土貝母皂苷甲對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的影響

宋鐵兵,李康樂(lè),馬 強(qiáng),趙穎林,趙 軍,謝 娟

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710021;2.西安大興醫(yī)院渭水園院區(qū),陜西 西安 710018)

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤,2018年全球新增病例約289萬(wàn)例,死亡62.6萬(wàn)人[1-2]。中醫(yī)稱乳腺癌為乳巖,發(fā)病原因?yàn)榍橹臼д{(diào)、飲食失節(jié)、沖任不調(diào),患者在氣血虧虛的同時(shí)感受毒邪之氣,阻塞經(jīng)絡(luò),造成氣滯血瘀,日久痰核凝結(jié),形成乳巖。目前,乳腺癌的治療主要依靠手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌和抗體治療[3]。三陰性乳腺癌占乳腺癌15%,由于治療方案有限,該型患者轉(zhuǎn)移率高,預(yù)后極差[4]。據(jù)清代趙學(xué)敏所編的《本草綱目拾遺》記載,古代有很多醫(yī)家單獨(dú)使用土貝母的塊莖來(lái)治療婦人乳癰、乳巖、癰疽及諸郁之癥,現(xiàn)仍被廣泛應(yīng)用[5]。中藥土貝母味苦,性微寒,歸肺、脾經(jīng),有散結(jié)消毒、散癰腫的功效。近些年來(lái)大量研究表明,土貝母皂苷甲(Tubeimoside I,TBMS Ⅰ)是土貝母的主要活性成分,具有廣泛抗腫瘤活性[6]。

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(Early growth response 1,Egr1)是Egr轉(zhuǎn)錄因子家族成員,具有高度保守的GC的含量啟動(dòng)子結(jié)合,Egr1受到多種細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、DNA損傷因子、其他壓力刺激,Egr1具有多種功能,可直接調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程包括生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期阻滯、分化、凋亡、癌癥等[7]。Egr1在細(xì)胞中被抑制后,300多個(gè)基因受到影響,包括轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子、結(jié)構(gòu)蛋白[8]。p21是位于Egr1下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子,由于p21通過(guò)短暫或永久地誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯來(lái)抑制癌細(xì)胞增殖,被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制劑,另外p21還能促進(jìn)細(xì)胞分化、衰老,抑制基因轉(zhuǎn)錄和凋亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn),p21可被上游Egr1直接激活發(fā)揮作用[10]。本次研究在Egr1/p21信號(hào)通路的基礎(chǔ)上展開,通過(guò)土貝母皂苷甲體外干預(yù)人MCF-7細(xì)胞,探索其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株:乳腺癌MCF-7細(xì)胞(貨號(hào)CL-0149,武漢普諾賽生命科技有限公司)傳至4～5代。

1.1.2 藥品及試劑:土貝母皂苷甲(純度≥98%,HPLC,CAS:102040-03-9);DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)J180009,HyClone公司);胎牛血清(HyClone公司);青霉素-鏈霉素(批號(hào)15140-122,HyClone公司);胰酶0.25%(批號(hào)AD21573271,HyClone公司);CCK-8細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20160406);DMSO(批號(hào)300490623);引物、RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)9108)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:生物顯微成像系統(tǒng)(Olympus公司);高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)HC-3018R,科大創(chuàng)新股份有限公司);酶標(biāo)儀(型號(hào)1510,Thermo公司);反轉(zhuǎn)錄儀(Eppendorf AG公司);qRT-PCR儀(型號(hào)Takara)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:采用90%的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗,三者按比例混合均勻即為完全培養(yǎng)基。將復(fù)蘇或傳代后的MCF-7細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),在每個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶中加4 ml完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置于5%的CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d換1次液,待細(xì)胞對(duì)數(shù)增長(zhǎng)時(shí),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組:空白組、TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組。

1.2.2 土貝母皂苷甲溶液配制:精確稱量土貝母皂苷甲固體粉末3.20 mg,溶于20 ml完全培養(yǎng)基中,震蕩使完全溶解,得160 μg/ml的土貝母皂苷甲母液,放于冰箱4 ℃保存,備用。TBMS Ⅰ高劑量組濃度20 μg/ml、TBMS Ⅰ中劑量組濃度15 μg/ml、TBMS Ⅰ低劑量組濃度10 μg/ml。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板上,每孔5×103個(gè)細(xì)胞,邊緣孔加入PBS溶液,防止實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基揮發(fā)影響結(jié)果,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,將96孔培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細(xì)胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預(yù)細(xì)胞24 h,之后每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔加入20 μl的CCK-8試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值,根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。重復(fù)上述步驟,藥物干預(yù)時(shí)間分別改為48 h和72 h,最后計(jì)算出對(duì)應(yīng)干預(yù)時(shí)間的細(xì)胞存活率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞接種于6孔板,每孔5×105個(gè)細(xì)胞,將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細(xì)胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預(yù)細(xì)胞48 h,之后收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞,使用PBS溶液洗滌2次,消化,離心1000 r/min、5 min,對(duì)應(yīng)收集細(xì)胞,加入400 μl 1×Binding Buffer將2次收集的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液;向細(xì)胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫條件,避光孵育15 min,再向其中加入10 μl的PI染色劑,混勻,避光冰浴5 min,在0.5 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞接種于6孔板,每孔1×106個(gè)細(xì)胞,將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細(xì)胞貼壁后,使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預(yù)細(xì)胞48 h,之后使用PBS溶液洗滌2次,消化,離心1000 r/min、5 min,收集細(xì)胞,使用PBS溶液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml,取濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液1 ml,離心2000 r/min、5 min,棄上清,加入500 μl的70%冷乙醇固定,4 ℃過(guò)夜,離心1000 r/min、5 min,棄冷乙醇固定液,加50 μl的RNase A 、450 μl的PI配置好的工作液,混勻,4 ℃避光放置0.5 h,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)Egr1、p21蛋白表達(dá):待細(xì)胞培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí),并且細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí),使用不同濃度的土貝母皂苷甲干預(yù)細(xì)胞48 h,棄掉培養(yǎng)基,加PBS溶液洗滌2次,消化,離心2000 r/min、5 min,收集細(xì)胞,按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取蛋白,隨后上樣每孔20 μg,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉過(guò)夜。次日,加入一抗,室溫孵育2 h,使用PBST溶液洗滌5次,加入二抗,室溫孵育2 h后,避光加入ECL發(fā)光液,顯影。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)Egr1、p21 mRNA表達(dá):待細(xì)胞培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí),并且細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí),使用不同濃度土貝母皂苷甲干預(yù)細(xì)胞48 h,棄掉培養(yǎng)基,加PBS溶液洗滌2次,消化,離心2000 r/min、5 min,收集細(xì)胞,按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,使用核酸濃度測(cè)量?jī)x測(cè)定總RNA濃度、純度,測(cè)定結(jié)果表明樣品OD260/OD280值均在1.8～2.1范圍之內(nèi),符合要求。取各樣品RNA 1 μg與5×Primer Script RT Master Mix、無(wú)菌無(wú)酶水組成10 μl反應(yīng)體系,混勻,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件:先37 ℃、15 min,后85 ℃、反應(yīng)5 s,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放置于冰箱-20 ℃中保存?zhèn)溆?使用Thermal Cycler Dice Real Time System擴(kuò)增儀,檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組MCF-7細(xì)胞存活率比較 見表1。土貝母皂苷甲干預(yù)MCF-7細(xì)胞24 h后,TBMS Ⅰ高劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用最明顯。干預(yù)48 h后,TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組都能抑制MCF-7細(xì)胞活性。干預(yù)72 h,TBMS Ⅰ高劑量組、TBMS Ⅰ中劑量組、TBMS Ⅰ低劑量組能明顯抑制MCF-7細(xì)胞存活率,與48 h組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組MCF-7細(xì)胞存活率比較(%)

2.2 各組MCF-7細(xì)胞凋亡比較 土貝母皂苷甲能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡,土貝母皂苷甲各劑量組與空白組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TBMS Ⅰ低劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率10.9%、TBMS Ⅰ中劑量組20.4%、TBMS Ⅰ高劑量組31.9%,提示TBMS Ⅰ高劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡效果最好。

2.3 各組對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 見表2(圖1)。土貝母皂苷甲干預(yù)MCF-7細(xì)胞48 h后,土貝母皂苷甲各劑量組G0/G1期細(xì)胞所占比率均減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。48 h后土貝母皂苷甲各劑量組G2/M期細(xì)胞占比均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組對(duì)MCF-7細(xì)胞周期影響比較

表2 各組對(duì)MCF-7細(xì)胞周期影響比較(%)

2.4 各組Egr1、p21蛋白表達(dá)比較 各組干預(yù)MCF-7細(xì)胞48 h后,土貝母皂苷甲各劑量組Egr1、p21蛋白表達(dá)均升高,見圖2。

2.5 各組Egr1、p21 mRNA表達(dá)比較 干預(yù)MCF-7細(xì)胞48 h后土貝母皂苷甲各劑量組Egr1、p21 mRNA表達(dá)量均高于空白組,且TBMS Ⅰ高劑量組Egr1、p21 mRNA表達(dá)量最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 各組MCF-7細(xì)胞Egr1、p21 mRNA比較

3 討 論

乳腺癌在中醫(yī)典籍中稱之為“乳巖”“乳疽”等,中醫(yī)藥在臨床治療乳腺癌已取得長(zhǎng)足進(jìn)展。土貝母皂苷甲具有廣泛的生物學(xué)活性,包括抗炎、抗病毒、免疫抑制作用[11]。土貝母皂苷甲對(duì)肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等有抗癌作用[12]。土貝母皂苷甲可通過(guò)抑制NF-κB結(jié)合活性或Wnt/β-catenin信號(hào)通路,激活MAPK-JNK通路,促進(jìn)蛋白酶體VEGFR2、Tie2降解,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤血管生成[13-14]。

Egr1是一種由應(yīng)激、損傷、絲裂原和分化誘導(dǎo)的即時(shí)早期反應(yīng)基因,它調(diào)節(jié)多種基因表達(dá),參與控制生長(zhǎng)和凋亡,在各種人類癌癥中發(fā)揮抑癌作用[14]。p21是位于Egr1下游的重要靶基因,是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)抑制劑,其功能在于誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[15]。有研究發(fā)現(xiàn),Egr1通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控其下游靶基因,尤其是參與細(xì)胞周期阻滯和凋亡的p21發(fā)揮抗癌作用[16]。同時(shí)有文章表明,作為下游靶基因p21過(guò)表達(dá),影響乳腺癌細(xì)胞周期分化,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[17]。

本次研究結(jié)果表明土貝母皂苷甲可以促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Egr1的表達(dá),而Egr1通過(guò)上調(diào)下游靶基因,特別是參與細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的p21,從而誘導(dǎo)凋亡。本次研究表明,土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖,促進(jìn)Egr1的表達(dá),進(jìn)而激活其下游靶基因p21表達(dá),引起MCF-7細(xì)胞周期G2/M阻滯,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的凋亡。因此,土貝母皂苷甲對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制很可能是通過(guò)激活Egr1/p21信號(hào)通路,發(fā)揮抗癌作用的。

同時(shí)本次研究?jī)H從細(xì)胞層次探討土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖,分子生物學(xué)指標(biāo)的改變?yōu)榕R床治療提供新的理論依據(jù),但是通過(guò)此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能替代現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療乳腺癌的方案,僅對(duì)乳腺癌的治療提供新思路,根據(jù)此前團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)[18-20],將進(jìn)一步制定體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案,明確土貝母皂苷甲可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖更深層次的藥理學(xué)機(jī)制。