硫酸亞鐵和蛋氨酸螯合鐵在草魚(yú)實(shí)用膨化飼料中應(yīng)用效果比較研究

徐光明 劉阿朋 董立學(xué) 陸 星 田 娟 文 華 易新文 柴 毅 蔣 明*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,荊州 434025;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,武漢 430223;3.深圳市澳華集團(tuán)股份有限公司,深圳 518052;4.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,荊州 434025)

鐵作為動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一,是血紅蛋白、肌紅蛋白及含鐵酶(細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶等)的組成部分或激活因子,參與機(jī)體組織呼吸過(guò)程[1][1],并且,鐵還與免疫細(xì)胞增殖和免疫器官成熟密切相關(guān)[2]。魚(yú)類(lèi)可通過(guò)腸黏膜和鰓膜吸收可溶性鐵,但在自然狀態(tài)下,水體中可溶性鐵的濃度較低。在精養(yǎng)體系中,飼料中的鐵幾乎是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)唯一的來(lái)源[3]。飼料中鐵的添加形式主要有3種,即有機(jī)螯合鐵、簡(jiǎn)單有機(jī)酸鐵和無(wú)機(jī)鐵[4]。蛋氨酸螯合鐵是有機(jī)螯合鐵中的一種,不僅毒性低,而且穩(wěn)定性好[5-6],它的生物利用率是無(wú)機(jī)鐵的1.25～1.85倍,吸收速度比無(wú)機(jī)鐵高3～5倍[7]。目前關(guān)于硫酸亞鐵和蛋氨酸螯合鐵的應(yīng)用效果研究主要集中在哺乳動(dòng)物[8-10]、禽類(lèi)[11-13]以及少量水生動(dòng)物[5]上。研究表明,在飼糧中適當(dāng)添加硫酸亞鐵可以改善母豬[14]和肉兔[15]鐵營(yíng)養(yǎng)狀況及抗氧化性能;在商品蛋雞[16]和仔雞[17]飼糧中添加蛋氨酸螯合鐵更有利于其生產(chǎn)性能提高。以往的研究表明水產(chǎn)動(dòng)物可更好的利用蛋氨酸螯合鐵[5],但是也有部分研究表明水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)不同類(lèi)型的鐵元素利用效率無(wú)明顯差異[18],還有研究表明實(shí)用飼料中補(bǔ)充鐵抑制了水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[19]。在商業(yè)飼料配方體系中,由于膨潤(rùn)土等飼料原料中鐵含量較高,因此也存在飼料中是否需要額外補(bǔ)充鐵的爭(zhēng)議。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量第一的淡水魚(yú)類(lèi),2021年我國(guó)草魚(yú)產(chǎn)量為576萬(wàn)t,占淡水漁業(yè)總量的18.08%[20]。草魚(yú)也是代表性的草食性養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),是重要的魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與飼料研究對(duì)象。因此,本研究在草魚(yú)實(shí)用飼料中分別添加硫酸亞鐵、蛋氨酸螯合鐵以及二者的混合物(以鐵元素計(jì),二者比例為1∶1),采用工業(yè)化飼料工藝生產(chǎn)膨化飼料,在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖草魚(yú)幼魚(yú)8周,比較補(bǔ)充不同鐵源飼料對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、機(jī)體鐵含量、血清生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)的影響,以期確定草魚(yú)實(shí)用膨化飼料中是否需要補(bǔ)充鐵及適宜的鐵源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

采用草魚(yú)實(shí)用配方配制4種試驗(yàn)飼料。對(duì)照飼料(T1組)不補(bǔ)充外源鐵,另在對(duì)照飼料中補(bǔ)充不同來(lái)源的鐵元素(112 mg/kg),分別為370 mg/kg硫酸亞鐵(本次試驗(yàn)所用硫酸亞鐵的鐵元素有效含量為30%,T2組)、1 120 mg/kg蛋氨酸螯合鐵(本次試驗(yàn)所用蛋氨酸螯合鐵的鐵元素有效含量為10%,T3組)以及190 mg/kg硫酸亞鐵+560 mg/kg蛋氨酸螯合鐵(2種鐵源分別提供56 mg/kg的鐵元素,T4組)。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)粉碎通過(guò)60目篩,按表1配比混合均勻,少量的組分采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合,然后用膨化機(jī)組制成Φ1.0 mm的顆粒飼料,每種飼料制作3 t,取中間段1包飼料用于試驗(yàn),養(yǎng)殖試驗(yàn)期間儲(chǔ)存于-4 ℃冰柜中。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 Groups T1T2T3T4營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels/%3)水分 Moisture9.879.409.699.05粗蛋白質(zhì) Crude protein29.5729.4329.4229.49粗脂肪 Crude lipid5.915.715.866.30粗灰分 Ash8.678.088.988.80鐵元素 Fe/(mg/kg)554.21655.01647.66662.41

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。草魚(yú)購(gòu)回經(jīng)4周馴養(yǎng)后,選擇初始體重為(4.30±0.20) g的健康草魚(yú)480尾,隨機(jī)分配于16個(gè)養(yǎng)殖桶(直徑1.0 m,水深0.75 m)中,每桶30尾,隨機(jī)分為4組(每組4個(gè)養(yǎng)殖桶),分別投喂4種試驗(yàn)飼料。每日投喂2次(09:00及19:00),日投喂量為魚(yú)體重的3%～5%,每2周稱重1次,根據(jù)體重變化和攝食情況調(diào)整投喂量,每天記錄試驗(yàn)魚(yú)攝食及死亡情況,飼養(yǎng)周期為8周。飼養(yǎng)試驗(yàn)期間,水溫在26～33 ℃,溶解氧濃度>5.0 mg/L,pH在7.4～7.6,總氨氮濃度<0.2 mg/L,自然光照。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,以養(yǎng)殖桶為單位進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)挑取6尾魚(yú),用75 mg/L的魚(yú)安定(MS-222)溶液麻醉,分別測(cè)量其體長(zhǎng)、體重,之后進(jìn)行尾靜脈采血,用于血常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定,然后進(jìn)行解剖,取內(nèi)臟、肝臟并稱其質(zhì)量,用于計(jì)算肝體比、臟體比和肥滿度等指標(biāo),并將肝臟組織用固定液固定,用于肝臟切片的制作。每個(gè)養(yǎng)殖桶再隨機(jī)選取3尾魚(yú),保存于-40 ℃的冰箱中,用于全魚(yú)的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能及形體指標(biāo)的計(jì)算

根據(jù)以下公式,計(jì)算增重率(weight gain rate,WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate,SGR)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)、成活率(survival rate,SR)、肥滿度(condition factor,CF)、肝體比(hepatosomatic index,HSI)、臟體比(viscerosomatic index,VSI)。

增重率(%)=(Wt-W0)×100/W0;
特定生長(zhǎng)率(%/d)=(lnWt-lnW0)×100/t;
飼料系數(shù)=F/(Wt-W0);
成活率(%)=Nt×100/N0;
肥滿度(g/cm3)=W×100/L3;
肝體比(%)=Wh×100/W;
臟體比(%)=Wv×100/W。

式中:Nt為終末尾數(shù);N0為初始尾數(shù);Wt為終末均重(g);W0為初始均重(g);W為體重(g);t為養(yǎng)殖時(shí)間(d);F為飼料攝入總質(zhì)量(g);Wh為肝重(g);Wv為內(nèi)臟重(g);L為體長(zhǎng)(cm)。

1.4.2 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定

試驗(yàn)飼料和全魚(yú)水分含量采用105 ℃烘干恒重法測(cè)定,粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法的測(cè)定,粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定,粗灰分含量采用550 ℃馬弗爐灼燒法測(cè)定。利用濕法消解-乙炔火焰原子吸收光譜法測(cè)定全魚(yú)和試驗(yàn)飼料中鐵元素的含量,先將樣品用ETHOS UP型微波消解儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)消解,之后采用AA320N型原子吸收分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)檢測(cè)吸光度,通過(guò)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算全魚(yú)和試驗(yàn)飼料中鐵元素含量。

1.4.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

采用BX-3010型全自動(dòng)生化分析儀(希森美康,日本)測(cè)定血清中堿性磷酸酶(ALP)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的活性以及白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)和總膽固醇(TCHO)的含量。

1.4.4 血常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

采用BC-2800vet型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、血小板數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞比容、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)、平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板比容。

1.4.5 組織切片的觀察

取多聚甲醛固定的肝臟,經(jīng)流水沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明、包埋等處理后用Leica 切片機(jī)制作成厚度5～6 μm的組織切片,經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后用中性樹(shù)脂封片,在顯微鏡下拍照,并分析圖片。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Turkey法進(jìn)行組間多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐵源對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

由表2可知,T3組草魚(yú)的終末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于T1組(P<0.05),T2、T4和T3組的終末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率有依次上升趨勢(shì),但組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。T1組的肝體比顯著高于T4組(P<0.05)。草魚(yú)的初始均重、飼料系數(shù)、成活率、肥滿度和臟體比各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 飼喂添加不同鐵源飼料8周的草魚(yú)的生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)

2.2 不同鐵源對(duì)草魚(yú)體成分和鐵元素含量的影響

由表3可知,全魚(yú)水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。T1和T3組的全魚(yú)粗脂肪含量顯著高于T2和T4組(P<0.05)。T1組全魚(yú)鐵元素含量顯著低于T2、T4和T3組(P<0.05),而T2組的全魚(yú)鐵元素含量顯著低于T3組(P<0.05)。

表3 飼喂添加不同鐵源飼料8周的草魚(yú)的體成分和鐵元素含量

2.3 不同鐵源對(duì)草魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知,草魚(yú)血清ALT活性和TG含量各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。T3組的血清TP和ALB含量顯著高于T4和T1組(P<0.05),T2組顯著高于T4組(P<0.05)。T1組的血清GLU含量顯著高于其他各組(P<0.05)。T3和T2組的血清TCHO含量顯著高于T4和T1組(P<0.05)。T3組的血清ALP活性顯著高于T4和T1組(P<0.05),T2組顯著高于T1組(P<0.05)。T1組的血清AST活性最高,顯著高于其他各組(P<0.05),而T3組最低,顯著低于其他各組(P<0.05)。

表4 飼喂添加不同鐵源飼料8周的草魚(yú)的血清生化指標(biāo)

2.4 不同鐵源對(duì)草魚(yú)血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表5可知,T4和T3組的紅細(xì)胞數(shù)目和紅細(xì)胞比容顯著高于T2和T1組(P<0.05)。T4組的血紅蛋白濃度顯著高于其他各組(P<0.05),T3組顯著高于T1組(P<0.05)。T4組的平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量顯著高于T3和T1組(P<0.05),T2和T1組顯著高于T3組(P<0.05)。T2組的平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度顯著高于T3和T1組(P<0.05),T1、T4組顯著高于T3組(P<0.05)。T1組的紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)顯著高于T3組(P<0.05)。T1和T3組的血小板數(shù)目顯著高于T2和T4組(P<0.05),T4組顯著高于T2組(P<0.05)。T2和T4組的血小板比容顯著低于T1和T3組(P<0.05)。各組間的平均紅細(xì)胞體積、平均血小板體積和血小板分布寬度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 不同鐵源對(duì)草魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可見(jiàn),T1組肝臟切片出現(xiàn)空泡,部分細(xì)胞膜邊界模糊,細(xì)胞核偏移,T2、T3和T4組細(xì)胞完整,細(xì)胞排列緊密,分布均勻的細(xì)胞間邊界明顯,細(xì)胞核明顯且位于細(xì)胞中央。T1、T2、T3和T4組肝血竇中均含有大量清晰可見(jiàn)的紅細(xì)胞。

3 討 論

表5 飼喂添加不同鐵源飼料8周的草魚(yú)的血常規(guī)指標(biāo)

T3組的全魚(yú)鐵元素含量顯著高于T2組,T4組的全魚(yú)鐵元素含量有高于T2組的趨勢(shì),這表明氨基酸螯合鐵比無(wú)機(jī)鐵更容易被魚(yú)體吸收。這可能是因?yàn)闊o(wú)機(jī)鹽形式的鐵在魚(yú)的堿性中腸環(huán)境下溶解度較低,且鐵離子需要在輔酶的參與下和腸道內(nèi)的蛋白質(zhì)或氨基酸結(jié)合形成絡(luò)合物,才能被魚(yú)體吸收利用,而氨基酸螯合物可直接被機(jī)體吸收[5,32]。郭鑫偉等[5]在珍珠龍膽石斑魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn),相比于硫酸亞鐵,羥基蛋氨酸鰲合鐵和甘氨酸亞鐵更有利于魚(yú)體對(duì)鐵的蓄積。王二龍[18]報(bào)道,隨著飼料鐵元素含量的升高,斜帶石斑魚(yú)全魚(yú)和肝臟鐵元素含量呈先上升后平穩(wěn)趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示,T1組的全魚(yú)鐵元素含量顯著低于T2、T3和T4組。這都說(shuō)明適量的硫酸亞鐵和蛋氨酸螯合鐵對(duì)魚(yú)體的鐵蓄積有著一定的積極影響。

N:細(xì)胞核 nucleus;R:紅細(xì)胞 red blood cells;VS:空泡 vacuoles;SN:偏移的細(xì)胞核 shifted nucleus。

血清生化指標(biāo)和血常規(guī)指標(biāo)是評(píng)估魚(yú)類(lèi)健康的主要參考指標(biāo)[33]。血液中AST和ALT的活性是評(píng)定肝臟功能的關(guān)鍵指標(biāo),其活性受到機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)階段和健康的影響[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,T2、T3和T4組草魚(yú)的血清AST活性顯著低于T1組,說(shuō)明在飼料中添加一定量的鐵元素有利于草魚(yú)肝臟健康;而T3組的血清AST活性又顯著低于T2、T4組,說(shuō)明蛋氨酸螯合鐵比硫酸亞鐵更有利于草魚(yú)肝臟健康,肝臟組織學(xué)觀察結(jié)果也與此相符。血液中GLU的含量是判斷動(dòng)物機(jī)體能量代謝的重要指標(biāo),能夠體現(xiàn)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收狀況,當(dāng)機(jī)體合成代謝提高時(shí),血液中GLU的含量下降[35]。而本研究顯示,各補(bǔ)充鐵元素組草魚(yú)的血清GLU含量均顯著低于T1組,說(shuō)明在草魚(yú)飼料中補(bǔ)充適量的外源性鐵有利于機(jī)體進(jìn)行合成代謝。血清中ALB和TP的含量與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)[36]。前人研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加甘氨酸絡(luò)合鐵能有效提高肉羊血清中ALB和TP的含量,提高機(jī)體的免疫功能和蛋白質(zhì)的合成[37]。本研究結(jié)果表明,飼喂補(bǔ)充蛋氨酸螯合鐵飼料的草魚(yú)血清中TP和ALB的含量顯著高于T1組,說(shuō)明有機(jī)鐵有利于增強(qiáng)草魚(yú)的免疫功能。本試驗(yàn)中,T2和T3組的血清TCHO含量顯著高于T1組,有研究表明血清中TCHO、TG含量與血清鐵元素含量均呈正相關(guān)關(guān)系[38],說(shuō)明飼料中補(bǔ)充一定量的鐵元素可能導(dǎo)致血清鐵元素含量升高,從而導(dǎo)致血清TCHO、TG含量升高。ALP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶,對(duì)魚(yú)類(lèi)機(jī)體非特異性免疫至關(guān)重要,其活性是反映魚(yú)類(lèi)非特異性免疫能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[39]。本研究中T2和T3組草魚(yú)血清中ALP的活性顯著高于T1組,說(shuō)明飼料中補(bǔ)充一定量的無(wú)機(jī)鐵或有機(jī)鐵可能會(huì)增強(qiáng)草魚(yú)的非特異性免疫功能。

飼料中添加適量的鐵可以提高機(jī)體紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白濃度,減少水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物貧血癥的發(fā)生率,從而提升水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)效率,增加養(yǎng)殖效益[18]。Gatlin等[40]用精制飼料研究斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)對(duì)鐵的需求量時(shí)發(fā)現(xiàn),飼料缺鐵導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾的增重率、血細(xì)胞比容、血紅蛋白濃度、轉(zhuǎn)鐵蛋白氧飽和度和紅細(xì)胞數(shù)目下降。蘇傳福等[27]對(duì)草魚(yú)的研究顯示,隨著純化飼料中鐵元素含量的添加,草魚(yú)血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。而本研究中T4和T3組的紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞比容都顯著高于T1組,T2組的紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞比容與T1組雖無(wú)顯著差異,但在數(shù)值上也均高于T1組。除此之外,本試驗(yàn)中T4和T3組的紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞比容均高于T2組,說(shuō)明飼料中氨基酸螯合鐵的添加可以改善草魚(yú)血紅蛋白和紅細(xì)胞的生成,有效調(diào)節(jié)機(jī)體血液循環(huán)[41]。綜上所述,飼料中補(bǔ)充適量的鐵元素可以提高草魚(yú)的血液健康水平,且以蛋氨酸螯合鐵的效果更佳。

4 結(jié) 論

綜上所述,在本試驗(yàn)條件下,在實(shí)用膨化飼料中補(bǔ)充112 mg/kg(以鐵元素計(jì))蛋氨酸螯合鐵或硫酸亞鐵都有利于草魚(yú)健康,其中蛋氨酸螯合鐵更有利于草魚(yú)對(duì)鐵元素的利用,明顯提升血液健康水平,從而提高草魚(yú)的生長(zhǎng)性能和健康水平。