越南非洲豬瘟疫苗NAVET-ASFVAC（ASFV-GΔI177L）研究現(xiàn)狀及思考

戈勝強，徐天剛，尼 博，劉春菊，韓乃君，王曉華，鄭 輝，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.青島市現(xiàn)代生物工程及動物疫病研究重點實驗室，山東青島 266032；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

2023年7月24日，越南政府正式批準兩款非洲豬瘟（ASF）疫苗在其全國范圍內(nèi)使用[1]。此次批準的兩款疫苗為非洲豬瘟病毒（ASFV）基因缺失弱毒疫苗，分別為越南國家獸醫(yī)聯(lián)合股份公司（National Veterinary Joint Stock Company，NAVETCO）生產(chǎn)的NAVET-ASFVAC（ASFVG-ΔI177L）和AVAC越南股份有限公司生產(chǎn)的AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）。此外，越南Dabaco集團聯(lián)合股份公司研發(fā)的ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR株疫苗也正在進行最后的注冊審批。這三款越南疫苗的種毒均為從美國引進的基因Ⅱ型缺失毒株，其中ASFV-G-ΔI177L引進越南時間最早（2020年9月），相關配套研究及公開報道信息最多。自2020年美國I177L基因缺失株（ASFV-G-ΔI177L）[2]公開報道，并將其授權(quán)越南進行臨床研究以來，美國（部分聯(lián)合越南研究機構(gòu)）對該毒株進行了多方面評價，涉及毒株構(gòu)建[2]、口鼻接種[3]、傳代細胞系馴化[4]、越南地方品種豬評價[5]、水平傳播/毒力返強評價[6]、種子批純度驗證[7]、大劑量長期觀察[8]、細胞免疫影響[9]等。這些試驗從各個方面證實了ASFV-G-ΔI177L基因缺失株具備較好的疫苗應用潛質(zhì)，但在我國目前尚無材料進行全面介紹，為此就越南ASF疫苗（ASFV-G-ΔI177L）種毒的核心研究數(shù)據(jù)進行綜述，以期為我國相關研究及政策制定提供參考。

1 I177L基因缺失株首次評價數(shù)據(jù)

2020年，Borca等[2]發(fā)表文章稱ASFVI177L基因缺失株可對格魯吉亞分離株（ASFV-G，基因II型）產(chǎn)生有效保護，這是目前為數(shù)不多的能對ASFV-G產(chǎn)生保護的試驗性疫苗候選株，也是首個能誘導產(chǎn)生無排毒免疫（sterile immunity）的疫苗株。I177L基因位于ASFV-G基因組的第174 471和第175 004位核苷酸之間，編碼177個氨基酸。I177L基因編碼序列在大多數(shù)ASFV分離株中高度相似，推測其基因包含1個N端跨膜螺旋，表達的蛋白為晚期表達蛋白，其功能尚不明確。ASFV-G毒株敲除I177L基因后，其在原代細胞中的繁殖能力顯著降低，其病毒復制水平也只有母本病毒的1/100～1/1 000。動物接種試驗證實，不同劑量接種（102、104、106HAD50，肌肉注射，每組5只）后動物全部存活，接種后第12天所有豬只抗體轉(zhuǎn)陽，28 d觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)。ASFV-G-ΔI177L接種后病毒會在血液中持續(xù)存在，且病毒滴度與接種劑量呈一定正相關，但不同劑量接種豬存在一定差異，104和106HAD50接種組的病毒滴度（第4～7天）要普遍高于102HAD50接種組1 000～10 000倍，但仍低于ASFV-G野毒接種組。對ASFV-G-ΔI177L接種組中混養(yǎng)的空白對照豬/哨兵豬（sentinel animals）進行檢測，結(jié)果在血液和第28天剖檢的扁桃體和脾臟中均未檢出病毒。

對ASFV-G-ΔI177L接種豬進行攻毒保護試驗（ASFV-G，102HAD50，肌肉注射），結(jié)果所有豬只均存活，21 d觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)。ASFV-G-ΔI177L接種組所有豬只的病毒血癥均低于攻毒對照豬，且呈現(xiàn)逐漸下降直至消失的趨勢。在攻毒后第4天采集所有接種試驗豬的血液樣品進行ASFV-G病毒檢測，結(jié)果除102HAD50ASFV-G-ΔI177L接種組1頭豬外，其余所有豬只的血液樣品均檢測不到ASFV-G病毒核酸。攻毒后第21天（試驗觀察結(jié)束）采集所有接種試驗豬的扁桃體或脾臟，結(jié)果僅102HAD50ASFV-G-ΔI177L接種組同一頭血液陽性豬的脾臟中檢出ASFV-G核酸。以上數(shù)據(jù)說明，所有接種劑量大于104HAD50的試驗豬和大多數(shù)102HAD50接種豬體內(nèi)均沒有強毒株（ASFV-G）復制跡象。這也是該疫苗被美國“寄予厚望”的最重要原因之一，即高劑量ASFV-GΔI177L接種豬可以從某種程度上清除強毒株感染。

2 口鼻接種評價

2021年4月，Borca等[3]對ASFV-G-ΔI177L減毒株的口鼻接種途徑（106HAD50滴入鼻腔后部或舌根）和肌肉注射途徑（102HAD50）進行了安全性和有效性評估及比較。結(jié)果表明：口鼻接種和肌肉注射的所有豬只均存活，28 d觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)?？诒墙臃N組的病毒滴度較低，僅約是肌肉注射接種組的1/10 000；肌肉注射組的病毒血癥水平在接種后第7天開始升高，第11～14天達到最高位（104～107HAD50/mL），而口鼻接種組的病毒血癥水平一直較低，接種后第4～7天達到最高（102～104HAD50/mL），至第28天攻毒前仍保持在低于103HAD50/mL的水平。與之前研究相似，口鼻接種組和肌肉注射組的同群飼養(yǎng)空白豬樣品（接種后第28天血液、扁桃體和脾臟）均為陰性，這表明ASFV-G-ΔI177L不論以何種方式接種，均不能排出足量的病毒感染同群豬。

接種后第28天攻毒（ASFV-G，102HAD50，肌肉注射）的結(jié)果顯示，肌肉注射組和口鼻接種組豬均存活，21 d觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)；病毒血癥監(jiān)測結(jié)果顯示，口鼻接種豬攻毒后只有較低水平的病毒滴度（102.8HAD50/mL）。以上數(shù)據(jù)說明，經(jīng)口鼻途徑接種疫苗的安全性及免疫效果更好，其病毒血癥水平比肌肉注射接種方式更低且能抵抗強毒株攻擊。

3 越南地方品種豬安全性和效力評價

2021年9月，美國梅島動物疫病中心（Plum Island Animal Disease Center）聯(lián)合越南國家獸醫(yī)聯(lián)合股份公司（NAVETCO），評價了ASFV-GΔI177L疫苗候選株對越南地方品種芒菜雜交豬（Vietnamese Mongcai crossbred pigs，MC）的安全性，并在歐洲大約克-長白二元雜交豬（European Yorkshire and Landrace crossbreed，YL）和MC兩個品種豬上進行了免疫攻毒保護試驗[5]。結(jié)果表明：不同劑量（101、102、103、104HAD50，肌肉注射）ASFV-G-ΔI177L疫苗候選株接種的MC品種豬和大劑量（106HAD50，肌肉注射）接種的YL品種豬，均在28 d觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)。101HAD50接種組只有2頭豬有輕微的抗體反應，剩余3頭豬無抗體反應；102HAD50接種的5頭豬也只有輕微的抗體反應，而103和104HAD50接種組均有較強的抗體反應。攻毒（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射）結(jié)果顯示：101HAD50接種組中有3頭豬發(fā)病死亡，其余2頭豬存活；102HAD50接種組中5頭豬均存活，但2頭豬出現(xiàn)一過性體溫升高；103HAD50接種組除1頭豬出現(xiàn)一過性體溫升高外，其余豬只無任何臨床癥狀，而104HAD50接種組均無任何臨床癥狀。排毒檢測結(jié)果顯示，只有101HAD50接種組中存活的2頭豬能檢測到攻毒強毒株，其余接種組豬均未檢出攻毒強毒株。

為進一步驗證不同品種豬的安全性，將25頭YL品種豬和22頭MC品種豬各接種2次（102.6HAD50，肌肉注射，間隔2周），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在28 d觀察期內(nèi)，除2頭豬有2 d排軟糞便，其余豬只均無任何臨床異常[6]。

為進一步比較MC品種豬（20頭）和YL品種豬（25頭）的攻毒保護水平差異，對兩組豬均統(tǒng)一接種102.6HAD50劑量的ASFV-G-ΔI177L。結(jié)果顯示：第14天和21天的抗體陽性率，MC品種豬分別為30%和60%，而YL品種豬分別為46%和73%；接種后第28天攻毒（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射），發(fā)現(xiàn)所有接種豬（共45頭）在21 d觀察期內(nèi)，除個別豬出現(xiàn)不到40 ℃的體溫反應外，均無其他臨床異常表現(xiàn)。以上數(shù)據(jù)說明，兩個品種豬免疫接種ASFVG-ΔI177L（102.6HAD50劑量以上）后均安全，并能抵御越南流行強毒株攻毒，且未見顯著差異。

4 不同品種豬攻毒保護起效時間評價

為評價ASFV-G-ΔI177L的免疫保護起效時間，美國梅島動物疫病中心繼續(xù)聯(lián)合NAVETCO對不同組在接種（102.6HAD50，肌肉注射）后第14天（6頭YL豬和12頭MC豬），第21天（5頭MC豬）和第28天（YL豬和MC豬各5頭）進行攻毒試驗（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射）[5]。結(jié)果顯示：第14天攻毒組中，3頭YL豬和6頭MC豬存活（各占50%）；第21天和28天攻毒組中，所有豬只均存活且無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)。這說明ASFV-G-ΔI177L接種（102.6HAD50，肌肉注射）后，第21天即可產(chǎn)生全面保護且對兩個品種豬無顯著差異。

5 水平傳播評價

2022年4月，美國梅島動物疫病中心繼續(xù)聯(lián)合NAVETCO，對ASFV-G-ΔI177L進行了更深入的安全性評價[6]。結(jié)果顯示：4頭接種豬（102.6HAD50，肌肉注射）和5頭空白對照豬同圈飼養(yǎng)，28 d觀察期內(nèi)，所有豬無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)；4頭接種豬第7、14、21天血液中均有病毒（Ct最低為28.62），但到第28天時全部轉(zhuǎn)為陰性；4頭接種豬的鼻腔拭子從第14天開始部分出現(xiàn)陽性核酸，但第28天時只有1頭豬陽性（Ct為32.78）；5頭同群豬前21 d，血液和鼻腔拭子均為陰性，但第28天時有2頭豬鼻腔拭子為陽性（Ct分別為36.00和36.86），血液樣品仍為陰性。此外，5頭同群豬在接種后49 d仍為抗體陰性。這說明在實驗室環(huán)境下，同群豬未被接種豬（帶毒/排毒）感染。

為驗證臨床狀態(tài)下的病毒水平傳播能力，將50頭接種豬（102.6HAD50，肌肉注射，間隔3周接種2次）和10頭空白對照豬同圈飼養(yǎng)，49 d觀察期內(nèi)，所有豬無臨床異常表現(xiàn)；在第49天時，同群豬中有3頭血液中有病毒核酸（Ct分別為37.29、36.90和21.14），且50%的豬抗體陽性（5/10）。這說明在臨床環(huán)境下，ASFV-G-ΔI177L在一定程度上可通過水平傳播感染同群豬，并進行病毒復制產(chǎn)生ASFV特異性抗體。此外，高病毒載量（Ct為21.14）的同群豬抗體為陰性，推測該豬仍處于感染早期，未來抗體可能會轉(zhuǎn)陽。

6 超劑量接種安全性評價

為驗證超劑量接種的安全性，美國梅島動物疫病中心繼續(xù)聯(lián)合NAVETCO將14頭豬接種10倍劑量（103.6HAD50），6頭豬接種5倍劑量（103.3HAD50），12頭豬單劑量接種2次（102.6HAD50，間隔2周）[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15 d或28 d的觀察期內(nèi)，大部分豬臨床表現(xiàn)正常，僅個別豬（每組1～2頭）出現(xiàn)1～2 d的咳嗽、軟糞便和輕微體溫升高等。這說明該疫苗以10倍劑量接種仍然安全。

7 毒力返強評價

為評價ASFV-G-ΔI177L在豬體內(nèi)連續(xù)傳代后是否會發(fā)生毒力返強，美國梅島動物疫病中心繼續(xù)聯(lián)合NAVETCO將ASFV-G-ΔI177L對實驗豬連續(xù)感染5代（每代次3頭豬）[6]。第一代豬接種（102.8HAD50，肌肉注射）后，第二代到第五代豬分別肌肉接種上一代第11和14天的1 mL血液（前期試驗證實為病毒血癥滴度最高時刻）并測定每代次豬第7、11、14、21和28天的病毒血癥。結(jié)果顯示：5代豬均未出現(xiàn)ASF特征性臨床發(fā)病癥狀，采食量正常，對外部刺激保持警覺，只有個別豬出現(xiàn)咳嗽、軟糞便和短暫體溫升高等反應；但隨著傳代次數(shù)增加，病毒血癥的滴度和陽性存留時間均呈明顯增長趨勢（表1）。以上數(shù)據(jù)說明，ASFV-GΔI177L在豬體內(nèi)連續(xù)傳5代仍有較穩(wěn)定的安全表現(xiàn)，5個代次病毒的全基因測序也未發(fā)現(xiàn)重要的基因組變異，但病毒血癥增高的潛在風險仍需進一步研究和評估。

表1 各代次病毒血癥檢測情況 單位：HAD50/mL

8 大劑量長期觀察評價

為評價大劑量接種（106.0HAD50，肌肉注射）后，病毒在體內(nèi)長時間的消長規(guī)律，Borca等[8]將ASFV-G-ΔI177L接種后分別觀察90 d或180 d。結(jié)果顯示：所有接種豬在觀察期內(nèi)無任何體溫反應和臨床異常表現(xiàn)，90 d和180 d剖檢未觀察到任何與ASF相關聯(lián)的病變。病毒血癥監(jiān)測結(jié)果顯示：90 d觀察組（5頭豬）中，第30天的病毒滴度為陰性至106.0HAD50/mL，第60天時只有1頭豬病毒滴度為103.55HAD50/mL，其余均為陰性，至第90天時，所有豬檢測均為陰性；相似的，180 d觀察組（10頭豬）中，病毒血癥自第90天開始也全部變?yōu)殛幮?，直至試驗結(jié)束。以上試驗說明，大劑量接種ASFV-G-ΔI177L未出現(xiàn)臨床異常現(xiàn)象，病毒血癥期小于90 d。

9 有關思考

ASFV-G-ΔI177L是目前美國投入研究力量最多的ASF疫苗候選株。該毒株的一些生物學特點使得該毒株與其他在研的ASFV基因缺失弱毒株具備一定的差異。從“理想”的疫苗候選株評價角度考慮，該毒株“優(yōu)點”是繁殖能力較母本強毒株低（約是母本的1/100～1/1 000），大劑量接種（104HAD50以上）可清除強毒株等，超劑量接種（10倍，103.6HAD50）依然安全，單次接種（102.6HAD50）最快在第21天產(chǎn)生全面保護，口鼻接種（106HAD50滴入鼻腔后部或舌根）也有攻毒保護能力等。但“缺點”是，接種后病毒血癥滴度較高，超劑量接種（106.0HAD50）后存在長時間病毒血癥（60 d），臨床環(huán)境下存在水平傳播能力，毒力返強試驗中病毒血癥增高等。此外，該毒株對于母豬（特別是妊娠母豬）、不同日齡靶動物以及野豬等還缺乏安全性評價，部分安全性評價中還缺乏組織病理、不同組織/淋巴結(jié)病毒載量等數(shù)據(jù)，對于是否能發(fā)生垂直傳播、基因重組以及對基因I型ASFV的交叉保護能力等還缺乏評價。

ASFV-G-ΔI177L在實驗室評價中未出現(xiàn)水平傳播，但在臨床環(huán)境評價中卻證實其存在水平傳播[6]，特別是1頭同群豬在第49天時血液樣本檢測病毒Ct為21.14（滴度較高），結(jié)合該毒株在毒力返強試驗中存在病毒血癥增高以及豬只之間的平行數(shù)據(jù)有時存在一定的差異等現(xiàn)象，提示該毒株在臨床應用中可能存在個別豬“效果不理想”進而誘發(fā)病毒持續(xù)變化，直至“免疫失敗”或“臨床副反應不可接受”等情況的發(fā)生，尤其是臨床環(huán)境下存在水平傳播的可能，因此應予以高度重視，持續(xù)開展系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測研究，及時掌握當前疫苗的實際使用效果，以便科學合理地管理使用疫苗。