增生及植入的發(fā)生的機制之一是滋養(yǎng)細胞的凋亡被抑制［17］。

本次實驗結果顯示，中藥組孕鼠胎盤數(shù)量低于生理鹽水組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥組孕鼠外周血HCG 值水平低于生理鹽水組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明產婦康煎劑可有效降低孕鼠外周血HCG 值水平，其機制可能與產婦康煎劑可破壞孕鼠胎盤結構，從而影響血HCG 產生相關。3 組孕鼠外周血ALT 值和AST 值水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明產婦康煎劑對妊娠大鼠無明顯肝細胞損害。中藥組胎盤組織中Bcl-2 mRNA 表達量低于生理鹽水組和空白對照組，且Bax mRNA 表達量高于生理鹽水組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生理鹽水組和空白對照組Bcl-2 和Bax mRNA 表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同時，中藥組胎盤組織中Bcl-2 蛋白相對表達水平低于生理鹽水組和空白對照組，且Bax 蛋白相對表達水平高于生理鹽水組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生理鹽水組和空白對照組Bcl-2 和Bax 蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以上表明產婦康煎劑可以加速孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡與壞死。

綜上所述，產婦康煎劑可抑制孕期大鼠胎盤的生長和發(fā)育，降低血中HCG 水平，促進大鼠胎盤的凋亡，其機制可能與上調Bax表達和下調Bcl-2表達有關，從而促進胎盤組織的消散。這一發(fā)現(xiàn)為今后的研究奠定了良好的基礎，有深入研究的必要。