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    HIF-1α/BNIP3 信號通路在IL-4 減輕小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及其與自噬的關(guān)系

    2023-11-13 09:29:44雷愛弟張健莉廈門市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科廈門361101
    中國免疫學(xué)雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:小體腦組織含水量

    雷愛弟 張健莉 周 衡 (廈門市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廈門 361101)

    腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)指因大腦缺血后恢復(fù)血液灌注導(dǎo)致的組織及功能損傷進一步加重的現(xiàn)象,是多種腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)[1]。CIRI 機制復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬等在其中具有重要作用[2]。其中自噬不僅可以通過清除受損或多余的細(xì)胞器修復(fù)神經(jīng)元損傷,且可以通過影響細(xì)胞凋亡和壞死調(diào)控神經(jīng)元死亡[3]。IL-4 是一種重要的抗炎因子,能夠使抗炎因子如IL-10、TGF-β 等分泌增加,同時抑制炎癥因子如IL-1、TNF-α 的釋放,發(fā)揮抗炎作用。研究表明,IL-4 能夠促進自噬產(chǎn)生,減輕小鼠CIRI,并改善遠(yuǎn)期認(rèn)知功能,具有腦保護作用[4]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是細(xì)胞在低氧條件下的重要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子,在常氧條件下受到抑制。Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa 相 互 作 用 蛋 白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3,BNIP3)是HIF-1α 的下游靶基因。自噬與缺氧關(guān)系密切,缺氧誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞主要起保護作用。研究表明,HIF-1α/BNIP3信號通路激活可引發(fā)自噬增加,減輕心肌CIRI 損傷[5]。而HIF-1α/BNIP3、IL-4、自噬三者之間的關(guān)系尚不明確。

    本研究擬探討HIF-1α/BNIP3 信號通路在IL-4減輕大鼠CIRI中的作用及其與自噬的關(guān)系,為進一步明確其機制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實 驗 動 物 SPF 級2 月 齡BALB/c 小 鼠60 只,雌雄各半,體質(zhì)量20~25 g,購自豪威生物科技有限公司[SYXK(津)2019-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23~25 ℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度55%~60%、12 h/12 h 晝夜交替、進食飲水正常、分籠飼養(yǎng)。于1 周后進行實驗。本研究經(jīng)廈門市第五醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20180723)。

    1.1.2 主要試劑與儀器 重組小鼠IL-4(美國PeproTech 公司);大鼠抗小鼠IL-4 中和抗體(美國Verax 公司);2ME2(美國Selleck 公司);HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、Beclin-1 抗體(美國CST 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京博爾西科技有限公司);TTC 染色試劑盒(美國Sigma 公司);TUNEL 染色試劑盒(美國Roche 公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。Thermo 酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];冷凍離心機(美國Beckman公司);蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司);H7500透射電鏡(日本Hitachi公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型制作與分組 將60只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為5 組:假手術(shù)組、缺血再灌注組(CIRI 組)、IL-4 組、HIF-1α 抑制劑2ME2 組(2ME2組)和IL-4+HIF-1α抑制劑2ME2組(IL-4+2ME2組)。采用線栓法構(gòu)建CIRI 組、IL-4 組、2ME2 組和IL-4+2ME2 組 大 腦 中 動 脈 栓 塞(middle cerebral artery embolism,MACO)模型,主要方法如下:腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,并將其仰臥固定于手術(shù)臺上。剃毛和消毒后小心暴露左頸內(nèi)動脈,將尼龍線插入其中,當(dāng)遠(yuǎn)端稍遇阻力時停止插入并固定栓線,閉塞缺血60 min 后取出尼龍線,允許缺血區(qū)域再灌注 24 h,建立MACO 小鼠模型。術(shù)后肌內(nèi)注射200 000 U 青霉素,連續(xù)3 d。假手術(shù)組除不阻斷大鼠大腦中動脈外,其余操作同上。IL-4組、2ME2組、IL-4+2ME2 組建模前30 min 分別腹腔注射相應(yīng)的0.2 ml IL-4C復(fù)合體溶液(IL-4C復(fù)合體溶液配制:將10 μg 重組小鼠IL-4 抗體和50 μg 重組大鼠抗小鼠IL-4抗體混合,用含1%小鼠血清的生理鹽水稀釋到50 μg/ml),尾靜脈注射15 mg/kg 2ME2 溶液。再灌注24 h 時進行神經(jīng)行為學(xué)評分,然后處死小鼠取腦組織。

    1.2.2 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 參考Longa 神經(jīng)功能缺損評分方法,在動物建模14 d 后進行評分,并記錄神經(jīng)功能缺失癥狀,評分標(biāo)準(zhǔn)如下:無神經(jīng)損傷癥狀計0 分;左側(cè)前肢不能完全伸展計1 分;行走時身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計2 分;行走時身體向左側(cè)傾倒計3分;癱瘓,不能站立計4分。

    1.2.3 TTC染色檢測腦梗死體積 采用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后斷頭取腦,將各組腦組織于-80 ℃冰箱冷凍5 min,制成2 mm 厚的冠狀切片。將切片置于2%TTC 溶液中室溫孵育30 min(正常組織染成紅色,梗死組織染成白色),4%多聚甲醛溶液中固定過夜,用數(shù)碼相機等距拍照并將圖像導(dǎo)入電腦,用Image-pro plus 6.0軟件計算大鼠腦梗死體積。

    1.2.4 干濕重法測定大鼠腦組織含水量 取部分腦組織置于錫紙(重量為A)中稱重為B,濕重=B-A;用錫紙包裹腦組織放入烤箱烘干后反復(fù)稱量至恒重C,干重=C-A;計算公式:腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/濕重×100%,即(B-C)/(BA)×100%。

    1.2.5 TUNEL 染色檢測細(xì)胞凋亡 取部分腦組織制作石蠟切片,常規(guī)脫蠟、梯度乙醇脫水后,加入3%H2O2室溫孵育10 min 后用蛋白酶K 于37 ℃消化10 min,加入TUNEL 反應(yīng)混合液37 ℃避光孵育1 h,分別進行梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡。最后中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機選取5個視野,觀察染色結(jié)果并拍照。

    1.2.6 透射電鏡下計數(shù)自噬小體 取部分腦組織剪成小塊,迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h,然后依次進行1%鋨酸固定、梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片機切片(50~70 μm)后,經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色后,于透射電鏡(×10 000)下隨機選取5個視野,觀察自噬小體情況。

    1.2.7 比色法測定SOD、MDA 和ROS 水平 取部分腦組織用生理鹽水沖洗,并制成組織含量為10%的勻漿液,離心取上清,按照SOD、MDA 和ROS試劑盒說明書檢測SOD、MDA和ROS水平。

    1.2.8 Western blot 檢測HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá) 取1份腦組織,加入細(xì)胞裂解液勻漿進行總蛋白提取,BCA 蛋白檢測試劑盒測定各組蛋白濃度,蛋白定量變性后進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,電泳后迅速轉(zhuǎn)至PVDF 膜,置于含5%脫脂牛奶TBST 溶液中室溫封閉2 h,分別加入對應(yīng)一抗HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1(1∶2 000) 4 ℃過夜。TBST 洗滌3 次后,加入二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h,最后避光加入DAB 顯色劑顯色,Bio-Rad 凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照,以GAPDH 作為對照,對各組蛋白進行相對定量分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS22.0 軟件,計量資料以±s表示,采用獨立t檢驗,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較 與假手術(shù)組相比,CIRI 組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量明顯升高(P<0.05);與CIRI 組相比,IL-4 組神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量降低(P<0.05);與IL-4 組相比,2ME2組、IL-4+2ME2組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量升高(P<0.05),見圖1、表1。

    表1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較(±s,n=5)Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores, cerebral infarction volume and cerebral water content of mice in each group (±s,n=5)

    表1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較(±s,n=5)Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores, cerebral infarction volume and cerebral water content of mice in each group (±s,n=5)

    Note:Compared with sham group,1)P<0.05;compared with CIRI group, 2)P<0.05; compared with IL-4 group, 3)P<0.05.

    Cerebral water content/%75.32±1.25 80.47±1.161)77.34±1.211)2)83.43±1.361)3)82.23±1.131)3)Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 Neurobehavioral scores/point 0.20±0.50 2.40±0.581)1.60±0.581)2)3.40±0.501)3)3.20±0.501)3)Cerebral infarction volume/%5.89±1.35 31.42±3.461)15.34±4.271)2)39.67±3.611)3)36.46±3.831)3)

    2.2 各組小鼠細(xì)胞凋亡、SOD、MDA 和ROS 水平比較 與假手術(shù)組相比,CIRI 組小鼠細(xì)胞凋亡、MDA和ROS 水平明顯升高,SOD 水平明顯降低(P<0.05);與CIRI 組相比,IL-4 組細(xì)胞凋亡、MDA 和ROS 水平降低,SOD 水平升高(P<0.05);與IL-4 組相 比,2ME2 組、IL-4+2ME2 組 細(xì) 胞 凋 亡、MDA 和ROS水平升高,SOD水平降低(P<0.05),見圖2、表2。2.3 各組小鼠自噬小體形成情況比較 假手術(shù)組小鼠偶見單個自噬小體;CIRI 組細(xì)胞內(nèi)有較多自噬小體;IL-4 組可見明顯增多的雙層磷脂雙分子層包裹的自噬小體;2ME2 組、IL-4+2ME2 組細(xì)胞存在少量自噬小體,見圖3。

    表2 各組小鼠細(xì)胞凋亡、SOD、MDA和ROS水平比較(±s,n=5)Tab.2 Comparison of cell apoptosis, SOD, MDA and ROS levels of mice in each group (±s,n=5)

    表2 各組小鼠細(xì)胞凋亡、SOD、MDA和ROS水平比較(±s,n=5)Tab.2 Comparison of cell apoptosis, SOD, MDA and ROS levels of mice in each group (±s,n=5)

    Note:Compared with sham group, 1)P<0.05; compared with CIRI group, 2)P<0.05; compared with IL-4 group, 3)P<0.05.

    ROS/(U·mg-1)34.65±8.96 93.47±13.871)58.36±11.471)2)118.14±13.461)3)111.29±10.131)3)Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 Apoptosis/%4.24±1.53 23.34±3.461)13.42±3.581)2)32.36±3.521)3)30.19±3.921)3)SOD/(U·mg-1)269.35±15.11 124.14±10.461)215.39±17.371)2)101.76±12.311)3)106.24±10.181)3)MDA/(nmol·mg-1)5.32±0.95 12.37±1.161)7.14±0.911)2)15.83±1.261)3)14.32±1.611)3)

    圖2 各組小鼠細(xì)胞凋亡觀察(TUNEL染色,×400)Fig.2 Observation of apoptosis of mice in each group(TUNEL staining, ×400)

    圖3 各組小鼠自噬小體形成情況比較(透射電鏡,×10 000)Fig.3 Comparison of formation of autophagosomes in each group of mice(Transmission electron microscope,×10 000)

    2.4 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較 與假手術(shù)組相比,CIRI 組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平明顯升高(P<0.05);與CIRI組相比,IL-4組HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1 水 平 明 顯 升 高(P<0.05);與IL-4 組 相 比,2ME2 組、IL-4+2ME2 組HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平明顯降低(P<0.05),見圖4、表3。

    表3 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of levels of HIF-1α, BNIP3, LC3-Ⅱ and Beclin-1 of mice in each group (±s,n=5)

    表3 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of levels of HIF-1α, BNIP3, LC3-Ⅱ and Beclin-1 of mice in each group (±s,n=5)

    Note:Compared with sham group, 1)P<0.05; compared with CIRI group, 2)P<0.05; compared with IL-4 group, 3)P<0.05.

    Beclin-1 0.11±0.04 0.46±0.111)0.98±0.161)2)0.28±0.061)3)0.20±0.061)3)Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 HIF-1α 0.15±0.08 0.45±0.051)0.84±0.181)2)0.29±0.071)3)0.19±0.043)BNIP3 0.11±0.06 0.38±0.061)0.96±0.171)2)0.24±0.111)3)0.14±0.123)LC3-Ⅱ0.13±0.05 0.44±0.071)0.77±0.211)2)0.23±0.061)3)0.21±0.073)

    圖4 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較Fig.4 Comparison of levels of HIF-1α, BNIP3, LC3-Ⅱand Beclin-1 of mice in each group

    3 討論

    在缺血性腦血管疾病中,缺血性腦卒中具有高發(fā)病率和高病死率特點,臨床一般通過恢復(fù)缺血區(qū)的血流灌注進行治療,但恢復(fù)血流灌注會使組織損傷及功能障礙更加嚴(yán)重,即為CIRI。近年研究發(fā)現(xiàn),CIRI 與自噬調(diào)節(jié)密切相關(guān),在體內(nèi)、外模型中,再灌注期間抑制自噬均不利于神經(jīng)細(xì)胞存活。如ZHANG 等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可降低MCAO 大鼠神經(jīng)功能評分,減小腦梗死體積,降低氧-葡萄糖剝奪/再灌注損傷(OGD/R)后HT22 細(xì)胞凋亡率,增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá),通過促進自噬下調(diào)細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。SUN 等[7]發(fā)現(xiàn)缺血再灌注處理能夠減少線粒體細(xì)胞色素C 釋放,而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制了缺血再灌注處理的這種保護作用,表明缺血再灌注通過激活自噬加速了受損線粒體的清除,有利于神經(jīng)元存活。IL-4是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,對各種損傷、感染性及自身免疫性疾病均具有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-4缺乏會導(dǎo)致神經(jīng)過度興奮,并加重IR 損傷,激活I(lǐng)L-4 信號有助于腦卒中后缺血性損傷的恢復(fù)[8]。LIU 等[9]發(fā)現(xiàn)IL-4 通過激活自噬減輕小鼠CIRI,并改善遠(yuǎn)期認(rèn)知功能。LI 等[10]發(fā)現(xiàn)IL-4 能夠顯著減輕IR 小鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡,通過激活自噬發(fā)揮腦保護作用。本研究通過構(gòu)建小鼠MCAO 模型,發(fā)現(xiàn)CIRI 組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦含水量、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及自噬水平升高;IL-4 處理后,IL-4 組神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦含水量、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激水平降低,自噬水平升高,說明IL-4 能夠減輕CIRI。

    腦組織缺血、缺氧造成腦內(nèi)能量代謝障礙,引起大量ROS、興奮性氨基酸的堆積和釋放,從而導(dǎo)致自噬潮發(fā)生。Beclin-1、LC3 蛋白與自噬的發(fā)生關(guān)系密切。Beclin-1 基因是酵母ATG6 的同系物,可誘導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡,是自噬體形成過程中的重要分子。LC3 是自噬體膜蛋白,參與自噬形成的各個階段,可作為檢測自噬活性的標(biāo)志物,當(dāng)發(fā)生自噬后,LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3-Ⅱ,從而啟動自噬。HE 等[11]發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血再灌注階段,白藜蘆醇能夠提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值、降低p62 及炎癥小體NLRP3 表達(dá),通過增強自噬活性減輕CIRI 所致的炎癥損傷,并且3-MA 預(yù)處理時增強了NLRP3 表達(dá)。SUN 等[12]發(fā)現(xiàn)MCAO 誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬,丁香酚給藥后進一步促進了自噬產(chǎn)生,從而防止體外OGD/R 及CIRI。ZHANG 等[13]發(fā)現(xiàn)氯通道-3(ClC-3)誘導(dǎo)能夠提高Beclin-1 表達(dá),激活自噬,對CIRI 具有保護作用,敲低ClC-3 通過抑制體內(nèi)自噬,顯著加重腦IR 損傷,本研究中與CIRI 組相比,IL-4組小鼠LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平升高,自噬小體數(shù)量增多,說明IL-4通過激活自噬發(fā)揮腦保護作用。

    HIF-1α 是缺氧細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵因子,參與調(diào)節(jié)線粒體自噬,使得ROS 和促凋亡因子釋放減少,防止細(xì)胞進一步損傷,增加細(xì)胞存活。HIF-1α 是BNIP3 的上游基因,活化的HIF-1α 通過上調(diào)BNIP3增強線粒體自噬,從而產(chǎn)生細(xì)胞保護作用。研究表明HIF-1α/BNIP3 信號通路通過增強自噬,保護心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。如LIU等[14]發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌損傷模型中,三七總皂苷通過激活HIF-1α/BNIP3信號通路增強線粒體自噬,對MIRI具有顯著保護作用。YANG 等[15]發(fā)現(xiàn)去鐵胺聯(lián)合七氟醚可通過恢復(fù)和促進HIF-1/BNIP3 介導(dǎo)的線粒體自噬減輕糖尿病大鼠MIRI。ZHU 等[16]發(fā)現(xiàn)小檗堿通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、抑制心肌細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)線粒體自噬介導(dǎo)HIF-1α/BNIP3 通路防止MIRI 損傷。本研究中,與CIRI 組相比,IL-4 組小鼠HIF-1α、BNIP3 水平升高;HIF-1α/BNIP3 信號通路抑制劑2ME2 處理后,2ME2組、IL-4+2ME2組HIF-1α、BNIP3水平降低,說明IL-4通過激活HIF-1α/BNIP3 信號通路發(fā)揮腦保護作用。見圖5。

    圖5 IL-4減輕小鼠CIRI的作用機制Fig.5 Mechanism of IL-4 attenuating CIRI in mice

    綜上所述,IL-4 可通過激活HIF-1α/BNIP3 信號通路,增強細(xì)胞自噬,減少細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,從而減輕小鼠CIRI。

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