抗炎因子A20與腫瘤患者預(yù)后及免疫調(diào)節(jié)通路的泛癌分析

尹翔安, 譚纖, 蔣斌元, 王丹玲

1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院, 湖南衡陽 421001;2.南華大學(xué)未來科學(xué)研究院, 湖南長(zhǎng)沙 410008;3.南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院, 湖南長(zhǎng)沙 410004

炎癥和腫瘤之間存在密不可分的聯(lián)系,A20最初作為腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的反應(yīng)分子被發(fā)現(xiàn),也被稱作腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor inducing protein 3,TNFAIP3),因其抗炎抗凋亡的生物學(xué)功能受到腫瘤研究者的廣泛關(guān)注[1-2]。作為炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)節(jié)因子,A20對(duì)核因子(nuclear factor,NF)-κB通路的激活有負(fù)向調(diào)控作用,可抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路中RELA p65的激活及入核,從而避免機(jī)體產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)[3]。

A20基因全長(zhǎng)4 665個(gè)核苷酸,定位于6號(hào)染色體,編碼790個(gè)氨基酸的蛋白序列,相對(duì)分子質(zhì)量約90 kDa。A20蛋白在氨基端存在卵巢腫瘤去泛素化酶結(jié)構(gòu)域,具有去泛素化酶的功能;在羧基端存在7個(gè)鋅指蛋白序列,具有泛素化E3連接酶的作用,A20在泛素化過程中具有雙重作用,可對(duì)靶向分子進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)[4]。抗炎過程中,A20的主要作用是反饋抑制NF-κB信號(hào)通路的過度激活,避免炎癥反應(yīng)的失控[5]。然而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,慢性炎癥反應(yīng)可能具有雙面性,既有抑癌的一面也有促癌的一面,研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)腫瘤的存活,并引起腫瘤化療耐受等一系列后果[6-7]。NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活會(huì)反饋誘導(dǎo)A20基因的過度表達(dá),兩者之間的相互調(diào)節(jié)對(duì)炎癥反應(yīng)的影響可能非常復(fù)雜,并給腫瘤患者預(yù)后帶來未知的結(jié)果。本研究借助生物信息學(xué)方法對(duì)不同腫瘤中A20基因的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)A20對(duì)部分腫瘤的預(yù)后存在不良影響,A20與腫瘤的免疫反應(yīng)密切相關(guān),且在大部分腫瘤中與NF-κB信號(hào)通路核心分子RELA p65共表達(dá),提示A20是腫瘤免疫過程中非常重要的研究對(duì)象。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及表達(dá)分析

不同腫瘤及相應(yīng)癌旁組織中A20基因的表達(dá)數(shù)據(jù)及隨訪資料均來自GTEx(https://gtexport.org/home/)和TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫,整合GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫中樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)后進(jìn)行歸一化處理,使用log2表達(dá)倍數(shù)變化,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)集中涉及的腫瘤名稱及相應(yīng)的縮寫如下:腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma,ACC)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)、乳腺浸潤(rùn)癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(cervical and endocervical cancers,CESC)、膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)、結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma,COAD)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBC)、食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe,KICH)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)、急性髓細(xì)胞樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(lower-grade glioma,LGG)、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、間皮瘤(mesothelioma,MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PCPG)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma,PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma,READ)、肉瘤(sarcoma,SARC)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)、胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、睪丸癌(testicular germ cell tumors,TGCT)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma,THCA)、胸腺癌(thymoma,THYM)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)、子宮肉瘤(uterine carcinosarcoma,UCS)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UVM)。

1.2 危險(xiǎn)因素與患者預(yù)后分析

使用COX回歸分析A20基因表達(dá)對(duì)不同腫瘤的危險(xiǎn)程度,繪制Kaplan-Meier生存曲線研究A20基因表達(dá)情況與患者生存期(overall survival time in days,OS)和無進(jìn)展生存期(progression-free interval,PFI)的關(guān)系。危險(xiǎn)因素(hazard ratio,HR)和95%可信區(qū)間使用單變量因素分析。

1.3 基因富集分析

根據(jù)A20基因的表達(dá)程度,將樣本平均分成高表達(dá)和低表達(dá)兩組檢測(cè)A20基因表達(dá)對(duì)腫瘤組織內(nèi)生物學(xué)功能及信號(hào)通路的影響,使用GSEA軟件分析高表達(dá)組和低表達(dá)組中KEGG和HALLMARK通路的基因富集情況,FDR<0.05及NES>0.65被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 A20與RELA p65基因的共表達(dá)分析

使用TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)對(duì)不同腫瘤組織中A20與NF-κB信號(hào)通路中RELA p65基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,檢測(cè)A20基因與RELA p65的共表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用t檢驗(yàn)比較A20在癌組織與癌旁組織中的表達(dá);生存分析中,采用COX回歸分析計(jì)算HR值和P值;采用Kaplan-Meier曲線比較不同A20表達(dá)情況的腫瘤患者預(yù)后情況。P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 22種腫瘤中A20基因的表達(dá)量發(fā)生明顯改變

比對(duì)27種不同腫瘤的癌組織與癌旁組織A20表達(dá)情況,只有BRCA、KICH、KIRP、PRAD、READ 5種腫瘤的癌與癌旁組織A20基因表達(dá)量差異無顯著性(P>0.05);存在A20表達(dá)差異的22種腫瘤中BLCA、LUAD、LUSC、OV、SKCM、THCA、UCEC、UCS這8種腫瘤的癌旁組織A20表達(dá)均高于癌組織(P<0.05);剩余14種腫瘤的癌組織中A20表達(dá)均高于癌旁組織(P<0.05;圖1)。

圖1 不同腫瘤中A20基因在癌與癌旁組織中的差異表達(dá)結(jié)果a為P<0.05;b為P<0.01;c為P<0.001,與相應(yīng)癌旁組織比較。

2.2 A20基因表達(dá)與腫瘤患者整體生存期的關(guān)系

利用COX回歸分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)A20基因是ACC、CESC、GBM、LGG這4種腫瘤患者OS的危險(xiǎn)因素(圖2)。利用A20表達(dá)及患者OS數(shù)據(jù)繪制Kaplan-Meier曲線,結(jié)果顯示,在ACC、CESC、GBM、LGG腫瘤中A20基因高表達(dá)的腫瘤患者整體生存時(shí)間短于A20基因低表達(dá)的腫瘤患者(圖3)。

圖2 在ACC、CESC、GBM、LGG這4種腫瘤中A20基因高表達(dá)為腫瘤患者OS的危險(xiǎn)因素

圖3 高表達(dá)A20基因表達(dá)與OS的Kaplan-Meier曲線

2.3 A20基因表達(dá)與腫瘤患者病情無發(fā)展間期的關(guān)系

利用COX回歸分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)A20基因是ACC、GBM、THYM這3種腫瘤患者的危險(xiǎn)因素(圖4)。利用A20基因表達(dá)及患者PFI數(shù)據(jù)繪制Kaplan-Meier曲線,發(fā)現(xiàn)在ACC、GBM、THYM這3種腫瘤中高表達(dá)A20基因的腫瘤患者PFI明顯少于低表達(dá)A20基因的腫瘤患者(圖5),提示A20基因表達(dá)高的腫瘤患者存在更大的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 A20基因表達(dá)與PFI的Kaplan-Meier曲線

2.4 腫瘤中A20相關(guān)基因的功能富集分析結(jié)果

使用GSEA分析腫瘤基因信息數(shù)據(jù)中A20基因高表達(dá)組和A20基因低表達(dá)組中相關(guān)KEGG和Hallmark通路的基因富集情況,發(fā)現(xiàn)A20基因高表達(dá)與NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路的基因富集密切相關(guān),并且TNF-α/NF-κB信號(hào)通路、IL-2/STAT5信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物基因發(fā)生富集。當(dāng)A20基因處于低表達(dá)水平時(shí),阿爾茨海默癥、核糖體功能、帕金森病及氧化磷酸化相關(guān)信號(hào)通路的基因發(fā)生富集,并且脂肪生成、胰臟B細(xì)胞功能、脂肪酸代謝及氧化磷酸化標(biāo)志物相關(guān)基因發(fā)生富集(圖6)。

2.5 A20與RELA p65基因的共表達(dá)情況

鑒于A20與NF-κB信號(hào)通路的密切聯(lián)系,使用TIMER2.0平臺(tái)分析腫瘤數(shù)據(jù)庫多種腫瘤中A20與RELA p65的共表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在大部分腫瘤中A20與NF-κB信號(hào)通路中的核心分子RELA p65表達(dá)存在顯著的正相關(guān)表達(dá)情況(圖7),僅在BRCA-HER2、GBM、SKCM及UVM數(shù)據(jù)中未存在兩者共表達(dá)的情況。

圖7 A20基因與RELA p65基因的共表達(dá)分析

3 討 論

本研究通過A20基因的泛癌分析發(fā)現(xiàn)其在大部分腫瘤中存在表達(dá),且ACC、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LAML、LGG、LIHC、PAAD、STAD、TGCT這14種腫瘤中A20的表達(dá)顯著高于癌旁組織。高表達(dá)A20基因?qū)τ贏CC、CESC、GBM、LGG這4類腫瘤患者的整體生存時(shí)間是高危因素,并且A20基因高表達(dá)可能會(huì)造成ACC、GBM、THYM這3類腫瘤患者更短的病情無發(fā)展期,提示更短的復(fù)發(fā)時(shí)間和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),但是部分腫瘤如ACC、CHOL、KICH、UCS的患者樣本數(shù)量未到100例,擴(kuò)大數(shù)量可能會(huì)使預(yù)測(cè)結(jié)果更加可靠?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)A20與腫瘤患者的免疫反應(yīng)密切相關(guān),參與了多個(gè)免疫反應(yīng)途徑,結(jié)合現(xiàn)有研究認(rèn)為A20與NF-κB通路關(guān)系非常密切,且A20基因與RELA p65基因在30個(gè)腫瘤類別中呈現(xiàn)顯著的共表達(dá)關(guān)系;提示A20基因?qū)F-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)非常重要,是研究腫瘤免疫的關(guān)鍵切入點(diǎn)。

A20基因的高表達(dá)對(duì)于GBM患者來說不僅影響整體生存時(shí)間還具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),GBM患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示,在癌旁組織中A20的表達(dá)量明顯低于癌組織,但GBM癌組織中A20與RELA p65的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性,推測(cè)A20可能通過其他途徑被異常持續(xù)激活,且可能存在其他A20特異性識(shí)別的泛素化靶點(diǎn),相關(guān)的分子機(jī)制亟待探索。有研究發(fā)現(xiàn),在GBM中抑制A20基因的表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,減少膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生存時(shí)間[8-9],本文認(rèn)為膠質(zhì)瘤中A20的相關(guān)細(xì)節(jié)值得進(jìn)一步研究和探索。在SKCM中,癌旁與癌組織的A20表達(dá)未發(fā)現(xiàn)顯著性表達(dá)差異,且A20與RELA p65不存在共表達(dá)關(guān)系,推測(cè)SKCM中存在某種特有的免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制,亦或者A20通過其他免疫調(diào)控通路參與了黑色素瘤的免疫調(diào)節(jié),近年有研究者指出在黑色素瘤中A20可通過泛素化調(diào)控STAT3實(shí)現(xiàn)對(duì)PD-L1表達(dá)的影響,A20可能會(huì)是黑色素瘤免疫治療的一個(gè)新突破口[10]。

到目前為止,A20基因被發(fā)現(xiàn)已有30年,被認(rèn)為是保持組織免疫平衡的重要分子,其抗炎、抗凋亡、抗壞死的功能也逐步被人們所認(rèn)識(shí),對(duì)A20的機(jī)制及應(yīng)用的研究一直在繼續(xù)[11-12]。人們發(fā)現(xiàn)A20減少與帕金森疾病進(jìn)展密切相關(guān)[13];而髓樣細(xì)胞A20的缺乏可導(dǎo)致小鼠脂肪酸代謝能力的增強(qiáng),減少肥胖及胰島素抵抗的發(fā)生[14]。鑒于A20功能的重要性,以A20為基礎(chǔ)制定疾病治療策略將是未來的重要研究方向。隨著A20研究文獻(xiàn)的積累及生物信息學(xué)的進(jìn)步,泛癌分析將更有效且快速的幫助研究者尋找解決問題的切入點(diǎn),也希望本文能對(duì)A20的研究提供思路與線索。