發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞營養(yǎng)物質表觀消化率、血清生化指標、腸道形態(tài)及盲腸微生物菌群的影響

王天麗 梁麗芬 賓石玉 何流琴 姚 婷 王晨昱 李鐵軍*

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室,長沙 410125;2.中國科學院大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學學院,北京 100049;3.廣西師范大學生命科學學院,珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室,桂林 541006;4.湖南師范大學生命科學學院,動物腸道功能調控湖南省重點實驗室,長沙 410081)

肉雞產(chǎn)業(yè)是我國畜禽養(yǎng)殖中集約化程度較高的產(chǎn)業(yè),其快速發(fā)展促使飼料需求量劇增,進而導致蛋白質飼料供給短缺問題日趨突出。糟渣,即農(nóng)副產(chǎn)品加工的廢棄物,具有含水量高、易黏結成團、物理形狀差異大、pH差異大、含有抗營養(yǎng)因子等特點[1];而經(jīng)微生物發(fā)酵處理后的糟渣,其適口性得到改善,營養(yǎng)水平和營養(yǎng)價值也得到提高[2]。研究發(fā)現(xiàn),將發(fā)酵后的糟渣應用于動物飼糧中,具有提高生長性能、改善腸道環(huán)境、提高消化吸收能力和免疫力、降低飼料成本及改善畜產(chǎn)品品質等功能作用[3-4]。羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是一種葫蘆科植物,主要種植于廣西、廣東、貴州等地,其中,廣西的羅漢果產(chǎn)量占全球的90%以上[5]。羅漢果經(jīng)提取利用后剩余大量果渣,有文獻報道[6],每個羅漢果的浸泡物的干重為2 g,但只能提取利用35%,而剩下的65%羅漢果渣只能當作農(nóng)業(yè)廢棄物處理,造成大量浪費。羅漢果渣的粗蛋白質(CP)含量與玉米秸稈相當,但其粗纖維(CF)含量較高,不利于動物的消化吸收,而使用微生物菌劑進行發(fā)酵,對其青貯品質和營養(yǎng)成分保留有一定的改善作用[7]。羅漢果苷是羅漢果的主要甜味成分,該物質可能通過影響瘤胃微生物數(shù)量以及消化酶活性,從而提高飼料利用率,促進動物生長[8]。此外,羅漢果苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌等有抑菌作用,它還可以調節(jié)腸道微生物菌群組成和短鏈脂肪酸合成[9]。目前,針對發(fā)酵羅漢果渣的營養(yǎng)價值及其在畜禽飼糧中的應用研究較少。因此,本研究通過代謝試驗,探討發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞營養(yǎng)物質表觀消化率、血清生化指標、腸道形態(tài)及盲腸微生物菌群的影響,為羅漢果渣發(fā)酵飼料在黃羽肉雞生產(chǎn)中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)酵羅漢果渣來源于桂林某生物科技有限公司。發(fā)酵底物分別為100%羅漢果渣原料和80%羅漢果渣原料+20%麩皮;所使用的酶制劑包含木聚糖酶、葡聚糖酶、酸性蛋白酶及堿性蛋白酶,菌種包含酵母菌、芽孢桿菌及乳酸菌。將各菌種、酶制劑與發(fā)酵底物混勻,30 ℃條件下發(fā)酵3 d。

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

選取15只90日齡中速型成年黃羽肉雞(公雞),按組間體重[(2.74±0.32) kg]一致原則分為3組,每組5個重復,每個重復1只雞。預試期3 d后,將所有試驗雞禁食48 h,采用強飼法進行代謝試驗,各組分別強飼羅漢果渣原料(Ⅰ組)、100%發(fā)酵羅漢果渣(Ⅱ組)和80%發(fā)酵羅漢果渣(Ⅲ組),每只試驗雞強飼50 g,并添加0.4%二氧化鈦(TiO2)。羅漢果渣發(fā)酵前后的營養(yǎng)水平見表1。

試驗雞單籠單只飼養(yǎng)于代謝籠中,自由飲水,并通過糞盤收集其48 h排泄物。清理糞便,將所得凈糞樣稱重后與10%鹽酸混勻,烘干,再稱重,接著粉碎、過篩,裝袋保存?zhèn)溆?。試驗在湖南省益陽市沅江市中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所石磯湖試驗雞舍內進行。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)水平及營養(yǎng)物質表觀消化率

取適量各組飼糧和糞樣,參照張麗英[10]的方法分別測定飼糧和糞樣中的干物質(DM)、CP、CF、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、TiO2含量及總能(GE),并計算營養(yǎng)物質表觀消化率,計算公式如下:

營養(yǎng)物質表觀消化率(%)=1-[(X1/X2)×
(Y2/Y1)]×100。

式中:X1為飼糧中TiO2含量(%);X2為糞便中TiO2含量(%);Y1為飼糧中該營養(yǎng)物質含量;Y2為糞便中該營養(yǎng)物質含量(%)。

1.3.2 血清生化指標

代謝試驗結束后,采集試驗雞血液樣本,收集到真空血管中。常溫靜置約45 min后,在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min,隨后將血清于-20 ℃中保存。采用全自動生化分析儀(Cobas C311,瑞士)和試劑盒(北京利德曼生物技術有限公司)測定血清生化指標。所測定的指標包括:總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、葡萄糖(glucose,GLU)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)含量及谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性。

1.3.3 腸道形態(tài)

采血結束后,將試驗雞致死,迅速剖開腹腔,分離出十二指腸、空腸和回腸,各腸段取1 cm組織樣,經(jīng)10%甲醛溶液快速固定。腸段樣品固定后,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,制成切片。在40倍顯微鏡下觀察,測量腸道的絨毛高度(villous height,VH)和隱窩深度(crypt depth,CD),并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.3.4 盲腸微生物菌群

收集試驗雞盲腸內容物,用于16S rRNA測序。使用試劑盒提取盲腸內容物總DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度及純度。選擇16S rRNA基因V3～V4區(qū)特異性引物對盲腸內容物進行PCR擴增,并純化其產(chǎn)物。建立一個測序文庫并對其進行質檢,通過Illumina NovaSeq 6000對質檢合格的文庫測序得到原始數(shù)據(jù),再經(jīng)堿基識別分析后轉化為原始測序序列。對原始測序序列進行質量過濾、雙端序列拼接和去除嵌合體后,得到有效數(shù)據(jù)。最后基于有效數(shù)據(jù),綜合運用多種數(shù)據(jù)分析方法(如物種分類學分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析等)對各組試驗雞的腸道微生物菌群進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2021進行初步處理后,采用SPSS 26.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法進行分析,并采用Duncan氏法進行多重比較。結果以平均值±標準差表示,P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

由表2可知,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的DM、CP、Ash、EE和GE表觀消化率均顯著提高(P<0.05),CF表觀消化率無顯著差異(P>0.05);Ⅲ組的EE表觀消化率顯著高于Ⅱ組(P<0.05)。其中,Ⅲ組的DM、CP、Ash、EE、CF和GE表觀消化率均最高。

2.2 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞血清生化指標的影響

由表3可知,各組之間血清生化指標無顯著差異(P>0.05)。

表3 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

表3 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞血清生化指標的影響

2.3 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

黃羽肉雞的十二指腸、空腸和回腸腸道形態(tài)見圖1。由表4可知,在十二指腸中,與Ⅰ組相比,Ⅱ組的VH和V/C顯著降低(P<0.05),CD顯著升高(P<0.05);Ⅲ組的VH和V/C顯著升高(P<0.05),CD無顯著差異(P>0.05)。在空腸中,與Ⅰ組相比,Ⅱ組的VH和V/C顯著升高(P<0.05),CD無顯著差異(P>0.05);Ⅲ組的VH和CD顯著升高(P<0.05),V/C無顯著差異(P>0.05)。在回腸中,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的VH均顯著升高(P<0.05),CD和V/C無顯著差異(P>0.05)。

表4 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞不同腸段腸道形態(tài)結構的影響

Ⅰ:Ⅰ組 group Ⅰ;Ⅱ:Ⅱ組 group Ⅱ; Ⅲ:Ⅲ組 group Ⅲ。下圖同 the same as below.

2.4 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞盲腸微生物菌群的影響

根據(jù)營養(yǎng)物質表觀消化率、血清生化指標以及腸道形態(tài)結果,判斷出80%發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞的影響較大,因此選用Ⅰ組和Ⅲ組進行盲腸微生物菌群分析。

2.4.1 盲腸微生物多樣性分析

由圖2-A可知,隨著樣品序列數(shù)的增加,稀釋性曲線逐漸趨于平緩,表明測序數(shù)據(jù)量充足。對黃羽肉雞盲腸微生物進行Alpha多樣性分析,由圖2-B可知,與Ⅰ組相比,Ⅲ組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著降低(P<0.05),而ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。Beta多樣性分析能夠比較不同樣品的微生物菌群構成差異,在主坐標分析(PCoA)中,距離越近的樣品,微生物菌群構成越相似。由圖2-C可知,主成分1和主成分2的貢獻值分別為26.42%和22.77%,且Ⅰ組與Ⅲ組的微生物菌群分布相對零散,微生物菌群構成差異明顯。

2.4.2 盲腸微生物組成、差異分析及功能預測

由圖3-A可知,在門水平上,對盲腸微生物相對豐度排行前10的菌群進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度總和達85%以上。與Ⅰ組相比,Ⅲ組的擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度分別提高了3.56%和21.87%。

由圖3-B可知,在屬水平上,相對豐度排列前10的菌屬分別是擬桿菌屬(Bacteroides)、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、丹毒絲菌科UCG-004(Erysipelotrichaceae_UCG-004)、uncultured_bacterium_o_Bacteroidales、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae、互養(yǎng)菌屬(Synergistes)和Candidatus_Vestibaculum。與Ⅰ組相比,Ⅲ組的丹毒絲菌科UCG-004相對豐度顯著提高(P<0.05),uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相對豐度顯著降低(P<0.05)。

利用線性判別分析效應量(LEfSe)分析比較Ⅰ組和Ⅲ組之間相對豐度具有顯著差異的微生物,由圖4可知,特異性微生物菌群共有19個。其中,在Ⅰ組中顯著富集的有12個,包括梭菌目(Clostridiales)、梭菌綱(Clostridia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)等;在Ⅲ組中顯著富集的有7個,包括丹毒絲菌科UCG-004、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)等。

對盲腸微生物菌群第3層級的KEGG功能差異預測,由圖5可知,與Ⅰ組相比,Ⅲ組的嘧啶代謝、嘌呤代謝、糖酵解/糖異生和氨基糖及核苷酸糖代謝通路豐度顯著升高(P<0.05)。

A:稀釋性曲線;B:Alpha多樣性分析;C:主坐標分析。

圖5 盲腸微生物菌群第3層級的KEGG功能差異預測

2.4.3 盲腸微生物相對豐度與營養(yǎng)物質表觀消化率相關性分析

將相對豐度前10的差異菌屬與營養(yǎng)物質表觀消化率進行相關性分析,由圖6可知,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相對豐度與CF、Ash、GE、DM和CP表觀消化率存在顯著的負相關(P<0.05),棲糞桿菌屬相對豐度與GE表觀消化率存在顯著的負相關(P<0.05),丹毒絲菌科UCG-004相對豐度與GE和DM表觀消化率存在顯著的正相關(P<0.05)。

圖6 盲腸微生物相對豐度與營養(yǎng)物質表觀消化率相關性分析

3 討 論

3.1 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

營養(yǎng)物質表觀消化率是評估肉雞對飼糧中營養(yǎng)物質消化吸收能力的重要指標[11]。有文獻報道,發(fā)酵后的飼料可以改善家禽的營養(yǎng)物質表觀消化率[12]。研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加2.5%發(fā)酵豆粕可提高蛋雛雞CP和Ash表觀消化率[13],發(fā)酵葡萄籽粕能顯著提高五龍鵝對CP、CF和EE的利用率[14]。與上述結果相似,本試驗結果顯示,發(fā)酵后的羅漢果渣均能提高黃羽肉雞的CP、DM、Ash、EE及GE表觀消化率,并且80%發(fā)酵羅漢果渣的6種營養(yǎng)物質表觀消化率都是最高的。較高CF含量的飼糧會降低營養(yǎng)物質表觀消化率[15]。在本試驗中,發(fā)酵后的羅漢果渣均能提高營養(yǎng)物質表觀消化率,這可能與發(fā)酵后的羅漢果渣CF含量降低有關。

3.2 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞血清生化指標的影響

血清生化指標是反映機體綜合代謝能力與健康狀況的重要指標。血清中TP含量可反映機體吸收飼料中蛋白質的情況及體液免疫情況,AST、ALT活性和UN含量可反映機體腎功能代謝情況,TG、TC、LDL-C和HDL-C含量可反映機體脂質代謝情況[16]。本試驗結果顯示,發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞血清生化指標無顯著影響,表明發(fā)酵羅漢果渣短期內不會對黃羽肉雞綜合代謝能力產(chǎn)生不利影響。

3.3 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

VH、CD及V/C是評估動物腸道健康狀況的關鍵指標[17]。VH反映了小腸與營養(yǎng)物質的接觸面積,小腸VH越高,則腸黏膜表面積越大,營養(yǎng)物質與腸道接觸越充分,越有利于營養(yǎng)物質的吸收利用[18];CD反映了細胞生成率,若CD變淺,則說明腸上皮細胞成熟率上升,吸收功能增強[19]。故一般情況下,VH增大,CD減小,V/C增大,消化吸收功能則增強。王國軍等[20]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加6%的益生菌發(fā)酵蘋果渣能夠顯著提高斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的VH以及十二指腸和空腸的V/C,顯著降低十二指腸和空腸的CD。在本試驗中,與羅漢果渣原料相比,100%發(fā)酵羅漢果渣顯著降低了十二指腸的VH和V/C,顯著升高了十二指腸的CD、回腸的VH以及空腸的VH、V/C;80%發(fā)酵羅漢果渣顯著升高了十二指腸、空腸和回腸的VH以及十二指腸的V/C,與前人研究結果相似。本試驗時間較短,故結合前人研究結果可推斷出,發(fā)酵后的羅漢果渣在短期內可改善肉雞的腸道形態(tài)結構,增強腸道消化吸收功能。這可能與羅漢果渣中的主要有效成分——羅漢果皂苷有關,羅漢果皂苷具有抗炎抗氧化作用和免疫作用[21]。

3.4 發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞盲腸微生物菌群的影響

腸道微生物菌群是胃腸道重要的一部分,在維持腸道形態(tài)、營養(yǎng)吸收和多種生理活動中發(fā)揮了重要作用[22]。Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)是判定微生物菌群多樣性的重要指標,Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)越大,Simpson指數(shù)越小,說明微生物物種越豐富[23]。本試驗中,Ⅲ組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著降低,說明發(fā)酵羅漢果渣可改變菌群多樣性,影響盲腸微生物區(qū)系,而根據(jù)PCoA結果,80%發(fā)酵羅漢果渣可使黃羽肉雞微生物菌群結構發(fā)生顯著差變化。其原因可能是,發(fā)酵菌劑中的有益菌和發(fā)酵羅漢果渣中的抗菌活性成分抑制了腸道中有害菌,從而改變了微生物區(qū)系。對于2組間盲腸微生物組成的研究結果表明,厚壁菌門和擬桿菌門是肉雞腸道中的優(yōu)勢菌門,這與其他學者的研究結果[24-25]一致。厚壁菌門多為纖維分解菌,本試驗結果顯示80%發(fā)酵羅漢果渣使黃羽肉雞盲腸厚壁菌門相對豐度升高,這可能是發(fā)酵后的羅漢果渣CF含量降低,繼而引起營養(yǎng)物質表觀消化率升高的原因;擬桿菌門直接參與腸道內能量物質(如糖類和脂類)的分解代謝[26],由此猜測80%發(fā)酵羅漢果渣使黃羽肉雞盲腸擬桿菌門相對豐度上升的原因之一,可能是發(fā)酵后的羅漢果渣能夠增強肉雞糖代謝。

本試驗中,在屬水平上,80%發(fā)酵羅漢果渣使丹毒絲菌科UCG-004相對豐度顯著升高,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相對豐度顯著降低;LEfSe分析結果也顯示,80%發(fā)酵羅漢果渣組中黃羽肉雞盲腸微生物的特異性微生物菌群主要為丹毒絲菌科、丹毒絲菌綱。有證據(jù)表明,丹毒絲菌科與宿主脂質代謝之間存在關聯(lián)[27],低脂飲食組和高脂飲食組的母雞腸道丹毒絲菌科相對豐度較高[28],飲食誘導肥胖的小鼠腸道丹毒絲菌科相對豐度增加[29]。而80%發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞脂質代謝的影響還有待進一步驗證。對盲腸微生物菌群KEGG功能差異預測分析結果顯示,80%發(fā)酵羅漢果渣通過改變微生物區(qū)系對黃羽肉雞嘧啶代謝、嘌呤代謝、糖酵解/糖異生和氨基糖及核苷酸糖代謝產(chǎn)生顯著影響,其原因除了前面提及的,還可能是盲腸微生物中厚壁菌門相對豐度增加;有文獻報道,厚壁菌門可以促進腸道中對糖分子的利用,從而帶動腸道內物質交換[30]。最后對盲腸微生物相對豐度與營養(yǎng)物質表觀消化率進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相對豐度與CF、Ash、GE、DM、CP表觀消化率均呈負相關,丹毒絲菌科UCG-004相對豐度與GE和DM相對豐度消化率呈正相關,這也解釋了飼喂發(fā)酵羅漢果渣后肉雞盲腸微生物屬水平上,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和丹毒絲菌科UCG-004相對豐度變化與營養(yǎng)物質表觀消化率變化的關系。由于試驗期較短,故以上影響均為短期內的,長期飼喂發(fā)酵羅漢果渣對黃羽肉雞腸道微生物菌群的影響還有待進一步研究。

4 結 論

與羅漢果渣原料和100%羅漢果渣原料直接發(fā)酵相比,按80%羅漢果渣原料+20%麩皮混合發(fā)酵在短期內可有效提高黃羽肉雞的營養(yǎng)物質表觀消化率,改善腸道形態(tài)結構,調節(jié)盲腸微生物菌群,改變菌群功能代謝通路。