化學合成類脲酶抑制劑種類及其作用機制研究進展

胡鈺峰 鄭 楠 王加啟 趙圣國

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193)

脲酶(又稱尿素酰胺水解酶,EC 3.5.1.5)是一種鎳依賴性的尿素水解酶,其廣泛存在于細菌、真菌、藻類和植物等多種生物中[1]。脲酶可以催化尿素水解得到氨和氨基甲酸酯,之后氨基甲酸酯會進一步分解得到氨和碳酸氫鹽[1-2],這些分解產(chǎn)物可以作為有機體生長發(fā)育使用的氮源。Jabri等[3]于1995年通過對產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)脲酶的晶體學結(jié)構(gòu)分析,得出了脲酶的第1個完整三維結(jié)構(gòu)。隨后,研究者們陸續(xù)探明了不同來源的脲酶結(jié)構(gòu),例如來自于巴氏芽孢桿菌(Bacilluspasteurii)[4]、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)[5]和刀豆(Canavaliaensiformis)[6]的脲酶。雖然各來源的脲酶含有的亞基數(shù)量不同,由其組成的四級結(jié)構(gòu)也有所差異,但是都會形成相似的三聚體結(jié)構(gòu)。大多數(shù)的細菌脲酶,例如產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶都是(αβγ)3型三聚體,其中每個α亞基含有1個活性位點,每個分子共含有3個活性位點[3-4];幽門螺旋桿菌脲酶則由4個三聚體(αβ)3形成球形結(jié)構(gòu)[(αβ)3]4,其中β亞基由產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶中發(fā)現(xiàn)的β亞基與γ亞基融合產(chǎn)生,故每個分子共有12個活性位點[5]。植物脲酶則通常形成(α3)2的二聚體結(jié)構(gòu),其中α亞基由相應(yīng)的細菌中αβγ融合而來,每個分子含有6個活性位點[6]。

脲酶在高效催化尿素水解的同時,也為我們的健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一系列負面影響。在醫(yī)學領(lǐng)域中,脲酶是引起幽門螺旋桿菌病變的主要原因,因為病原菌脲酶的水解產(chǎn)物可以中和胃酸,這有利于病原菌在胃腸道定植從而引起宿主胃腸道潰瘍。此外,脲酶在尿路感染、感染性結(jié)石、腎盂腎炎和肝性腦病等的發(fā)病機制中也起著重要作用[1]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中,反芻動物的瘤胃微生物可以利用尿素的水解產(chǎn)物合成自身微生物蛋白,所以在生產(chǎn)中飼喂尿素可以大大節(jié)省蛋白質(zhì)飼料成本。但是瘤胃微生物的脲酶活性過高,會使氨生成的速率過高,與瘤胃發(fā)酵釋放的能量不同步。這將導致氨不能及時被瘤胃微生物利用而吸收進入血液,降低了反芻動物對氮素的利用率,嚴重時還會引起動物氨中毒。這不僅會降低動物生產(chǎn)性能,還會對環(huán)境造成污染[7]。此外,在使用尿素施肥的過程中,由于土壤中微生物脲酶活性高,會釋放出大量的氨,這不僅會對植物的生長產(chǎn)生抑制作用,還會引起嚴重的環(huán)境問題[8]。

脲酶抑制劑可以降低脲酶分解尿素的活性,從而有利于解決由高脲酶活性引起的一系列威脅人體健康安全、污染生態(tài)環(huán)境及降低生產(chǎn)效率的問題。如何開發(fā)具有低毒、穩(wěn)定、有效特性的脲酶抑制劑一直是研究者們關(guān)注的重點方向。因此,本文分類別探討了近年來研究較多的化學合成類脲酶抑制劑及其作用機制,希望能為未來新型高效脲酶抑制劑的研發(fā)提供合理的依據(jù)和參考。

1 硫脲衍生物

硫脲及其衍生物具有廣泛的生物學活性,比如抗氧化性[9-10]、抗病毒性[11]、抗細菌與真菌活性[12-13]以及抗癌[14]與抗炎性[12]等。硫脲因具有抑制硝化細菌的作用,故最早在日本被當作一種土壤硝化抑制劑使用[15]。同時,有研究表明,硫脲對脲酶也具有一定的抑制作用[16],常被用作合成新型脲酶抑制劑的陽性對照。近年來,研究者們也對許多硫脲衍生物進行了深入的研究。

Hameed等[17]合成了一系列苯并呋喃連接的N-苯基氨基硫脲衍生物1,發(fā)現(xiàn)它們都具有不同程度的刀豆脲酶抑制活性[半抑制濃度(IC50)在(0.077±0.001) μmol/L～(24.04±0.14) μmol/L],且苯環(huán)上的硝基取代和鹵素衍生物能增強此類化合物的脲酶抑制活性(圖1)。此研究還發(fā)現(xiàn),結(jié)合中心的硫原子與2個催化鎳離子配位,并且可能通過與His492殘基形成的氫鍵來進一步穩(wěn)定這種結(jié)構(gòu)。Saeed等[18]在研究新型長鏈?；螂逖苌?時發(fā)現(xiàn)間位上的吸電子基團(如氯原子)可以提高這類化合物的生物活性,其中僅間位有1個氯原子取代的化合物1-(3-氯苯基)-3-十四烷?；螂寰哂凶罡叩囊种苹钚訹IC50=(0.039 1±0.002 8) μmol/L,且是一種非競爭性抑制劑[抑制常數(shù)(Ki)為0.021 μmol/L](圖1)。該研究還發(fā)現(xiàn),這些新型合成化合物由于肝毒性和皮膚敏感性較小,因此具有良好的開發(fā)潛力。

IC50:半抑制濃度。下圖同。IC50: 50% inhibiting concentration. The same as below.

阿替洛爾是一種治療心血管疾病的特效藥物,Wahid等[19]利用生物定向藥物合成(biology-oriented drug synthesis,BIODS)方法,合成了23種阿替洛爾硫脲衍生物,發(fā)現(xiàn)其中大部分化合物的脲酶抑制活性都高于阿替洛爾,個別化合物的抑制活性高于硫脲。該研究還指出,這類化合物芳基上取代基的種類和位置對其脲酶抑制活性起重要作用;例如,對位氯取代化合物的抑制活性強于其他取代方式,間溴取代明顯強于鄰溴取代,且當“R”取代基為吸電子基團時,化合物擁有更高的脲酶抑制活性。

Yaqoob等[20]篩選出了一系列由烷基鏈連接的硫脲衍生物,發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)上有4′-溴取代的化合物擁有更高的脲酶抑制活性,且該化合物以競爭方式抑制脲酶活性;此化合物能與脲酶Arg439和Ala440殘基形成氫鍵,從而很好地與脲酶結(jié)合發(fā)揮抑制作用,并且不會引起脲酶的構(gòu)象變化。

2 羥肟酸衍生物

眾所周知,羥肟酸類化合物可以與多種過渡金屬形成強力復合物,故當其與酶活性位點的金屬離子結(jié)合后,便可以使其喪失活性。因此,研究者們研究并合成了一系列以羥肟酸為基礎(chǔ)的酶抑制劑,例如脲酶抑制劑[21]和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑[22]。乙酰氧肟酸是其中研究的最多并且是唯一獲得美國食品和藥物管理局批準上市的脲酶抑制劑。然而,由于其發(fā)揮中等抑制活性就需要相當大的劑量(成人約1 000 mg/d),且具有一定的副作用[23],因此迫切需要探尋既具有高抑制活性又安全的化合物作為新型脲酶抑制劑。Xiao等[24]設(shè)計出了一種基于類黃酮類化合物環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脲酶抑制劑衍生物3(圖2),發(fā)現(xiàn)苯環(huán)上的氯取代是最合適的一種取代方式,因為疏水區(qū)域可能無法容納更大的疏水基團,且苯環(huán)上任何位置的親水基團都不利于其抑制活性。

Shi等[25]后續(xù)將水楊酸中苯甲酸部分、黃酮類三環(huán)結(jié)構(gòu)以及羥肟酸結(jié)合起來,合成了一系列新的衍生物4,且所得化合物大多具有一定的脲酶抑制活性。該試驗指出,化合物中羥肟酸部分的N-甲基結(jié)構(gòu)有可能會影響其與靶點的結(jié)合,不利于其抑制作用;而在苯基部分,鄰位的羥基基團可以略微增加其活性,且引入芐氧基作為羥基的保護基團可以進一步增強其活性,這證實了水楊酸結(jié)構(gòu)有利于增強脲酶抑制活性(圖2)。此外,分子對接研究表明,NHO—結(jié)構(gòu)中的氧原子以雙齒方式與2個鎳離子配位,并與His221形成氫鍵。NHO—中的氫原子則分別與Asp362的COO—和Ala365的CO—建立3個氫鍵。同時,該試驗還首次指出了幽門螺旋桿菌脲酶及其他脲酶的底物抑制作用,即尿素濃度在大于4 mmol/L時會出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。

圖2 羥肟酸衍生物及其代表抑制劑

3 磷酰胺和磺酰胺衍生物

磺胺類藥物是世界上使用最廣泛的抗菌劑之一,這主要是由于這類藥物具有低成本、低毒性以及對常見細菌性疾病具有優(yōu)異療效的特點[26]。N-酰基磺酰胺是一種存在于目前許多治療藥物中的官能團,其具有良好的生物學活性[27]。此外,有研究表明在各種合成的脲酶抑制劑中,單磷酰胺衍生物是最有效的一類,但由于它們在水中不穩(wěn)定,所以研究者們對其關(guān)注較少[28]。

Arshia等[29]合成了一系列磺胺衍生物5,這類化合物在其二苯甲酮部分是否具有羥基對其脲酶抑制活性具有重要影響。此外,在烷基/芳基磺?；糠值牟煌〈部蓪е虏煌潭鹊幕钚宰兓?圖3)。以活性最高的化合物N′-[(4′-羥基苯基)(苯基)亞甲基]-4″-硝基苯磺酰肼為例,該化合物二苯甲酮4′位上的羥基和芳基磺?；?″位上的硝基對其抑制活性起重要作用,若將硝基轉(zhuǎn)移到3″位,得到的新化合物活性有所降低。若將羥基移除,此時無論將硝基置于芳基磺?；魏挝恢?所得的化合物都不具有抑制活性。Saeed等[30]將磺胺核引入2-亞氨基噻唑啉并合成了一系列化合物6,發(fā)現(xiàn)這類化合物中的亞氨基噻唑啉-磺酰胺核在抑制脲酶活性過程中起著非常重要的作用。側(cè)鏈苯環(huán)上的取代基變化會引起相應(yīng)化合物活性的增減,例如側(cè)鏈苯環(huán)上如果是雙取代,則具有比單取代更高的脲酶抑制活性,在3′和4′取代會比在2′取代更能增強其抑制活性(圖3)。

Gholivand等[28]篩選了一系列雙磷酰胺衍生物7并與單磷酰胺、硫脲和乙酰氧肟酸的脲酶抑制活性進行了比較,發(fā)現(xiàn)含有芳香胺及其取代的衍生物具有更高的脲酶抑制活性(圖3)。同時,具有P=O官能團的衍生物比具有P=S官能團的衍生物具有更高的抗脲酶活性。分子對接研究發(fā)現(xiàn),此類衍生物對脲酶的抑制類型屬于混合性抑制,它們通過氫鍵、疏水性及π相互作用與結(jié)合口袋入口處和內(nèi)部的關(guān)鍵殘基相連,但并未直接與鎳離子相連,而是與活性位點其他殘基結(jié)合使其占據(jù)整個結(jié)合口袋,從而獲得了良好的抑制活性。

圖3 磷酰胺和磺胺衍生物及其代表抑制劑

4 黃酮衍生物

黃酮類化合物是一類存在于植物界中的天然酚類化合物,因具有廣泛的生物學活性而備受關(guān)注[31]。此前已有研究證實,此類化合物(如槲皮素和兒茶素等)是有效的脲酶抑制劑[32-33]。Liu等[34]合成了一系列新的黃酮衍生物8,這些化合物均具有很好的脲酶抑制活性,可達參比抑制劑硫脲[IC50=(21.902±0.696) μmol/L]活性的10倍以上。研究發(fā)現(xiàn),在B環(huán)結(jié)構(gòu)部分的氫原子被同樣大小的吸電子鹵素(—F、—Cl、—Br)取代時,其脲酶抑制活性會得到增強,若氫原子被更大的吸電子基團(—NO2)或供電子基團(—CH3或—OCH3)取代,其抑制活性會減弱(圖4)。這表明脲酶的活性口袋部分可能無法容納較大體積的B環(huán)結(jié)構(gòu),同時還發(fā)現(xiàn)苯環(huán)是B環(huán)部分的最佳結(jié)構(gòu)形式。

圖4 黃酮衍生物及其代表抑制劑

桑色素是一種從?？浦参镏刑崛〕鰜淼狞S酮類化合物,具有廣泛的藥理作用,如抗氧化、抗病毒、抗菌和抗炎等[35]。Kataria等[36]合成了13種桑色素衍生物,所有合成的化合物均具有良好的抗氧化性和脲酶抑制活性,且當在該類化合物中引入芳基硫脲基團或溴取代的芳基硫脲時,其脲酶抑制活性得到增強。動力學和分子對接研究指出,這類化合物的抑制作用是非競爭性的,它們通過氫鍵、π-π堆積和疏水相互作用牢固地結(jié)合在催化腔內(nèi),其中氫鍵的作用最為主要。

Biglar等[37]采用了一種基于表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)的新型傳感器技術(shù),從40種中草藥提取物中篩選出了與脲酶具有較高親和性的月桂葉提取物,并對其活性化合物槲皮素進行了分離和蛋白質(zhì)-配體對接研究。結(jié)果表明,槲皮素能進入脲酶活性位點裂隙,其鄰苯二酚環(huán)上的羥基易與酶活性中心的2個鎳離子相互作用,而芳香環(huán)則與Ala440、His593和Ala636殘基相互作用。此外,槲皮素能與脲酶各氨基酸殘基形成5個氫鍵,從而加強了其與脲酶緊密結(jié)合的能力。

5 香豆素衍生物

香豆素是一類植物合成的次生代謝產(chǎn)物,廣泛分布于天然植物中。香豆素及其衍生物具有多種生物活性,如抗病毒、抗氧化和抗菌等活性[38]。因此,它們在農(nóng)藥和醫(yī)藥領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。Khan等[39]在研究雙香豆素衍生物時發(fā)現(xiàn),該類化合物中2個內(nèi)酯環(huán)上的2個羥基可能僅與抑制活性有關(guān),并可能是與脲酶的鎳離子配位;在C-11上存在的任何取代基都會降低其抑制活性,這可能是因為其他取代基(如烷基)的空間位阻會影響其與鎳離子的結(jié)合。

Rashid等[40]報道了一系列4-羥基香豆素衍生物,發(fā)現(xiàn)這類化合物的脲酶抑制活性取決于其主結(jié)構(gòu)上的取代模式,例如在苯環(huán)上擁有供電子基團能增強其脲酶抑制活性;同時,增加烷基鏈的長度也能增強其活性,但若是引入了額外的環(huán)狀結(jié)構(gòu),則會大幅減弱其活性;此外,對該系列中活性最高的化合物3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-(4-羥基香豆素)的分子對接研究表明,其甲氧基上的氧與2個鎳原子形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),能與活性位點緊密結(jié)合,從而使得其具有最高的抑制活性。

6 吲哚衍生物

吲哚是一種廣泛存在于自然界中的天然化合物,因其生物活性而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[41]。Taha等[42]合成了一系列新的羥吲哚衍生物,并測定了其脲酶抑制活性,發(fā)現(xiàn)這些合成的化合物大多都擁有有效脲酶抑制活性;該研究還表明,范德華力和氫鍵有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定;分子對接研究顯示,鎳離子(Ni2+)、KCX219、Asp362、His248、Asp223、Arg338、Glu254、Glu222、His322、His274、Met366、Cys321、Thr254、Ala169、His221、Gly279、Gly280和Ala365是參與配體與蛋白質(zhì)相互作用的重要殘基,它們可能在先導物優(yōu)化中發(fā)揮重要作用,從而有助于增強配體與蛋白質(zhì)的親和力。

Yang等[43]報道了一系列新型的氧代吲哚啉衍生物9,并測定了其對脲酶的抑制活性以及抗菌活性;該試驗指出,供電子基團的取代或酰肼結(jié)構(gòu)的引入更有利于增加抑制活性(圖5);同時,合成的化合物具有低細胞毒性以及良好的成藥潛力。Taha等[44]評估了一系列二吲哚甲烷衍生物10,發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)的活性受取代基性質(zhì)、位置和數(shù)量影響較大,例如苯環(huán)上的吸電子取代基團將提升其抑制活性(圖5);對N-(5-{4-[雙(5-溴-1氫-吲哚-3-基)甲基]苯基}-1,3,4-噻二唑-2-基)-2,4-二硝基苯磺酰胺的分子對接研究表明,其鄰位和對位的硝基分別與殘基Arg336、Val367形成了2個強力的氫鍵,使其獲得了優(yōu)秀的脲酶抑制活性。

圖5 吲哚衍生物及其代表抑制劑

7 金屬配合物

席夫堿是一種含有亞胺基團的化合物,其C=N雙鍵可以和一些金屬離子形成穩(wěn)定的配合物,許多席夫堿配合物具有抗菌、抗腫瘤以及抗炎等生物活性,因此在醫(yī)藥和化學等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[45]。Chen等[46]報道了6種席夫堿過渡金屬配合物的合成和對刀豆脲酶的抑制活性,通過比較金屬配合物和相應(yīng)金屬離子的脲酶抑制活性發(fā)現(xiàn),此類物質(zhì)的活性不僅取決于中心金屬離子,還取決于有機配體;且配合物與脲酶氨基酸殘基形成的氫鍵和疏水作用對其抑制活性起重要作用。You等[47]合成了2個硫氰酸鹽配位的席夫堿銅(Ⅱ)配合物,并對其進行了結(jié)構(gòu)表征和脲酶抑制活性的評估,發(fā)現(xiàn)其脲酶抑制活性可能取決于銅原子的幾何配位和席夫堿結(jié)構(gòu)上的取代基團。Cui等[48]合成了一種席夫堿銅(Ⅱ)配合物并測定了其對幽門螺旋桿菌脲酶的抑制活性,發(fā)現(xiàn)該化合物的氧原子能與脲酶蛋白Phe218上的羥基形成氫鍵,同時此化合物可與脲酶的Leu196和Ile220產(chǎn)生疏水相互作用,這可能是其擁有有效脲酶抑制活性的原因。

Saleem等[49]設(shè)計合成了幾種基于氨基硫脲和氨基甲酰肼配體的金屬絡(luò)合物,并通過試驗發(fā)現(xiàn)其與銅、鈷和鈀的絡(luò)合物能增強脲酶抑制活性;研究顯示,絡(luò)合物3a(原文獻中編號)的羰基氧原子可以和Arg605形成氫鍵,同時2個氨基也能和Asp490分別形成1個氫鍵,這3個氫鍵使得金屬絡(luò)合物得以在脲酶的活性位點穩(wěn)定結(jié)合,表現(xiàn)出優(yōu)秀的脲酶抑制活性。

表1根據(jù)搜集的文獻對不同類型的脲酶抑制劑進行了匯總,因為不同的研究中所研究的對象常不相同,故研究者們通過設(shè)定相同的試驗條件,將標準脲酶抑制劑作為參考對象,就能判定所合成脲酶抑制劑抑制效果的強弱。

表1 脲酶抑制劑分類

8 小結(jié)與展望

乙酰氧肟酸是目前唯一獲批準使用的藥用脲酶抑制劑,但存在副作用大且性質(zhì)不穩(wěn)定的情況。磷酰胺類化合物是一種抑制效果良好的脲酶抑制劑,但由于穩(wěn)定性較差,無法應(yīng)用于臨床。目前還有一些新型抑制劑如席夫堿類化合物,但這些化合物的開發(fā)仍不夠成熟,對細菌脲酶的抑制效果研究也較少,需要更深入的研究。雖然已經(jīng)合成了很多具有良好開發(fā)潛力的脲酶抑制劑,可以作為未來脲酶抑制劑開發(fā)的先導化合物,但它們目前仍處于研究階段,需要進一步的試驗以驗證其在實踐中的應(yīng)用效果。未來脲酶抑制劑的開發(fā)可以從有效地抑制基團組合、已有化合物的結(jié)構(gòu)改良或篩選新的有效結(jié)構(gòu)或基團等方面著手。此外,一些植物天然產(chǎn)物化合物也具有良好的脲酶抑制活性,開發(fā)應(yīng)用潛力巨大,值得進行深入的研究。

續(xù)表1分類Classifications代表抑制劑Representative inhibitors抑制類型Inhibition types抑制常數(shù)Ki半抑制濃度IC50抑制對象Inhibition objects參比抑制劑Reference inhibitors重要基團Important groups參考文獻Refer-ences金屬配合物Metal complexes化合物1(原文獻中編號)0.52 μmol/L刀豆脲酶乙酰氧肟酸(IC50=42.12 μmol/L)銅(Ⅱ),配體基團[46]化合物4(原文獻中編號)0.46 μmol/L刀豆脲酶乙酰氧肟酸(IC50=42.12 μmol/L)銅(Ⅱ),配體基團[46]化合物1(原文獻中編號)(0.968±0.012) μmol/L刀豆脲酶乙酰氧肟酸[IC50=(36.13±0.20) μmol/L]銅(Ⅱ),配體上的溴取代[47]雙(正丁基水楊基二胺)銅(Ⅱ)(0.95±0.04) μmol/L幽門螺旋桿菌脲酶乙酰氧肟酸[IC50=(42.47±0.19) μmol/L]銅(Ⅱ),氧原子[48]化合物3a(原文獻中編號)混合性5 μmol/L(2.63±0.41) μmol/L刀豆脲酶硫脲[IC50=(20.70±0.45) μmol/L)銅(Ⅱ),羰基,氨基[49]化合物5a(原文獻中編號)競爭性3.6 μmol/L(4.11±0.83) μmol/L銅(Ⅱ)