雞腸道微生物群的重要性及其研究方法

文│辛勤（山東省鄒城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心）

胃腸道的完整性和腸道微生物群在營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫發(fā)育和抗病方面起至關(guān)重要的作用。胃腸道微生物群的改變可能對(duì)雞的飼料效率、生產(chǎn)力和健康產(chǎn)生不利影響。了解雞胃腸道微生物群的作用和目前微生物群研究方法對(duì)改善家禽胃腸道微生物群具有重要意義。當(dāng)前，細(xì)菌16S核糖體RNA基因測(cè)序的應(yīng)用極大提高了對(duì)雞胃腸道微生物群組成和多樣性的了解。筆者就雞腸道功能及影響雞胃腸道微生物群多樣性的因素進(jìn)行綜述，還比較和回顧了過去和現(xiàn)在用于雞腸道微生物群研究的方法。

一、雞胃腸道微生物群的作用

雞胃腸道分布著復(fù)雜的微生物群落，包括細(xì)菌、真菌、古生菌、原生動(dòng)物和病毒。腸道微生物群可以附著在腸上皮細(xì)胞壁上形成保護(hù)屏障，從而減少致病菌定植的機(jī)會(huì)。這些細(xì)菌產(chǎn)生維生素（如維生素K和維生素B）、短鏈脂肪酸（如乙酸、丁酸和丙酸）、有機(jī)酸（如乳酸）和抗菌化合物（如細(xì)菌素），降低甘油三酯，并誘導(dǎo)非致病性免疫反應(yīng)，為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)。另一方面，胃腸道微生物群也可能是沙門氏菌和彎曲桿菌等病原體的來源，它們可以傳播給人類，可能對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

正常的腸道微生物群對(duì)宿主有好處也有壞處。共生微生物群提供的主要好處是競(jìng)爭(zhēng)性地排除病原體或非本體微生物，免疫刺激，以及對(duì)宿主提供營(yíng)養(yǎng)。此外，共生微生物群可以刺激免疫系統(tǒng)的發(fā)育，包括黏液層、上皮單層、腸道免疫細(xì)胞（如細(xì)胞毒性和輔助性T細(xì)胞、免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞和吞噬細(xì)胞）和固有層，在宿主和微生物之間建立屏障，對(duì)抗有害腸道微生物。在遠(yuǎn)端腸道（盲腸和結(jié)腸）中，微生物群也可產(chǎn)生能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸和短鏈脂肪酸，最終為宿主所利用。這些短鏈脂肪酸具有抑菌特性，能消除食源性病原體，如沙門菌。短鏈脂肪酸也是動(dòng)物的能量來源，并能進(jìn)一步刺激腸道上皮細(xì)胞增殖，從而增加胃腸道吸收表面積。短鏈脂肪酸的產(chǎn)生會(huì)降低結(jié)腸pH值，從而抑制膽汁向次級(jí)膽汁產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。此外，腸道微生物群還參與宿主氮化合物的代謝，盲腸細(xì)菌可以將尿酸轉(zhuǎn)化為氨，隨后被鳥類吸收，并進(jìn)一步用于生產(chǎn)谷氨酰胺等氨基酸。共生微生物群也會(huì)給宿主帶來危害。在近端腸道（砂囊和小腸）中，微生物群與宿主爭(zhēng)奪能量和蛋白質(zhì)。在近端和遠(yuǎn)端腸道中，微生物可產(chǎn)生有毒代謝物（如氨基酸分解代謝物）和分解膽汁酸，分別抑制雞只生長(zhǎng)和降低脂肪消化率。微生物群的存在和活動(dòng)增加了機(jī)體對(duì)能量和蛋白質(zhì)的需求，對(duì)雞的生長(zhǎng)性能有一定影響。

不平衡的腸道微生物群通常被稱為腸道生態(tài)失調(diào)，可能導(dǎo)致胃腸道的一系列不良反應(yīng)，包括腸道屏障功能降低（如腸壁變薄）和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化不良，增加了微生物群更替和炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。非傳染性和傳染性應(yīng)激源均可導(dǎo)致微生物群失調(diào)。非感染性因素包括環(huán)境應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)失衡、飲食改變、霉菌毒素、管理不善、酶功能障礙或宿主遺傳。感染因素包括病毒或細(xì)菌侵入、球蟲病或有害微生物如產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的有毒代謝物。

腸道微生物群可進(jìn)一步分為腸腔內(nèi)微生物群和黏膜微生物群。腸腔內(nèi)微生物群的組成由可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗菌物質(zhì)含量和飼料通過速率決定。黏膜附著菌群的組成受多種宿主因素的影響，如腸細(xì)胞膜上特異性黏附位點(diǎn)的表達(dá)、分泌免疫球蛋白的分泌和黏液的產(chǎn)生率。

腸道微生物群的組成和功能已被證明根據(jù)雞只日齡、在腸道中的位置和飲食成分而變化。日齡是影響胃腸道細(xì)菌組成、細(xì)胞密度和代謝功能的重要因素之一。隨著雞日齡的增長(zhǎng)，梭狀芽孢桿菌的相對(duì)豐度較高，而乳酸桿菌在整個(gè)生長(zhǎng)周期中含量較低。3日齡雞的腸道中含有乳酸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和彎曲桿菌，而7～21日齡雞的腸道中更常見的是嗜酸乳酸桿菌、腸球菌和鏈球菌，28～49日齡時(shí)，腸道中開始含有大量卷曲乳桿菌。腸道不同位置的微生物群大不相同，小腸中主要的細(xì)菌包括腸球菌、梭菌、乳酸桿菌、葡萄球菌、甲基桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、埃希氏菌、彎曲桿菌、志賀菌和棒狀桿菌等；盲腸中主要的細(xì)菌包括甲烷球菌、乳酸螺旋桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌、梭菌、葡萄球菌、鏈球菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和彎曲桿菌等；大腸中主要的細(xì)菌包括乳酸桿菌和埃希氏桿菌。飼料成分直接影響到腸道微生物群，如飼料中的益生元對(duì)結(jié)腸中的一些細(xì)菌具有積極影響，低聚果糖和低聚半乳糖可增加雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，除Bifidobacterium bifidum（雙歧桿菌的一種）外，大多數(shù)雙歧桿菌菌株（如Bifidobacterium fiagilk、Bifidobacterium thetaiotaomicron、Bifidobacterium vulgatus、Bifidobacterium dktasonk和Bifidobacterium ovatus）都可以利用低聚果糖作為生長(zhǎng)和發(fā)酵促進(jìn)劑。而大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等微生物無法利用低聚果糖作為發(fā)酵碳水化合物來源。另一種益生元，甘露寡糖與具有1型菌毛（甘露糖敏感凝集素）的潛在致病性革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）結(jié)合，防止病原體附著在腸壁上。因此，飲食中的益生元對(duì)下腸道的影響包括作為盲腸和結(jié)腸微生物群的食物和發(fā)酵源，發(fā)酵終產(chǎn)物（如不飽和脂肪酸）的產(chǎn)生，刺激糖解發(fā)酵；大腸內(nèi)容物的酸化，盲腸和結(jié)腸上皮的增生，刺激結(jié)腸激素肽的分泌和腸道內(nèi)容物在盲腸-肛門運(yùn)輸?shù)募铀?。腸道微生物群的組成和功能還受到飼養(yǎng)管理、品種、性別和環(huán)境應(yīng)激等多種因素的影響。

二、雞胃腸道微生物群的研究方法

研究雞腸道微生物群的傳統(tǒng)方法是基于微生物培養(yǎng)，這些方法對(duì)特定條件下的可培養(yǎng)細(xì)菌具有高度選擇性。但大多數(shù)微生物難以被培養(yǎng)，一般認(rèn)為給定樣本中存在的極少數(shù)（僅為0.1%～1%）微生物群可以被培養(yǎng)。因此，腸道微生物群的豐富度（物種數(shù)量）和多樣性（相對(duì)豐度）難以通過培養(yǎng)的方法被了解和研究。

分子生物技術(shù)的發(fā)展為研究腸道不同部位微生物群的組成、多樣性、功能研究和預(yù)測(cè)，以及相互作用提供了新的研究方法，每種技術(shù)都有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測(cè)序方法能廣泛鑒定腸道微生物群的屬、種、株，數(shù)據(jù)庫(kù)豐富，但成本高昂，耗時(shí)費(fèi)力。Realtime PCR方法能對(duì)靶向群體中的特異性基因表達(dá)，靈敏度高，同樣受限于成本。變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、時(shí)間溫度梯度凝膠電泳、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法能擴(kuò)增常見的16S rDNA序列，快速且方便比較，但只能提供相對(duì)粗略的分類和分辨，數(shù)據(jù)通常是定性或半定量的。其中，16S rRNA基因擴(kuò)增子的高通量測(cè)序已迅速成為雞胃腸道微生物群研究的首選方法。16S rRNA分子是核糖體的一個(gè)小亞基，具有所有細(xì)菌中高度保守的序列相似區(qū)域。從糞便或消化物樣本中提取微生物DNA，并使用靶向16S rRNA基因保守區(qū)的寬范圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這些擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序通?？梢栽趯倩蚍N水平上區(qū)分細(xì)菌，每個(gè)序列的相對(duì)豐度反映了原始樣本中該細(xì)菌的相對(duì)豐度。

高通量或下一代測(cè)序方法成為研究腸道微生物群的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)作用的有力工具。下一代測(cè)序方法已成為一種方便、快速、準(zhǔn)確的基因組研究方法，盡管有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在局限性，包括讀取時(shí)間短和成本高。宏基因組學(xué)已被用于研究盲腸功能、腸道對(duì)病原體攻擊的反應(yīng)、微生物反應(yīng)與生產(chǎn)性能參數(shù)的相關(guān)性、肥瘦肉雞品系的比較、病毒組描述和抗生素耐藥基因。然而，由于使用的數(shù)據(jù)平臺(tái)、品種、樣本類型、采樣方法等方面的差異，很難進(jìn)行比較。為了規(guī)避基于序列分析的一些限制，蛋白質(zhì)組學(xué)方法最近也被用于確定微生物群的代謝和功能特性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)量基因原位轉(zhuǎn)錄，即使在采樣過程中需要非常小心，也能準(zhǔn)確反映生理功能。多組學(xué)方法的開發(fā)和應(yīng)用對(duì)未來的研究非常重要，將有助于我們更好地了解如何根據(jù)環(huán)境、飲食和生理變化來優(yōu)化雞腸道微生物群，從而為提升雞的健康提供新的可能。