基于形性、化學(xué)、生物活性相關(guān)聯(lián)優(yōu)選黃芩炭炮制終點*

孫 靜，孫藝璇，尹貽慧，朱 博，董 玲

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

黃芩為常用中藥材，味苦、性寒，有清熱解毒、止血安胎等功效，在經(jīng)方及現(xiàn)代臨床中常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、肺炎、類風濕關(guān)節(jié)炎等疾病[1-2]。黃芩在制炭后仍具有一定的抗炎作用，且藥性變緩、清熱而不傷正，在臨床實踐中應(yīng)用廣泛并取得很好的療效。目前對于黃芩炭的質(zhì)量控制也越來越受到人們的重視，且收載于多部地方炮制規(guī)范[3-6]?！按嫘浴币恢弊鳛樘克庂|(zhì)量評價的基本原則，清代陳修園《女科要旨》也指出“今藥肆中只知燒炭則變?yōu)楹谏?，而不知存性二字大有深意，該各藥有各藥之性，若燒之太過則成死灰無用之物”?？梢娙绾螌ⅰ按嫘浴痹瓌t轉(zhuǎn)化為具體的質(zhì)量指標，是黃芩炭及其他炭藥質(zhì)量評價亟需解決的關(guān)鍵問題[7-9]。

與其他炭藥相似，目前黃芩炭的炮制終點判斷依賴于顏色特征的人工觀察，但不同炮制規(guī)范對于黃芩炭炮制終點的顏色特征描述不盡相同，如2019年版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》[3]規(guī)定用武火炒至表面“焦褐色，內(nèi)部呈黃褐色”；2018年版《天津市中藥飲片炮制規(guī)范》[4]規(guī)定炒至“外顯黑褐色，內(nèi)顯棕褐色”。研究表明，黃芩在炒炭過程中主要發(fā)生了糖苷鍵的斷裂[10]，即糖苷類成分在破壞的同時仍保留了苷元類有效成分，符合“炒炭存性”的原則。目前常以黃芩炭炒制前后外觀顏色及黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分的含量來判斷炮制程度。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，黃芩炭炮制終點不盡相同，同時其炮制工藝影響黃酮類成分的轉(zhuǎn)化程度[11-13]。由于藥物本身的藥效是其發(fā)揮臨床療效的重要保證，也是炮制終點判斷的最佳指標，因此為了提高黃芩炭炮制終點判斷與質(zhì)量評價的可靠性，本研究嘗試通過建立黃芩炭的形性、化學(xué)、生物三性指標綜合評價體系，尋找黃芩炭炮制終點判斷與質(zhì)量評價的客觀量化指標。

本研究選擇黃芩炭飲片粉末色度值（L*、a*、b*）作為形性指標，黃芩炭浸膏中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量作為化學(xué)指標，黃芩炭浸膏對炎癥細胞釋放NO、IL-6因子的抑制程度作為生物指標，通過多元統(tǒng)計方法分析三類指標之間的關(guān)聯(lián)性，明確炮制適中的黃芩炭所具有的三性指標特征，以期為黃芩炭及其他炭藥的質(zhì)量評價研究提供一種新的方法學(xué)參考。

1 材 料

1.1 主要儀器 MS-5型炒貨機（常州邁斯機械有限公司）；BJ-800A型多功能粉碎機（拜爾公司）；CM-5型色彩色差儀（日本柯尼卡美能達公司）；LC-20AT高效液相色譜儀，配備SPD-20A型紫外檢測器、SIL-20A型自動進樣器（日本島津公司）；KG-SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY公司）；CKX-53型倒置光學(xué)顯微鏡（日本OLympus公司）。

1.2 試藥與試劑 黃芩飲片（批號：20210401）購于安徽九合堂國藥有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王晶娟教授鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根的炮制品。黃芩苷對照品（批號：N15GB167969，質(zhì)量分數(shù)：98%）、漢黃芩苷對照品（批號：P09J8F28374，質(zhì)量分數(shù)：98%）、漢黃芩素對照品（批號：M02GB140399，質(zhì)量分數(shù)：98%）、黃芩素對照品（批號：C06M11Y112461，質(zhì)量分數(shù)：98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；NO試劑盒（批號：S0021S）購于碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6 ELISA試劑盒（批號：KE10007）購于美國Proteintech公司；胎牛血清（FBS）（批號：10099141）、青鏈霉素雙抗（PS）（批號：15140122）、DMEM培養(yǎng)基（批號：C11965500BT）均購于美國invitrogen公司；CCK-8（批號：CK04）購于北仁化學(xué)科技有限公司。

1.3 細胞 小鼠單核/巨噬細胞株Raw264.7購于協(xié)和細胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩炭樣品的制備

2.1.1 黃芩炭飲片及粉末制備[11-12]利用自動炒貨機制備不同炮制程度的黃芩炭飲片。溫度設(shè)置為150、180、210 ℃[6]，經(jīng)現(xiàn)有文獻及預(yù)實驗將炒制時間設(shè)置為10、20、30、40、50、60 min，投料300 g，另預(yù)留一份黃芩飲片作為對照。最終得到共19批不同炮制程度的黃芩炭飲片。其中均取一部分進行打粉，過六號藥典篩，保存?zhèn)溆?。以上制備過程均在同一環(huán)境下當天制備，以避免外界因素的影響。

2.1.2 黃芩炭浸膏制備[14-15]取不同炮制程度的19批黃芩炭飲片各10 g，加45倍量水浸泡30 min，煮沸后計時30 min，過濾，濾渣再加入7倍量水進行二次煎煮，煮沸后計時20 min，過濾，合并二次濾液，減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，凍干即得。

2.2 黃芩炭形性指標的測定 粉末樣品測定：運用CM-5型色彩色差儀，將紫外可見分光光度計起始波長設(shè)為380～780nm，選擇培養(yǎng)皿進行測量，儀器測量口徑為8mm，測量區(qū)域為3 mm，照明光源設(shè)為D65，視角選擇10度觀察測定。具體測量時按照設(shè)定條件進行黑板校正，校正完成后取出黑板，將標準白板放入色度測量儀中積分球的參比和樣品處進行校正，等待儀器提示校正完成無誤后，取下白板。將不同炮制程度的黃芩炭粉末壓制于石英測色皿中，厚度2～4 mm鋪滿測色皿，將裝滿樣品的測色皿放置于目標罩內(nèi)進行測定，變換位置，平行3次掃描測定，并記錄樣品粉末的L*、a*、b*值。最終得到不同炮制程度的黃芩炭粉末的色度值見表1。

表1 黃芩炭飲片顏色值測定結(jié)果 （n=3）

2.3 黃芩炭化學(xué)指標的測定

2.3.1 色譜條件[11]色譜柱為Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫，洗脫程序為0～25 min，47%B；26～35 min，47%B→60%B；36～45 min，60%B→70%B；46～60 min，47%B；檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃。

2.3.2 供試品溶液的制備[11]取黃芩炭飲片粉末及浸膏凍干粉0.30 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 mL容量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL置于2 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 測定結(jié)果 黃芩炭浸膏中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量見表2。

表2 黃芩炭浸膏中黃酮類成分含量

2.4 黃芩炭生物指標的測定

2.4.1 基于CCK與Griess法的黃芩炭浸膏作用濃度的確定 將黃芩素含量最高的150 ℃炒制50 min黃芩炭浸膏及黃芩飲片浸膏進行活力測定。所有藥物均現(xiàn)配現(xiàn)用，過膜除菌。

2.4.1.1 CCK實驗 取處于對數(shù)生長期的細胞，按3×104個/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h待細胞貼壁后棄去上清液，設(shè)置黃芩浸膏組、150 ℃炒制50 min黃芩炭浸膏組（質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL）及陰性對照組（含細胞，不加入藥物）、空白組（不含細胞，不加入藥物），每組5個復(fù)孔，置于細胞恒溫箱培養(yǎng)，待12 h后棄去上清液，加入10% CCK-8，避光孵育2 h，使用酶標儀測定450 nm處吸光度，記錄其吸光度（A）值，根據(jù)A值計算細胞活力值。細胞活力值=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

2.4.1.2 Raw264.7細胞NO濃度測定[16]取處于對數(shù)生長期的細胞，按3×104個/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后加入LPS（每孔終濃度為1 μg/mL）同時造模、給藥，均設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取其上清液，按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定540 nm下各組A值，計算NO的濃度。

2.4.2 黃芩炭浸膏對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞NO、IL-6釋放量的影響

2.4.2.1 Raw264.7細胞NO濃度測定 取處于對數(shù)生長期的細胞，按3×104個/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h待細胞貼壁后棄去上清液，加入LPS溶液（每孔終濃度為1 μg/mL）。設(shè)置黃芩浸膏組、黃芩炭浸膏組及對照組（含細胞，不加入藥物）、模型組，每組5個復(fù)孔，置于細胞恒溫箱培養(yǎng)，其余步驟同“2.4.1.2”進行測定，計算NO的濃度。

2.4.2.2 Raw264.7細胞IL-6濃度測定 取處于對數(shù)生長期的細胞，按3×104個/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h待細胞貼壁后棄去上清液，加入LPS溶液（每孔終濃度為1 μg/mL），設(shè)置黃芩浸膏組、黃芩炭浸膏組及對照組（含細胞，不加入藥物）、模型組，每組5個復(fù)孔，置于細胞恒溫箱培養(yǎng)，待12 h后取上清液，采用ELISA法按試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，在450 nm下測定A值，計算得到IL-6的濃度。

3 分析與討論

3.1 黃芩炭炮制過程的形性指標變化規(guī)律 由飲片外觀可知，不同炮制程度的黃芩炭飲片具有一定差異，在同一溫度下隨著炒制時間延長，其外觀及斷面顏色逐漸加深。150～210℃炒制10 min，飲片表面均未變?yōu)榻购稚蛘呓购谏?，初步認為“炮制不及”；210 ℃炒制50 min或60 min，飲片表面與斷面均為焦黑色，初步認為“炮制太過”。表明本研究所使用的黃芩炭飲片的炮制程度覆蓋了不及、適中、太過3種程度。

考慮到飲片粉末的顏色較為均一，能夠準確表征樣品內(nèi)外的整體顏色，因此采用粉末色度值作為形性指標將顏色進行客觀量化，其變化規(guī)律見圖1。由圖1可知，隨著炮制程度的增加，黃芩炭粉末L*、b*均呈下降趨勢，表明樣品表觀顏色變深，亮度由明至暗；a*呈先上升后下降趨勢，表明黃芩炭顏色先變紅后減退，存在拐點現(xiàn)象。

圖1 黃芩炭粉末色度值變化規(guī)律

3.2 黃芩炭炮制過程的化學(xué)指標變化規(guī)律 將黃芩炭浸膏中4種成分的含量及4種成分的轉(zhuǎn)移量（轉(zhuǎn)移量=絕對含量×出膏率）進行變化規(guī)律分析?？紤]到黃芩苷、黃芩素等水溶性較差，因此在浸膏的提取工藝中對料液比進行優(yōu)化，以提高有效成分的提取率，并將含量單位換算成摩爾質(zhì)量分數(shù)以便于更直觀地觀察和比較4種黃酮類成分的轉(zhuǎn)化規(guī)律。由圖2可知，當條件為150 ℃炒制50 min、180 ℃炒制30 min、210 ℃炒制20 min時，黃芩素、漢黃芩素在飲片及浸膏中含量均達到最高，其后開始下降。在課題組前期預(yù)試驗中，按照傳統(tǒng)溶劑比例即高料液比制備黃芩炭浸膏時可能存在飽和現(xiàn)象，黃芩素、漢黃芩素溶解度較低而不能充分轉(zhuǎn)移。本研究最終選擇降低料液比進行工藝的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當料液比降低時，黃芩炭浸膏中4種黃酮類成分的轉(zhuǎn)移量均有所升高，能夠更準確地反映不同飲片的成分差異。故選取低料液比浸膏進行生物活性研究，同時用其表征飲片。

圖2 黃芩炭飲片及浸膏中黃酮類成分變化規(guī)律

3.3 黃芩炭炮制過程的生物指標變化規(guī)律 由圖3可知，黃芩浸膏質(zhì)量濃度在400 μg/mL、150 ℃炒制50 min以及黃芩炭浸膏質(zhì)量濃度在300 μg/mL時對細胞活力有抑制作用，且在此給藥濃度范圍內(nèi)黃芩炭浸膏對Raw264.7細胞NO的釋放量具有濃度依賴性，故最終選擇黃芩浸膏質(zhì)量濃度為200 μg/mL（相當于生藥質(zhì)量濃度370 μg/mL）進行后續(xù)炎癥因子的測定。其中各黃芩炭浸膏組給藥濃度（c）計算公式為c=黃芩生藥濃度×相應(yīng)出膏率。

圖3 黃芩浸膏與150 ℃炒制50 min 黃芩炭浸膏對Raw264.7 細胞活力（a）及NO 釋放量（b）的影響 （±s，n=5）

由圖4a可知，炮制溫度為150 ℃時，其NO釋放量整體低于180℃、210℃，且黃芩炭浸膏的抑制作用均顯著優(yōu)于黃芩浸膏。這表明此溫度下制備的黃芩炭抑制NO釋放的作用較佳，不存在炭化過度的現(xiàn)象。炮制溫度為180 ℃、210 ℃時，黃芩炭浸膏對NO釋放的抑制作用存在拐點現(xiàn)象：NO釋放量較低的3個組對應(yīng)炮制條件為180 ℃炒制30 min、210 ℃炒制10 min、210 ℃炒制20 min，與化學(xué)指標中黃芩素、漢黃芩素拐點整體一致，推測其活性差異可能與這兩種物質(zhì)具有一定相關(guān)性；繼續(xù)加熱時，黃芩炭浸膏對NO釋放的抑制作用顯著降低，表明此時已炭化過度。

由圖4b可知，各黃芩炭浸膏組均可以抑制Raw264.7細胞IL-6炎癥因子的釋放。隨著炮制程度的增加，3個溫度制備的黃芩炭浸膏對IL-6的抑制作用均存在拐點，對應(yīng)條件分別為150 ℃炒制50 min、180 ℃炒制30 min、210 ℃炒制20 min。在180 ℃炒制時間超過30 min、210 ℃炒制時間超過20 min后，同樣存在炭化過度的現(xiàn)象，即抗炎活性顯著降低。與NO釋放量不同的是，當150 ℃時的黃芩浸膏及黃芩炭浸膏抑制IL-6作用較為接近，推測是由于其抑制NO、IL-6因子而發(fā)揮抗炎作用的通路不同[17-19]。

綜上可知，當浸膏中黃芩素、漢黃芩素等成分含量較高時對NO、IL-6因子的抑制作用較好，可初步認為黃芩炭在抗炎過程中，黃酮苷元類成分是抑制炎癥因子NO、IL-6釋放量的主要化合物。黃酮糖苷類成分同樣會發(fā)揮藥效，但其作用不及苷元類的活性強，但需進一步驗證。

3.4 黃芩炭炮制過程的形性、生物、化學(xué)三性指標相關(guān)性分析 將黃芩炭的三性指標（即飲片粉末的L*值、b*值、a*值）及黃芩炭浸膏中4種黃酮類成分含量、NO抑制率、IL-6抑制率導(dǎo)入SPSS 23.0軟件進行雙變量Spearman相關(guān)性分析，見表3。其中，炎癥因子抑制率=（A模型組-A實驗組）/（A模型組-A對照組）。

表3 黃芩炭三性指標相關(guān)系數(shù)矩陣

形性指標中L*值與b*值具有正相關(guān)關(guān)系，化學(xué)指標中黃芩苷與漢黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素的相關(guān)系數(shù)均大于0.850。在形性指標與化學(xué)指標關(guān)聯(lián)性上，L*、b*與黃芩苷、漢黃芩苷呈正相關(guān)關(guān)系，a*值與黃芩素、漢黃芩素呈正相關(guān)關(guān)系。這表明黃芩炭在炮制過程中，黃芩苷、漢黃芩苷的含量隨著顏色的加深逐漸降低，黃芩素、漢黃芩素含量隨著粉末的變紅逐漸增加。通過JMP 10軟件對形性指標與化學(xué)指標進行多元回歸分析，由圖5可知，粉末的L*、b*與黃芩苷、漢黃芩苷具有線性函數(shù)變化關(guān)系，與黃芩素、漢黃芩素具有良好的二次函數(shù)關(guān)系。故提示在實際生產(chǎn)中可以通過黃芩炭的顏色變化來初步判斷其化學(xué)成分的含量變化。

圖5 黃芩炭形性指標與化學(xué)指標函數(shù)變化圖

生物指標中NO抑制率與IL-6抑制率的相關(guān)系數(shù)為0.704，表明其具有正相關(guān)關(guān)系。在化學(xué)指標與生物指標關(guān)聯(lián)上，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素與NO抑制率、IL-6抑制率具有一定的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.550。在形性指標與生物指標關(guān)聯(lián)性上，L*、a*、b值與2種炎癥因子抑制率具有較好的正相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果顯示生物指標與多種化學(xué)指標與形性指標均有一定關(guān)聯(lián)性，說明生物指標的影響因素較為復(fù)雜，仍需進一步探索。

3.5 黃芩炭炮制過程的三性指標主成分分析 將不同炮制程度黃芩炭飲片的形性指標（粉末的L*、a*、b*值）、化學(xué)指標（浸膏中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量）、生物指標（對Raw264.7細胞釋放NO、IL-6的抑制率）導(dǎo)入JMP 10軟件進行主成分分析，得到指標載荷圖（見圖6a）及樣本得分圖（見圖6b），其PC1和PC2的累計方差貢獻率為91.6%，可提取黃芩炭三性指標中大部分有效信息。

圖6 黃芩炭三性指標主成分分析載荷圖（a）及得分圖（b）

各指標在載荷圖中聚集為3組：第1組主要為L*、b*、黃芩苷、漢黃芩苷，隨黃芩炭炮制程度增加均具有單向遞減的變化模式；第2組主要為a*、黃芩素、漢黃芩素，隨黃芩炭炮制程度增加均為先上升后下降的變化模式；第3組是NO抑制率、IL-6抑制率，隨黃芩炭炮制程度增加的變化規(guī)律較為復(fù)雜。由圖7a可知，第一組指標與第二組指標之間的相關(guān)性較弱（載荷向量接近正交），但是同組指標的相關(guān)性較強（載荷向量接近共線）：L*、b*、黃芩苷、漢黃芩苷之間具有顯著相關(guān)性，說明可通過黃芩炭粉末L*、b*判斷黃芩苷、漢黃芩苷的含量；a*、黃芩素、漢黃芩素之間具有相關(guān)性，提示可通過測定黃芩炭粉末a*判斷黃芩素、漢黃芩素的含量。

主成分得分圖顯示，19批不同炮制程度的黃芩炭可分為差異明顯的A組、B組、C組3組。A組樣品位于得分圖右下方，包含黃芩飲片及150 ℃炒制10 min、150 ℃炒制20 min、150 ℃炒制30 min、180 ℃炒制10 min、180 ℃炒制20 min、210 ℃炒制10 min的黃芩炭，其L*、b*、黃芩苷、漢黃芩苷較高，可認為該組黃芩炭屬于“炮制不及”。B組樣品位于得分圖右上方，包含150 ℃炒制50 min、150 ℃炒制60 min、180 ℃炒制30 min、210 ℃炒制20 min的黃芩炭，其PC2得分較高，說明a*、黃芩素、漢黃芩素、NO抑制率、IL-6抑制率較高，可認為該組黃芩炭屬于“炮制適中”。C組樣品位于得分圖左上方，包含180 ℃炒制40min、180℃炒制50 min、180 ℃炒制60 min、210 炒制30 min、210 ℃炒制40 min、210 ℃炒制50 min、210 炒制60 min的黃芩炭，其PC1、PC2得分均較低，即4種黃酮類成分含量、NO抑制率等均變低，可認為該組黃芩炭屬于“炮制太過”。

3.6 不足與展望 黃芩的藥效物質(zhì)與作用機制較為復(fù)雜，本研究僅以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素4種黃酮類成分作為化學(xué)指標，以細胞水平的抗炎活性作為生物指標，不能全面反映黃芩炒炭前后的物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效活性差異。現(xiàn)代研究表明，由于分子結(jié)構(gòu)差異，黃芩素的滲透性優(yōu)于黃芩苷，所以黃芩素在胃、小腸及結(jié)腸的吸收均明顯優(yōu)于黃芩苷[20-21]，即黃芩素等苷元類成分相較于黃芩苷等糖苷類成分更容易被人體吸收[22]。黃芩炒炭的炮制機理可能是通過高溫加熱使黃芩苷類成分轉(zhuǎn)化為更易吸收的黃芩素類成分，但該假說仍需進一步研究證實。因此，后續(xù)研究應(yīng)更加全面地分析不同炮制程度黃芩炭的化學(xué)成分，并在動物水平上進行藥效與藥動學(xué)研究，以進一步闡釋黃芩炭的炮制機理，完善黃芩炭炮制終點與質(zhì)量評價的三性指標體系。

4 結(jié) 論

本研究以“辨色論質(zhì)”的理論為出發(fā)點[23-26]，挖掘形性、化學(xué)與抗炎活性之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，建立了黃芩炭的形性、化學(xué)、生物三性指標綜合質(zhì)量分析方法，也在一定程度上闡釋了黃芩炭“炒炭存性”的炮制機理。150 ℃炒制50 min、150 ℃炒制60 min、180 ℃炒制30 min、210 ℃炒制20 min的黃芩炭屬于炮制適中，a*值可以作為黃芩炭抗炎作用炮制終點的形性指標，黃芩素、漢黃芩素含量可以作為黃芩炭抗炎作用炮制終點的化學(xué)指標，NO、IL-6的抑制率可以作為黃芩炭抗炎作用炮制終點的生物指標。研究結(jié)果可為今后黃芩炭的質(zhì)量評價研究提供一定的理論基礎(chǔ)。