牛肉樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌的分離鑒定

朱應(yīng)飛，聶 翔，熊麗霞，吳學平，占忠旭，匡佩琳

（江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西南昌 330000）

產(chǎn)志賀菌毒素的大腸桿菌（Shiga Toxin ProducingEscherichia coli，STEC）和腸致病性埃希氏菌（EnterogenicEscherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原體之一。牛羊等動物作為STEC 和EPEC 的宿主，可通過糞便污染肉食對人們的健康造成危害[1]。STEC 可引起溶血性尿毒癥綜合征，甚至可能導(dǎo)致死亡[2]。EPEC 可引起急性或持續(xù)性腹瀉，多發(fā)于兩歲以下的兒童。通常，EPEC 會引起急性水樣腹瀉，并伴有發(fā)燒、嘔吐和脫水，該病發(fā)病迅速，在攝入細菌后幾小時后出現(xiàn)癥狀[3]。本研究旨在用傳統(tǒng)平板分離法結(jié)合分子生物學方法對江西省南昌市市售牛肉樣品中的STEC 和EPEC 進行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱，上海智誠；實時熒光PCR 儀，伯樂；改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，新生霉素、營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋；CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基，科瑪嘉；改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基，Biolog；引物和探針，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

從2018 年9 月—2019 年3 月，每月采集牛肉及制品數(shù)量為20 份，共采集7 個月合計抽取140 個牛肉及制品樣本。于實驗當日清晨在實驗室周邊超市或農(nóng)貿(mào)市場購買牛肉樣品，并將其置于無菌采樣袋中，詳細記錄樣品信息。采樣后應(yīng)置于2 ～5 ℃保存，在4 h 內(nèi)檢驗。

1.3 樣品制備和預(yù)培養(yǎng)

無菌操作條件下， 取樣品（325±32.5）g 于BagFilter P2000 均質(zhì)袋中，并向均質(zhì)袋中加入（975±19.5）mL 的改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶4的樣品勻液，于（36±1）℃預(yù)培養(yǎng)4 h。

1.4 增菌

在生物安全柜中，向上述經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的樣品勻液中加入新生霉素溶液，使其終濃度為10 mg·L-1，之后于（42±1）℃培養(yǎng)15 ～24 h。同時以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陽性對照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陰性對照，并做培養(yǎng)基空白對照。陽性對照菌株可使用大腸埃希氏菌CICC10670，陰性對照菌株可使用大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.5 實時熒光PCR 初步篩選

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內(nèi)參照，檢測大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）和緊密素編碼基因eae。志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）、緊密素編碼基因eae及內(nèi)參照16S rRNA 的擴增引物和探針見引物和探針的核酸序列等同采用USDA-FSIS MLG 5C.03 中的規(guī)定[4]。

1.6 STEC 菌株的分離和確認

1.6.1 分離

用10 μL 接種環(huán)取上述增菌液劃線于CHROMagar STEC顯色培養(yǎng)基（或改良Rainbow O157顯色培養(yǎng)基），（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h。記錄分離培養(yǎng)基上菌落生長情況及菌落形態(tài)，CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基上STEC 為淡紫色，其他腸桿菌為藍色、無色或被抑制，改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基STEC 有不同顏色的菌落，藍色、紫色、粉色或灰色。

1.6.2 生化確認

將典型或可疑菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種營養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h。大腸埃希氏菌在三糖鐵瓊脂斜面和底層均呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S 實驗陰性。

1.6.3 毒力基因確認

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內(nèi)參照，檢測大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx和緊密素編碼基因eae。實時熒光PCR 反應(yīng)體系，每個樣品做兩個平行。分別以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌的核酸提取物為陽性對照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌核酸提取物為陰性對照，以無菌水為空白對照。引物16S rRNA（上下游）終濃度為0.16 μmol·L-1，引物stx（下上游）終濃度為1.25 μmol·L-1，引物eae（上下游）終濃度為1 μmol·L-1，探針16S rRNA 終濃度為0.1 μmol·L-1，探針stx1、探針stx2終濃度為0.25 μmol·L-1，探針eae終濃度為0.2 μmol·L-1。實時熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃/15 s，59 ℃/1 min，45 個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌總體監(jiān)測情況

于2018 年9 月—2019 年3 月，每個月從超市和農(nóng)貿(mào)市場抽取20 份樣本，7 個月共抽取140 份牛肉及制品樣本，在qPCR 初篩時stx陽性率為45.8%，eae的陽性率為52.2%，2018 年9 月—2019 年3 月，每月的stx初篩陽性率分別為65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初篩陽性率分別為70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。

2.2 攜帶stx 基因的產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希氏菌和攜帶eae 基因的腸致病性大腸埃希氏菌檢出情況

檢出攜帶stx基因的產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希氏菌樣本為4 份，樣本陽性菌株檢出率為2.9%，檢出攜帶eae基因的腸致病性大腸埃希氏菌樣本為12 份，樣本陽性菌株檢出率為8.6%。從9月開始監(jiān)測至3月，每個月共抽取樣本20 個，stx陽性檢出率分別為0%、0%、10%、0%、5%、5%和0%；eae陽性檢出率分別為0%、5%、10%、5%、15%、10%和15%。

2.3 陽性菌落培養(yǎng)特性

將PCR 結(jié)果擴增同時出現(xiàn)stx、eae基因陽性增菌菌懸液劃線或涂布改良CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基和改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h，觀察形態(tài)。不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見圖1。

圖1 顯色平板上陽性菌落

用試劑盒分離得到的陽性單菌總DNA 后，對毒力基因stx、eae進行分析，PCR 擴增結(jié)果見圖2。單獨攜帶stx的有4 株；單獨攜帶eae基因的有9 株。

圖2 分離單菌落PCR 結(jié)果

3 結(jié)論與討論

大腸埃希氏菌是一種隨著環(huán)境變化而多變的微生物，即使侵襲性感染也有可能進化出危及生命的并發(fā)癥，產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）和致腹瀉的大腸埃希氏菌（EPEC）菌株仍然是重要的病原體。STEC 的主要毒力因子是志賀毒素stx1和stx2（由stx1和stx2基因編碼），它們干擾蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致腸道細胞死亡[5]。eae基因是EPEC 引起A/E 損傷所必需的[6]。本次研究抽取的樣本是140 個牛肉樣品，在qPCR 初篩時stx陽性率為45.8%，eae的陽性率為52.2%。篩出STEC 陽性樣本為4 份，樣本陽性菌株檢出率為2.9%，低于TORO 等[7]的研究（10%），篩出EPEC 的陽性樣本為12 份，樣本陽性菌株檢出率為8.6%，高于LEE 等[8]的研究（4.1%）。牛肉樣品中SETC 和EPEC 的檢出率不容樂觀，后續(xù)還將對其毒力做進一步研究，確定其致病性。