中醫(yī)藥治療青春期功能失調(diào)性子宮出血的用藥規(guī)律及新篩選方作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

白 茸，姜 玥，韓延華，吳效科，張躍輝

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

功能失調(diào)性子宮出血（dysfunctional uterine bleeding，DUB）指月經(jīng)周期、經(jīng)期出現(xiàn)異常，多表現(xiàn)為月經(jīng)的淋漓不盡或量大如潮[1]。DUB是無潛在結(jié)構(gòu)異常情況下的異常子宮出血，占青春期異常子宮出血的95%[2]。本病屬中醫(yī)學(xué)中“崩漏”范疇，以“腎-天癸-沖任-胞宮”軸失調(diào)為基本病機，具有遷延難愈、易反復(fù)發(fā)作的特點。DUB為導(dǎo)致青春期女性住院的高發(fā)婦科疑難疾病，嚴重影響青春期女性正常學(xué)習(xí)和生活，容易給青少年造成極大的心理壓力。青春期DUB的治療方案多取決于出血的嚴重程度。此外，積極預(yù)防并發(fā)癥以及調(diào)整并重塑月經(jīng)周期也是治療本病的基本原則。

中醫(yī)藥從辨證論治、審病求因的角度出發(fā)，在治療青春期DUB方面具有獨特優(yōu)勢。盡管之前有學(xué)者分析總結(jié)DUB的用藥規(guī)律，但并未闡述其可挖掘的新組方。筆者收集中文文獻數(shù)據(jù)庫中中醫(yī)藥治療青春期DUB的醫(yī)案，借助中醫(yī)傳承輔助平臺，在分析其用藥規(guī)律和預(yù)測新方的基礎(chǔ)上，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接對其新方潛在作用機制進行研究，以期指導(dǎo)臨床。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 借助中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫，以“青春期”AND（“崩漏”O(jiān)R“功血”O(jiān)R“異常子宮出血”O(jiān)R“功能失調(diào)性子宮出血”O(jiān)R“排卵障礙性異常子宮出血”）AND（“中醫(yī)”O(jiān)R“中藥”）為檢索詞，交叉檢索自建庫至2021年9月的相關(guān)文獻。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）研究類型：實驗性研究、觀察性研究等治療組患者≥20例且有明確處方的文獻；（2）研究對象：臨床明確診斷為異常子宮出血或DUB患者，年齡9～20歲且無性生活史；（3）干預(yù)措施：治療組含有口服中藥湯劑；（4）隨證加減的納入其基礎(chǔ)方。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）動物實驗類文獻、會議文件、綜述類文獻、重復(fù)文獻等；（2）處方不完整或含周期用藥的文獻；（3）中醫(yī)外治法等其他方式治療的文獻；（4）口服中成藥的文獻。

1.4 數(shù)據(jù)處理 將收集到中藥的名稱、功效及性味歸經(jīng)參考2020年版《中華人民共和國藥典》[3]、《中華本草》[4]及《中藥學(xué)》[5]進行規(guī)范化處理。如炒地榆、地榆炭統(tǒng)一為地榆，炮制方法不同、功效有差異的分別記錄，如分別記錄荊芥穗、荊芥、荊芥穗炭。

1.5 青春期DUB用藥規(guī)律分析 利用中醫(yī)傳承輔助平臺對文獻所涉及中藥進行性味歸經(jīng)、藥物頻數(shù)統(tǒng)計、關(guān)聯(lián)規(guī)則和潛在新方分析。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制探究 通過“1.5”用藥分析得到潛在新方，借助中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform, TCMSP）[6]對新方2的中藥化學(xué)成分進行檢索，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18進行篩選[7-8]，并進行各成分靶點的收集，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[9]完成靶點與基因名的匹配。同時在Gene-Cards[10]、在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Dysfunctional uterine bleeding in adolescence”，收集疾病的相關(guān)靶標(biāo)，將藥物的靶點與疾病的靶點進行映射，得到新方2治療青春期DUB的關(guān)鍵靶點。利用Cytoscape3.9.0構(gòu)建“青春期DUB-藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，采用STRING平臺、David數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析[11]。通過PubChem、Uniport、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）獲取化合物和靶點的2D結(jié)構(gòu)式，運用AutoDockVina程序?qū)χ匾衔锖桶悬c進行分子對接，計算結(jié)合能大小，并利用PyMol軟件將結(jié)果可視化。

2 結(jié) 果

2.1 文獻納入情況 檢索得到文獻3 830篇，篩選刪除重復(fù)文獻后得到1 281篇文獻，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)進一步閱讀后，最終共篩選出文獻140篇，涉及154個中藥復(fù)方，整理后錄入于中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5），建立數(shù)據(jù)庫。

2.2 高頻藥物分析 本研究最終納入154個中藥復(fù)方，涉及143味中藥，根據(jù)頻數(shù)從高到低排序，前5味中藥分別為白術(shù)、熟地黃、黃芪、山茱萸、阿膠。高頻中藥使用頻數(shù)及頻率見表1。

表1 高頻中藥頻數(shù)及頻率

2.3 性味歸經(jīng)分析 143味中藥的藥性以溫[38.03%（618/1625）]、平[28.68%（466/1 625）]、寒[27.57%（448/1 625）]為主，藥味以甘[40.44%（1 081/2 673）]、苦[23.91%（639/2 673）]、辛[12.00%（321/2 673）]為主，歸經(jīng)以肝經(jīng)[29.27%（1148/3 922）]、腎經(jīng)[23.33%（915/3 922）]、脾經(jīng)[14.99%（588/3 922）]為主。（見圖1）

圖1 中藥四氣、五味、歸經(jīng)雷達圖

2.4 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的方劑組方規(guī)律分析 對篩選出來的方劑進行組方規(guī)律分析，在中醫(yī)傳承輔助平臺數(shù)據(jù)分析版塊的組方規(guī)律中設(shè)置“支持度”為31[12]，“置信度”為0.8，得到21組高頻藥物模式，共包含12味中藥。（見表2）

表2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的高頻藥對

2.5 新方分析 運用中醫(yī)傳承輔助平臺中數(shù)據(jù)分析版塊的新方分析功能，在相關(guān)度設(shè)置為系統(tǒng)隨機默認值5，懲罰度2的聚類基礎(chǔ)上，得到4個新方組合。（見表3）

表3 新方組合

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制探究 對新方2（黨參+升麻+黃芪+女貞子+墨旱蓮）的成分和靶點進行篩選，得到靶點共1 276個，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索青春期DUB的靶點，合并去重后得到青春期DUB靶點1 810個，將中藥靶點合并去重后與其映射得到中藥治療青春期DUB的關(guān)鍵靶點141個。運用String平臺對關(guān)鍵靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將結(jié)果導(dǎo)出保存，進一步運用Cytoscape將結(jié)果可視化優(yōu)化處理。（見圖2）按照節(jié)點度值從高到底排序，前5的關(guān)鍵節(jié)點為AKT1、p53腫瘤蛋白（TP53）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、VEGFA，表明這些基因在新方2治療青春期DUB中具有重要作用。

圖2 新方2 藥物治療青春期DUB 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建“青春期DUB-藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，共包括196個節(jié)點，其中靶點占141個，疾病占1個，活性成分占49個，藥物占5個；經(jīng)統(tǒng)計共有1 029條邊。（見圖3）其中MOL000098（quercetin、槲皮素）、MOL000006（luteolin、木犀草素）、MOL000422（kaempferol、山奈酚）為度值（degree）排名靠前的成分，在治療青春期DUB中有著重要作用。

圖3 青春期DUB-藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

對141個關(guān)鍵靶點通過David數(shù)據(jù)庫，進行KEGG通路分析，并通過閱讀文獻去除與青春期DUB關(guān)聯(lián)度小的疾病信號通路（如糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等），最終可視化關(guān)聯(lián)度較高的前20條信號通路。（見圖4）通路富集于癌癥通路、PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路等，其中NF-κB通路是最經(jīng)典的與炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。

圖4 KEGG 通路分析

對閱讀文獻及分析結(jié)果得到的新方2治療青春期DUB的重要化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚與潛在作用靶點AKT1、VEGFA、TNF、IL-6進行分子對接，對接結(jié)果得分均≤-5.0kcal/mol，初步推斷新方2與靶點有較好的結(jié)合活性，具體對接值見表4。對接結(jié)合力值越低表明配體和受體結(jié)合越穩(wěn)定，越可能發(fā)生相互作用。VEGFA與槲皮素、木犀草素和山奈酚的結(jié)合力均較低，木犀草素與VEGFA的結(jié)合力值最低，為-7.4 kcal/mol（1 kcal≈4.186 kJ），表明其親和力強，對接可視化模型見圖5。

3 討 論

青春期DUB與青少年下丘腦-垂體-卵巢軸不成熟、機體性激素水平紊亂有關(guān)。青少年的異常子宮出血常被診斷為多囊卵巢綜合征（PCOS）[13]，同時DUB還是青春期PCOS的早期征兆[14]。DUB的危險因素除肥胖外，還可能與環(huán)境、精神情緒、內(nèi)分泌等因素有關(guān)。西醫(yī)對于DUB的治療選擇包括口服避孕藥、孕激素、非甾體抗炎藥、氨甲環(huán)酸、GnRH類似物、達那唑和左炔諾孕酮釋放子宮內(nèi)系統(tǒng)等，現(xiàn)多采用激素序貫療法[15]。臨床顯示，這些治療方法雖具有迅速止血的效果，但不良反應(yīng)較大，病情易反復(fù)。中醫(yī)學(xué)認為本病的主要病機為臟腑失調(diào)，沖任損傷，不能制約經(jīng)血[16]。其致病因素不外乎虛、熱、瘀，且青春期為腎氣尚未充盛之時，此期的女性體質(zhì)多虛，易出現(xiàn)臟腑虛證。

本研究共納入中醫(yī)藥治療青春期DUB的方劑154個，涉及143味中藥，四氣以溫為主，五味以甘、苦為主。甘能緩急，而肝為木臟，主升發(fā)。甘溫可緩肝之急，溫腎陽健脾祛濕；苦能堅陰、燥濕，苦溫祛脾之寒濕。歸經(jīng)以肝經(jīng)為主?！杜R證指南醫(yī)案》曰：“女子以肝為先天”[17]?？梢姼卧谇啻浩贒UB發(fā)病與治療中具有重要作用。中藥歸經(jīng)其次為腎經(jīng)、脾經(jīng)等，印證了本病與肝、腎、脾等臟腑密切相關(guān)。其四氣、五味、歸經(jīng)與臟腑疾病之間有較強的相關(guān)性，也證實本研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

用藥頻數(shù)統(tǒng)計顯示，出現(xiàn)頻數(shù)較高的藥物有白術(shù)、熟地黃、黃芪、山茱萸等。根據(jù)支持度和置信度進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，得出的主要藥對有黃芪-白術(shù)、女貞子-墨旱蓮、熟地黃-山茱萸等，以上藥物突出的功效主要有健脾益氣、滋陰補血、補氣升陽、補益肝腎、涼血止血等?！堕L沙藥解》言白術(shù)“最益脾精，大養(yǎng)胃氣”。《本草蒙筌》亦記載：“在氣主氣，在血主血。”故白術(shù)善助脾運以益氣攝血，且具有調(diào)節(jié)脾胃功能、抑制宮縮、增強機體免疫、調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的作用[18-19]。白術(shù)與黃芪配伍為用，令脾氣旺而統(tǒng)攝有權(quán)。熟地黃，味甘，歸肝、腎經(jīng)。熟地黃配山茱萸，滋補肝腎陰虛之效更佳。研究[20-23]證明熟地黃能止血、促進造血功能，且具有雌激素樣作用。女貞子、墨旱蓮為二至丸的組方藥物，一者甘苦，一者甘酸，相須配伍，可增強滋補肝腎的作用。黨參配白術(shù)、黃芪，益氣健脾養(yǎng)血。

本研究得到4個新方組合。新方1中茜草、地骨皮涼血止血，龍骨、牡蠣、海螵蛸收斂止血。新方1補斂兼顧，標(biāo)本兼治，適合氣虛出血。新方2中黃芪、黨參、升麻健脾益氣；女貞子、墨旱蓮補腎滋陰，養(yǎng)血止血。新方2適合氣陰兩虛出血。新方3、新方4分別適合血瘀出血和腎虛出血。4個新方組合為二至丸、龍骨牡蠣湯、固崩止漏湯等重要組成成分。新方2中黨參性平味甘，治虛勞內(nèi)傷、婦女血崩、胎產(chǎn)諸病”；升麻有升提下陷之中氣的作用；女貞子、墨旱蓮具有促凝止血[24]、免疫調(diào)節(jié)[25]、雌激素樣作用[26]。全方可理解為二至丸合補中益氣湯加減，尤其適用于肝腎陰虛伴脾虛肥胖型的異常子宮出血。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示新方2治療青春期DUB的重要成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇等；新方2起效的關(guān)鍵蛋白主要是AKT1、TNF、IL6、VEGFA等。慢性子宮內(nèi)膜炎癥可引發(fā)異常子宮出血[27]，而月經(jīng)出血也可引發(fā)慢性子宮內(nèi)膜炎。REAVEY J J等[28]研究表明，肥胖導(dǎo)致月經(jīng)時局部子宮內(nèi)膜炎癥狀態(tài)加重，炎癥介質(zhì)TNF、IL6顯著增加，會延遲子宮內(nèi)膜修復(fù)，增加失血量。異常子宮出血還可能與子宮內(nèi)膜血管生成紊亂、子宮內(nèi)膜微血管脆性增加及子宮內(nèi)膜缺氧有關(guān)。槲皮素是一種重要的類黃酮，在卵巢發(fā)育中起雌激素樣作用。槲皮素可增加健康卵泡的體積和數(shù)量，減少閉鎖卵泡的數(shù)量[29]，調(diào)節(jié)卵巢功能，抑制子宮內(nèi)膜增生、血小板聚集等，從而在“卵巢-子宮”的反饋下發(fā)揮止血的作用。木犀草素可通過抑制凝血酶原時間和激活部分凝血酶時間表現(xiàn)出止血活性。此外，木犀草素作為天然抗氧化劑，具備良好的自由基清除和細胞保護特性，可通過抑制核因子-κB的磷酸化，調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和激活蛋白1（Activator protein-1,AP-1）發(fā)揮抗炎作用[30]。VEGF是影響血管新生及內(nèi)皮屏障保護的重要因子。雌激素也是內(nèi)皮功能的重要調(diào)節(jié)因子，在子宮內(nèi)膜中具有促血管生成和抗血管生成的雙重作用，可刺激內(nèi)皮細胞VEGFA上調(diào)，降低周細胞對血小板衍生生長因子β（platelet derived growth factor, PDGF-β）招募活性的敏感度，消融新生血管芽的周細胞覆蓋，導(dǎo)致微血管不穩(wěn)定，增加微血管壁的脆性，從而可能導(dǎo)致出血。AKT能在子宮內(nèi)膜癌中調(diào)節(jié)孕激素受體B依賴的轉(zhuǎn)錄和血管生成。VEGF高表達可促進新生血管的生成，過度增厚子宮內(nèi)膜進而引發(fā)內(nèi)膜剝脫的突破性出血。GAO F等[31]研究證實AKT1在體內(nèi)具有血管保護作用，被VEGF激活后可長期保護內(nèi)皮屏障，促進子宮內(nèi)膜的修復(fù)，從而起到止血的作用。山奈酚能顯著抑制炎癥，通過降低脂多糖（lipopol ysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）過量生成，進而影響相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放[32]。ICAM-1作為淋巴細胞功能相關(guān)分子1（lymphocyte Function-associated antigen1, LFA-1）的關(guān)鍵配體，在子宮內(nèi)膜廣泛分布，可促進多種病理狀態(tài)下的白細胞招募。該分子在子宮內(nèi)膜中具有重要的生理作用，可影響正常月經(jīng)來潮[33]。二至丸治療肝腎陰虛型崩漏可能與AKT1、IL-6、TNF、TP53減少炎癥細胞的分泌，降低炎癥反應(yīng)有關(guān)[24]。

分子對接顯示新方2的活性成分與靶點具有較好的結(jié)合能力，結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol。其中木犀草素與VEGFA的結(jié)合效果最佳。木犀草素、槲皮素能顯著抑制VEGF的表達，從而影響血管新生[34-35]。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，相關(guān)靶點主要富集在PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路、癌癥通路等通路；子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，生殖器異常出血是子宮內(nèi)膜癌最重要的癥狀。盡管大約80%的子宮內(nèi)膜癌發(fā)生在絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女，但發(fā)生在青少年的異常子宮出血不容小覷。有研究表明補腎中藥可通過PI3K/AKT/NF-κB信號通路，減少卵巢顆粒細胞凋亡，增加卵巢血流供應(yīng)，進而提高卵巢功能[36]。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對相關(guān)靶點進行了KEGG通路富集分析，但通路與DUB之間的研究較少，這或許可以為日后DUB通路的機制研究提供思路。

綜上所述，中醫(yī)多從肝腎論治青春期DUB，用藥性味以甘、溫為主，多入肝、腎、脾經(jīng)。挖掘出的新方2藥物中主要活性成分為槲皮素和木犀草素，其主要通過AKT1、VEGFA等關(guān)鍵靶點及PI3K/AKT等信號通路來干預(yù)青春期DUB的進展，藥物起效可能與止血、抗炎及子宮內(nèi)膜修復(fù)等機制相關(guān)，但仍有待于進一步實驗驗證及臨床實踐的探討。