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    清熱養(yǎng)陰除濕丸對痛風(fēng)大鼠炎癥因子及關(guān)節(jié)功能的影響

    2023-11-09 06:04:34碩,溫
    陜西中醫(yī) 2023年11期
    關(guān)鍵詞:養(yǎng)陰秋水仙堿滑膜

    張 碩,溫 博

    (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京100010)

    痛風(fēng)是一種代謝性疾病,主要由于體內(nèi)尿酸生成過多或排泄障礙導(dǎo)致尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)和軟組織中,導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石形成[1]。痛風(fēng)在全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高,造成較高的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。痛風(fēng)發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,炎癥反應(yīng)是最關(guān)鍵的調(diào)控機(jī)制之一[2],關(guān)鍵炎癥調(diào)節(jié)因子包括半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等。這些因子過度產(chǎn)生和活化會進(jìn)一步加劇關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng),誘發(fā)關(guān)節(jié)組織損傷、病理改變[3-4]。NLRP3炎癥小體是一個多蛋白復(fù)合物,由NOD樣受體蛋白3(NOD like receptor protein 3,NLRP3)、ASC適配蛋白、Caspase-1組成[5]。當(dāng)尿酸結(jié)晶或其他炎癥刺激物存在時,NLRP3炎癥小體被激活并形成,進(jìn)而促進(jìn)Caspase-1活化和IL-1β產(chǎn)生。IL-1β作為重要的炎癥細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展,參與細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞遷移等過程[6]。清熱養(yǎng)陰除濕丸是我院經(jīng)典的院內(nèi)制劑,主要包括白花蛇舌草、虎杖、白鮮皮、金銀花、連翹、土茯苓、防己、牡丹皮、赤芍等,常用于治療濕熱病癥,如濕熱痛風(fēng)[7]。中醫(yī)理論認(rèn)為,濕熱是濕邪與熱邪結(jié)合造成的病理狀態(tài),清熱養(yǎng)陰除濕丸通過清熱解毒、養(yǎng)陰涼血、除濕等改善痛風(fēng)癥狀[8]。然而,關(guān)于清熱養(yǎng)陰除濕丸抗痛風(fēng)效應(yīng)的具體靶點尚不明確。本研究旨在探討清熱養(yǎng)陰除濕丸對痛風(fēng)的治療機(jī)制,著重觀察其對NLRP3炎癥小體的影響,為臨床深入理解痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及清熱養(yǎng)陰除濕丸的科學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物:50只6~8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重180~210 g,實驗動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(滬)2008-0016]。實驗環(huán)境溫度20~23 ℃、濕度50%~65%,每日12 h光暗周期,自由采食、飲水。動物飼養(yǎng)以及實驗均符合首都醫(yī)科大學(xué)倫理規(guī)定,倫理批準(zhǔn)號2020A112。

    1.1.2 主要試劑:尿酸鈉(批號BCBW1849,美國Sigma公司);秋水仙堿(批號H53021389,昆藥集團(tuán)股份有限公司);清熱養(yǎng)陰除濕丸(批號Z20053306,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院)。一抗NLRP3(貨號15101)、Caspase-1(貨號24232)、IL-1β(貨號12703)、LC3B(貨號3868)、p62(貨號48768)、PHB2(貨號E1Z5A)、GAPDH(貨號92310)均購于Cell Signaling Technology公司。

    1.1.3 主要儀器:脫水機(jī)(型號Donatello,泰普生物科學(xué)有限公司);包埋機(jī)(型號JB-P5,武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(jī)(型號 RM2016,上海徠卡儀器有限公司);酶標(biāo)檢測儀(型號Epoch,美國Bio TeK公司);熒光定量PCR儀(型號CFX,美國 Bio-rad 公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 改良Coderre 法構(gòu)建痛風(fēng)模型:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。大鼠分籠飼養(yǎng),每籠至多5只大鼠。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠分為空白組、模型組、秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組、清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組。空白組:麻醉成功后,將6號注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°~40°方向插入至關(guān)節(jié)腔,向大鼠右踝關(guān)節(jié)注入0.9%氯化鈉溶液50 μl,連續(xù)注射3 d;其余四組大鼠均采用改良Coderre 法構(gòu)建痛風(fēng)大鼠模型,手術(shù)操作同前,但向大鼠右踝關(guān)節(jié)注入50 μl濃度為25 g/L尿酸鈉混懸液。

    1.2.2 干預(yù)方法:造模完成后,進(jìn)行藥物干預(yù)治療??瞻捉M、模型組大鼠每日灌胃0.9%氯化鈉溶液5 ml;秋水仙堿組大鼠按6×10-4g/kg灌胃秋水仙堿混懸液,5 ml/次,2次/d,連續(xù)灌胃7 d;清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組和高劑量組分別按3.2、6.4 g/kg標(biāo)準(zhǔn)給大鼠灌胃清熱養(yǎng)陰除濕丸混懸液,5 ml/次,2次/d,連續(xù)灌胃7 d。

    1.2.3 關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)及步態(tài)評分:參照沈瑞明等[9]方法對大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、步態(tài)評分進(jìn)行評估。踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù):造模前、造模后48、72 h,采用縛線法測量右踝關(guān)節(jié)同一部位周徑;踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=[(造模后/造模前)右踝關(guān)節(jié)周徑]×100%。步態(tài)評分:分別于造模后48、72 h觀察大鼠步態(tài)、行為表現(xiàn)確定步態(tài)評分;0分為雙足正常行走,1分為輕度跛行且右下肢可著地但略帶彎曲;2分為中度跛行且右下肢可著地但立刻收回;3分為重度跛行且右下肢不能著地。

    1.2.4 HE染色:大鼠滑膜組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,梯度濃度乙醇脫水,石蠟包埋。將組織塊切成5 μm厚片,依次進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、乙醇脫水,再經(jīng)二甲苯透明,滴加樹膠、封片,光鏡下觀察滑膜組織病理改變。

    1.2.5 ELISA檢測:處死大鼠后取無菌腹主動脈血,采用高靈敏度ELISA試劑盒檢測大鼠外周血中IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α含量。在試劑盒孔板中加入100 μl血清,孵育和洗滌后加入按1∶100稀釋后的IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α;洗滌后每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素(1∶100);洗滌后每孔加100 μl生色底物TMB,暗室中孵育10 min,每孔加100 μl終止液;用酶標(biāo)儀檢測450、570 nm的OD值。

    1.2.6 RT-qPCR檢測:使用Trizol試劑分離,提取靜脈血總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,檢測相應(yīng)目的基因表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min,循環(huán)40次(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s),以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達(dá)量?;蛞镄蛄?見表1。

    表1 引物序列

    1.2.7 Western blotting檢測:將大鼠滑膜組織置于冰上加入裂解液進(jìn)行裂解,提取總蛋白并定量。以40 μg蛋白/孔的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳,電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用牛血清白蛋白溶液封閉,與抗NLRP3、Caspase-1、IL-1β、LC3B、p62、PHB2的一抗共同孵育,在4 ℃條件下孵育過夜;用TBST洗膜3次,與二抗孵育1 h后,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)檢測蛋白印跡。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗獨立重復(fù)至少3次,采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)及步態(tài)評分比較 見表2。注射單鈉尿酸鹽后,模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯,踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)及步態(tài)指數(shù)升高,部分出現(xiàn)三足步態(tài),表明模型構(gòu)建成功。干預(yù)后,秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、步態(tài)指數(shù)均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、步態(tài)評分比較

    2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)比較 見圖1??瞻捉M大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)正常,滑膜細(xì)胞排列緊密,未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織顯著增厚,細(xì)胞密度增加,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤,主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集,滑膜表面可觀察到尿酸晶體沉積,即痛風(fēng)石形成。秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變相對減輕,滑膜組織厚度略有降低,部分炎癥細(xì)胞浸潤減少,但仍存在滑膜表面尿酸晶體沉積。清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變明顯減輕,滑膜組織厚度逐漸恢復(fù)正常,炎癥細(xì)胞浸潤減少,滑膜表面的尿酸晶體沉積減少。

    A:空白組;B:模型組;C:秋水仙堿組;D:清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組;E:清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組

    2.3 各組大鼠外周血炎癥因子比較 見表3。模型組大鼠外周血IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α均高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后,秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組大鼠外周血IL-1β,IL-18、IL-33、TNF-α均低于模型組,且清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組的抑制效應(yīng)最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 各組大鼠外周血炎癥因子比較(pg/ml)

    2.4 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較 見表4(圖2)。Western blotting檢測結(jié)果顯示,模型組大鼠滑膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達(dá)均高于空白組;秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組大鼠滑膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表4 各組大鼠滑膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較

    2.5 各組大鼠滑膜組織線粒體自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)比較 見表5(圖3)。模型組大鼠滑膜組織中LC3B、p62、PHB2蛋白表達(dá)均高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后,秋水仙堿組、清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組、清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組大鼠滑膜組織中LC3B、p62、PHB2蛋白表達(dá)均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    A:空白組;B:模型組;C:秋水仙堿組;D:清熱養(yǎng)陰除濕低劑量組;E:清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組

    表5 各組大鼠滑膜組織線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

    3 討 論

    中藥抗炎治療痛風(fēng)的理念源自整體觀念、辨證施治原則。中醫(yī)認(rèn)為,痛風(fēng)是由于體內(nèi)濕熱郁閉,氣血運行不暢,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),尿酸晶體沉積在關(guān)節(jié)和組織中。因此,清熱、養(yǎng)陰、除濕法,平衡體內(nèi)陰陽氣血,消除痛風(fēng)發(fā)作原因,達(dá)到治療疾病的目的。清熱養(yǎng)陰除濕丸中金銀花、連翹、半枝蓮等具有清熱解毒、祛濕利尿作用,可改善患者體內(nèi)濕熱病理狀態(tài);土茯苓則有利尿作用,促進(jìn)尿酸排泄,降低體內(nèi)尿酸積聚。前期研究顯示,清熱養(yǎng)陰除濕丸通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性、免疫因子產(chǎn)生,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,減輕痛風(fēng)引起的炎癥反應(yīng)[10]。

    病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織顯著增厚,細(xì)胞密度增加,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤,滑膜表面可以觀察到尿酸晶體沉積,而清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變較輕,滑膜組織厚度逐漸恢復(fù)正常,炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少,滑膜表面尿酸晶體沉積減少,說明清熱養(yǎng)陰除濕丸能有效逆轉(zhuǎn)痛風(fēng)大鼠滑膜組織病理變化。清熱養(yǎng)陰除濕丸中的白花蛇舌草、虎杖、白鮮皮組分具有抗炎作用,能夠抑制炎癥細(xì)胞激活和炎癥因子釋放,減少炎癥細(xì)胞在滑膜組織中的浸潤[11-12];土茯苓、防己、牡丹皮等對尿酸晶體的形成和沉積具有積極影響,通過降低體內(nèi)尿酸水平,減少尿酸晶體形成,改善尿酸晶體引起的炎癥反應(yīng)[13-14];生地黃、當(dāng)歸、桂枝有助于促進(jìn)滑膜組織修復(fù)和再生,改善滑膜組織的細(xì)胞密度和結(jié)構(gòu),使其逐漸恢復(fù)正常[15-16]。ELISA檢測顯示,經(jīng)清熱養(yǎng)陰除濕丸干預(yù)后,大鼠外周血相關(guān)炎癥因子水平下降。有研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草通過抑制核因子-κB(NF-κB)活性降低炎癥因子表達(dá)。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[17]。清熱養(yǎng)陰除濕丸的部分成分可調(diào)節(jié)NF-κB活性,抑制炎癥因子表達(dá)?;⒄饶軌蛘{(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性,抑制其產(chǎn)生炎癥因子[18]。

    NLRP3炎癥小體是痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,當(dāng)體內(nèi)尿酸結(jié)晶沉積后,會引起炎癥細(xì)胞激活,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體組裝和激活。激活的NLRP3炎癥小體會引發(fā)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的產(chǎn)生,加劇痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[19]。線粒體自噬是細(xì)胞內(nèi)線粒體選擇性降解過程,具有清除受損線粒體和維持細(xì)胞能量代謝的作用。在痛風(fēng)發(fā)病過程中,尿酸結(jié)晶的沉積會導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重,線粒體功能障礙[20]。線粒體自噬的活化可以清除受損線粒體,減少氧化應(yīng)激和炎癥因子產(chǎn)生。有研究表明,線粒體自噬功能障礙與痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[21]。通過促進(jìn)線粒體自噬活化,減少尿酸結(jié)晶引起的炎癥反應(yīng),緩解痛風(fēng)臨床癥狀[22-24]。本研究通過RT-qPCR、Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),與模型組相比,清熱養(yǎng)陰除濕高劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、LC3B、p62及PHB2的蛋白相對表達(dá)水平降低,說明清熱養(yǎng)陰除濕丸能促進(jìn)線粒體自噬,抑制NLRP3炎癥小體激活。

    綜上所述,清熱養(yǎng)陰除濕丸通過抑制NLRP3炎癥小體形成及線粒體相關(guān)自噬的發(fā)生減輕痛風(fēng)大鼠滑膜組織炎癥,改善關(guān)節(jié)功能。

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