基于TMT蛋白組學探討消腫止痛合劑治療皮瓣缺血再灌注損傷的作用機制*

馬歲錄，何志軍，劉濤，李巖，何元旭，何波

（1.甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院 蘭州 730030；2.甘肅省中醫(yī)院 蘭州 730050）

皮瓣缺血再灌注損傷（FIRI）是指缺血缺氧的皮瓣組織在血運重建過程中由于有害物質(zhì)的釋放而引起皮瓣組織再次損傷的病理過程。皮瓣移植技術作為整形外科與修復重建外科在臨床上治療燒傷、腫瘤、骨感染等疾病的重要手術方式，臨床應用廣泛，但術后出現(xiàn)的皮瓣壞死不僅困擾著臨床醫(yī)生，同時也加重了患者的負擔[1]。有研究表明，皮瓣移植過程中出現(xiàn)的FIRI是導致皮瓣壞死的主要原因[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)FIRI是由炎癥反應、氧化應激反應、血管內(nèi)皮細胞壞死、局部微循環(huán)障礙等多種因素共同作用的結果[2]。

FIRI屬于中醫(yī)學中“瘀血證”的范疇，臨床上使用具有“祛瘀生新、活血止痛”功效的中醫(yī)藥治療FIRI的效果顯著[3]。在中醫(yī)整體觀念與辨證論治思想的指導下，以“活血化瘀、消腫止痛”為主體的中醫(yī)藥在治療FIRI中具有良好的效果，不僅可以顯著提高移植皮瓣的存活率，還可以降低西藥治療過程中出現(xiàn)的不良反應[4]。中醫(yī)藥作為我國的瑰寶，中藥以及中藥制劑內(nèi)的有效成分較為復雜，并且在疾病治療過程中的作用機制尚未完全清楚，但隨著蛋白組學（Proteomics）技術的出現(xiàn)與不斷發(fā)展，通過使用蛋白組學技術研究藥物在治療疾病過程中的關鍵靶點，可以為中藥、中藥制劑的研發(fā)，以及探究中醫(yī)藥治療疾病的作用機制提供了重要途徑[5]。

消腫止痛合劑屬于甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心生產(chǎn)，用于治療骨折、骨折術后、軟組織損傷等多種骨傷科疾病多年，臨床療效顯著[6]。課題組前期相關臨床和實驗研究證實，消腫止痛合劑可以通過減少炎癥因子的釋放、中性粒細胞的聚集以及細胞凋亡，從而達到保護缺血缺氧皮瓣的目的[7]。同時，近期課題研究發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑可以通過減少FIRI大鼠血管內(nèi)皮細胞的凋亡，促進皮瓣新生血管的生成，從而極大程度的提高了移植皮瓣的成活率[8]。既往研究已經(jīng)證實消腫止痛合劑可以改善FIRI大鼠皮瓣的成活率。但消腫止痛合劑治療FIRI的機制研究尚不夠深入，仍需繼續(xù)深入研究。本次研究通過利用TMT體外標記定量蛋白組學技術，篩選消腫止痛合劑在FIRI中起藥理作用的關鍵靶點與通路，從蛋白表達調(diào)控角度闡述消腫止痛合劑治療FIRI的作用機制，并為課題組的相關研究提供新的思路與方向。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

采用2月齡SPF級SD大鼠30只（由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，溫度22℃，相對濕度55%，自由攝食飲水），雌雄各半，體質(zhì)量在200-220 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2020-0009，動物合格證編號：NO.62001000000533，本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批號：2021-024）。消腫止痛合劑，由甘肅省中醫(yī)院制劑室按制備工藝制成，注冊文號：甘衛(wèi)普制準字（1997）-202-04，批號：20051122，規(guī)格：250 mL/瓶；UA 緩沖液（Sigma公司，8M Urea，150 mmol·L-1Tris-HCl pH = 8.0）、NH4HCO3（Sigma公司，批號：A6141）、乙腈（Merck公司，批號：1499230-935）、甲酸（Fluka公司，批號：20190111723）、TMT 10plex kit（Thermo Fisher公司，批號：90066）、High-pH反相肽分離試劑盒（Thermo Fisher公司，批號：84868）、質(zhì)譜儀（Thermo Scientific公司，Q-exacitve HF-X）、色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific公司，Easy-nLC1200）、色譜柱（Trap column（Reverse-phase），100 μm×20 mm (5 μm，C18)）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與給藥

采用SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量200-220 g（由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供）。將30只大鼠按體質(zhì)量編號后，使用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為3組，正常組（假手術組）、模型組、消腫止痛合劑組（消腫組），各組10只。消腫組給予消腫止痛合劑灌胃，給藥量按70 kg 成人體表面積折算成等效劑量，按1.8 mL·kg-1灌胃，1 mL/100 g(每毫升含生藥0.09 g)，1次/天，連續(xù)7天；正常組、模型組給予同體積生理鹽水灌胃，1次/天，連續(xù)7天。

1.2.2 實驗動物造模

皮瓣造模方法參考Schmauss等[9]所述文獻進行造模：以1%的戊巴比妥（0.5 mL/100g）腹腔麻醉3組SD大鼠，俯臥位固定于大鼠解剖，正常組切取背部約5 cm×6 cm皮膚及其皮下筋膜，未游離皮瓣。模型組與消腫組完全游離背部大小約5 cm×6 cm帶蒂皮瓣，并使用微血管夾夾閉雙側胸背淺動脈2 h，2 h后去除血管夾在顯微鏡下觀察血運恢復情況，模擬FIRI。用6-0醫(yī)用聚酰胺縫合線間斷原位縫合皮瓣（皮瓣組織包括皮膚及皮下筋膜層）。各組大鼠切口周圍聚維碘酮消毒后涂抹紅霉素軟膏，術后前3天使用頭孢噻肟鈉預防感染（sig:0.2 g，i.m,qd)。

1.2.3 標本采集、病理組織學觀察與蛋白樣品制備

術后7天將大鼠麻醉，觀察各組皮瓣組織壞死程度后，切取皮瓣組織，部分放入10%中性多聚甲醛固定，乙醇、二甲苯處理后石蠟包埋并切片處理，TUNEL染色后在光學顯微鏡下行觀察。部分放入事先預備好的液氮罐中，12 h后取出置于-80℃冰箱中保存待用。取樣品液氮研磨，每樣稱取約100 mg，分別加入600 μL SDT裂解液，冰浴超聲2 min，4℃，16 000 g離心20 min，取上清液，使用BCA法進行蛋白定量。

1.2.4 指標檢測

（1）SDS-PAGE凝膠電泳

每組樣品各取15 μg蛋白質(zhì)樣品5∶1（V/V）加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，進行8%-16% SDSPAGE電泳。電泳使用考馬斯亮藍染色（Bradford法）。

（2）蛋白質(zhì)酶解及肽段脫鹽

每組樣品各取300 μg蛋白質(zhì)樣品進行蛋白質(zhì)酶解，酶解方法參考Wi?niewski等[10]使用的FASP酶解法。酶解后的肽段使用C18 Cartridge脫鹽，真空凍干。肽段干燥后用0.1% TFA復溶，使用Thermo desalting spin column脫鹽處理，進行肽段定量。

（3）TMT肽段標記與肽段分級

每例樣品分別取100 μg肽段，按照Thermo Fisher公司TMT標記試劑盒說明書進行標記（正常組：ZC-1、ZC-2、ZC-3；模型組：MX-1、MX-2、MX-3；消腫組：XZ-1、XZ-2、XZ-3）。各組標記后的肽段等量混合、干燥，使用High-pH反相色譜柱將干燥后的肽段進行分級。最終將上述方法收集到的樣品合并為10個組分。每個組分的肽段干燥后用0.1% FA復溶凍干樣品，以備LC-MS分析。

（4）LC-MS/MS分析及蛋白質(zhì)鑒定

參考van den Broek等[11]論述的方法對樣品進行LC-MS/MS分析及蛋白質(zhì)鑒定。使用納升流速高效液相色譜系統(tǒng)（Easy nLC 1200）進行色譜分離。緩沖液A：0.1%甲酸水溶液；緩沖液B：0.1%甲酸、80%乙腈和水混合溶液。肽段分離后用Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀進行DDA二級質(zhì)譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)處理使用Proteome Discoverer軟件（搜索引擎 Sequest HT）對LC-MS/MS原始RAW文件進行數(shù)據(jù)庫檢索（蛋白數(shù)據(jù)庫：uniprot-Rattus norvegicus-[10116]-36181-20210608.fasta，來源網(wǎng)址：https://www.uniprot.org，蛋白數(shù)目：36181；下載日期：2021-06-8）。將篩選出的差異蛋白進行GO富集分析，KEGG通路富集分析，共同差異蛋白分析以及差異蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡分析。

2 結果

2.1 消腫止痛合劑對FIRI模型大鼠的影響

術后7天觀察大鼠皮瓣組織壞死程度發(fā)現(xiàn)（圖1），空白組大鼠皮瓣組織生長良好、色澤紅潤、彈性好；模型組大鼠皮瓣組織瘀血形成、色澤發(fā)黑，皮膚腫脹，彈性差；消腫止痛合劑治療后，大鼠皮瓣組織瘀血明顯減輕，腫脹基本消退，彈性好轉。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)（圖1），空白組大鼠皮瓣組織結構正常，核染色清晰、完整，未見明顯凋亡細胞；模型組大鼠皮瓣組織結構紊亂，核膜破裂，染色質(zhì)濃縮，可見大量凋亡細胞；消腫止痛合劑治療后，大鼠皮瓣組織結構相對完整，略有水腫，核染色較清晰，可見少量凋亡細胞。實驗結果提示FIRI可加重皮瓣壞死，而消腫止痛合劑可減輕FIRI造成的皮瓣壞死。

圖1 各組大鼠術后7天皮瓣形態(tài)及皮瓣組織TUNEL染色

2.2 皮瓣組織蛋白質(zhì)濃度測定及SDS-PAGE凝膠電泳

通過SDS-PAGE凝膠電泳，驗證制備的各組皮瓣組織總蛋白樣品，未見明顯蛋白質(zhì)降解，電泳平行性好，蛋白條帶清晰（圖2）。蛋白濃度測定結果為：正常組（9.49 μg·μL-1）、模型組（11.56 μg·μL-1）、消腫組（7.43 μg·μL-1），滿足后續(xù)研究TMT-蛋白定量檢測及其生物信息分析等實驗的要求。

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳圖譜

2.3 蛋白質(zhì)鑒定、定量分析、聚類分析及差異表達蛋白質(zhì)篩選

蛋白質(zhì)定量分析共鑒定到28012個唯一性肽段、5005個蛋白質(zhì)，其中定量到4996個蛋白質(zhì)。以上述實驗方法（fold change ＞ 1.2且P＜ 0.05）兩兩比較組間的顯著性差異蛋白質(zhì)結果。與正常組比較，模型組顯著差異蛋白表達數(shù)共有85個，其中表達上調(diào)的蛋白有22個，表達下調(diào)的蛋白有63個。與模型組比較，消腫組顯著差異蛋白表達數(shù)共有273個，其中表達上調(diào)的蛋白有141個，表達下調(diào)的蛋白有132個。在數(shù)據(jù)分析中，采用Fold change和P-value兩個因素共同繪制火山圖，用于表現(xiàn)兩組樣本數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)定量信息以及顯著性差異（圖3，圖4）。并且對目標蛋白進行蛋白質(zhì)聚類分析，以顯示所篩選的目標蛋白質(zhì)的合理性（圖5，圖6）。

圖3 模型組VS正常組蛋白質(zhì)定量火山圖

圖4 消腫組VS模型組蛋白質(zhì)定量火山圖

圖5 模型組VS正常組蛋白質(zhì)聚類分析

圖6 消腫組VS模型組蛋白質(zhì)聚類分析

2.4 生物信息學分析

2.4.1 差異蛋白GO富集分析

FIRI造模后差異表達蛋白質(zhì)GO功能富集分析，與正常組比較，通過分析模型組中差異表達蛋白GO功能注釋及富集，發(fā)現(xiàn)其主要涉及細胞及細胞器定位建立、分子轉運、單個有機體細胞定位、細胞器定位、免疫反應分子介質(zhì)產(chǎn)生、免疫球蛋白產(chǎn)生、水解酶活性負調(diào)控等生物過程（Biological process，BP）；包括線粒體、線粒體膜部分、細胞質(zhì)、胞外區(qū)域等細胞組分（Cellular compoent，CC）；參與酶活性抑制、肽酶調(diào)節(jié)、內(nèi)切酶抑制、多巴胺受體結合等分子功能（Molecular function，MF）（圖7）。

圖7 模型組VS正常組GO功能富集分析

消腫止痛合劑治療后差異蛋白質(zhì)GO功能富集分析，與模型組比較，通過分析消腫組中差異表達蛋白GO功能注釋及富集，發(fā)現(xiàn)其主要涉及單有機體代謝、細胞組分的發(fā)生與結合、分解代謝、酸性物質(zhì)代謝等生物過程；包括細胞器、細胞器膜部分、細胞質(zhì)部分、囊泡、線粒體等細胞組分；參與催化、小分子結合、水解酶活化、同種蛋白結合、核苷酸調(diào)節(jié)等分子功能（圖8）。

圖8 消腫組VS模型組的GO功能富集分析

2.4.2 差異蛋白KEGG通路富集分析

FIRI造模后差異表達蛋白質(zhì)KEGG富集分析，與正常組對比，通過分析模型組的差異表達蛋白，富集到KEGG通路共8條（圖9）。其中富集程度最高的為心肌收縮信號通路、其次為心肌收縮的腎上腺素能信號通路、細胞周期信號通路、氧化磷酸化信號通路、磷脂酶D信號通路等。這些信號通路涉及到生物體代謝、信號傳導及細胞轉化等過程。

圖9 模型組VS正常組KEGG通路富集分析

消腫止痛合劑治療后差異表達蛋白質(zhì)KEGG富集分析，與模型組對比，通過分析消腫組的差異表達蛋白，富集到KEGG通路共12條（圖10）。其中富集程度最高的為代謝信號通路、其次為核糖體轉錄翻譯等信號通路、蛋白酶體信號通路、細胞周期信號通路等。這些信號通路主要涉及到生物體代謝、遺傳信息的加工處理及細胞轉化過程。

圖10 消腫組VS模型組KEGG通路富集分析

2.4.3 共同差異蛋白分析

將模型組VS正常組、消腫組VS模型組中相關差異蛋白數(shù)據(jù)進行分析，得出共同差異蛋白統(tǒng)計結果。在模型組中表達上調(diào)，但在消腫組中有表達下調(diào)的蛋白有3個；在模型組中表達下調(diào)，但在消腫組中表達上調(diào)的蛋白有13個；即模型組共有16個表達異常的蛋白在消腫止痛合劑干預后得到糾正（表1）。

表1 模型組與消腫組的共同差異表達蛋白統(tǒng)計

2.4.4 差異蛋白相互作用分析

在生物體中，各種蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能必須依賴于多種蛋白質(zhì)的介導與調(diào)節(jié)，為了更加清晰的闡述不同蛋白之間的相互作用，借助STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡分析工具分析，得出PPI圖（圖11），發(fā)現(xiàn)在線粒體核糖核蛋白體（Ribosome）相關信號通路主要涉及到的差異蛋白或基因共有8個，分別為Rpl32、Rps11、Rpl35a、Mrpl4、Mrpl2、Mrpl32、Mrpl34、Mrpl28；在蛋白酶體（Proteasome）信號通路主要涉及到的差異蛋白或基因共有6個，分別為Psmb6、Psma4、Psmb1、Psma2、Psma6、Psmd8；在蛋白傳出（Protein export）相關信號通路主要涉及到差異蛋白或基因3個，分別為Srp19、Srp9、Spcs3。在蛋白酶體與線粒體核糖體相互作用中，Mrpl32與Psma2之間存在相互作用，Mrpl34與Psma4存在相互作用。在蛋白酶體與蛋白傳出相互作用中，Psmb1與Srp9存在相互關系。

圖11 共同差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡

3 討論

FIRI是皮瓣移植術后出現(xiàn)皮瓣壞死的重要原因，其過程是多種致病因素共同作用的結果，屬于中醫(yī)“血瘀”范疇。中藥或者中藥制劑在治療FIRI時具有多靶點、全方位的治療效果。消腫止痛合劑是由當歸、川芎、桃仁、紅花、赤芍、木香、澤蘭等藥物構成的復方制劑，具有“活血化瘀、消腫止痛”的功效，對于皮瓣移植術后患者療效顯著，并且課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑可以促進FIRI模型大鼠皮瓣的存活率[6-8]。蛋白組學技術通過對完整的細胞、組織、體液等樣品的全部蛋白質(zhì)進行相應分析研究，可用于藥物研發(fā)過程中不同的階段，在現(xiàn)代藥物研發(fā)過程中具有重要作用[5]。本次實驗結合GO功能分析、KEGG通路分析、PPI相互作用分析，篩選出消腫止痛合劑治療FIRI大鼠可能與線粒體核糖體、20S蛋白酶體等信號通路有關，其中差異蛋白Mrpl32、Psma2、Mrpl34、Psma4、Psmb1可能是治療的關鍵靶點。

Mrpl32與Mrpl34是線粒體核糖體復合物（Mitochondrial ribosomal protein，MRP）合成過程中的重要蛋白質(zhì)亞基，廣泛存在于哺乳動物線粒體中，可通過調(diào)控線粒體的結構與功能參與生命調(diào)節(jié)的過程[12]。Cheong等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在敲除小鼠Mrpl32與Mrpl34基因后，小鼠胚胎細胞內(nèi)的線粒體調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，原腸胚形成障礙，導致胚胎的生長發(fā)育受到限制，提示Mrpl32與Mrpl34通過調(diào)節(jié)線粒體功能而維持細胞穩(wěn)態(tài)。有研究表明，MrpL32與線粒體內(nèi)膜緊密結合，參與線粒體蛋白體的組裝過程，在線粒體翻譯以及維持翻譯相對穩(wěn)定性起重要作用，此外，MrpL32還可促進線粒體的成熟[13]。在IRI過程中，由于線粒體穩(wěn)態(tài)的破壞以及線粒體核糖體功能的紊亂，引起了線粒體內(nèi)膜上的氧化磷酸化過程被抑制，細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的釋放增加，線粒體的分裂與融合發(fā)生失衡，從而可導致組織器官的進一步損傷[14]。Xie等[15]發(fā)現(xiàn)在腦IRI模型中，外源性線粒體移植可降低細胞內(nèi)ROS的表達水平并減少細胞凋亡，對腦組織起保護作用，提示線粒體在IRI中具有保護作用。此外，線粒體功能與血管內(nèi)皮的生長密切相關。線粒體內(nèi)ROS介導的氧化應激反應會加速血管內(nèi)皮細胞的衰老與死亡，這可能與ROS導致了線粒體的融合與分裂失衡[16]，引起了線粒體DNA突變[17]，以及與線粒體自噬功能密切相關[18]，提示線粒體功能的喪失可能會導致細胞死亡。線粒體相關動力蛋白-1（Dynaminrelated protein-1，DRP-1）可引起組織器官的IRI，有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)DRP-1對缺血缺氧條件下的皮瓣組織具有保護作用[19]。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制DRP-1的表達,可以阻止線粒體膜滲透性轉換孔（Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的開放以及PINK1/Parkin信號通路的激活，從而下調(diào)細胞內(nèi)ROS的表達，減輕血管內(nèi)皮的損傷，保護血管內(nèi)皮屏障的完整性。MRP是線粒體發(fā)育、成熟的關鍵分子，該分子的缺失可導致線粒體相關結構與功能發(fā)生障礙，從而破壞細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，造成細胞凋亡。本次實驗結果中，正常組與模型組對比，IRI后皮瓣中Mrpl32表達降低，MRP的合成減少，線粒體功能被抑制，從而導致皮瓣瘀血水腫；經(jīng)過消腫止痛合劑干預后，靶點蛋白MrpL32表達升高，并恢復MRP的功能，加快線粒體功能的恢復，可為缺血缺氧皮瓣組織提供一定的能量，并減少ROS的氧化損傷，可能有利于皮瓣組織的恢復。因此，消腫止痛合劑可能通過調(diào)控MRP通路，恢復線粒體功能，從而防治IRI皮瓣的壞死。

Psma（α亞基）與psmb（β亞基）是形成20S蛋白酶體核心顆粒的關鍵性亞單位，其與19S調(diào)節(jié)顆粒等共同形成的26S蛋白酶體復合物，可介導真核生物體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，并且通過不同的途徑參與生物體內(nèi)細胞凋亡、自噬、DNA翻譯轉錄、細胞代謝以及免疫應答等幾乎全部的生命過程[21-22]。20S蛋白酶體在體內(nèi)蛋白質(zhì)降解過程中起核心催化作用[23]。Psma2與Psma4位于20S蛋白酶結構的外側，可識別與控制底物蛋白進入20S蛋白酶體內(nèi)進行降解，可以有效防止非目標蛋白的錯誤降解[24-25]。Psmb1參與20S蛋白酶體內(nèi)側結構的構成，發(fā)揮降解底物蛋白的作用[26]。其中，Psmb1由于亞基上有蛋白酶活性，具有催化作用，因此可以切割底物蛋白上的酸性殘基，是20S蛋白酶體的活性中心之一，在底物蛋白的降解過程中具有重要作用[27]。大量的文獻報道，IRI的早期治療中，可以通過蛋白酶體抑制劑MG132抑制蛋白酶體的功能從不同信號通路減輕IRI過程中出現(xiàn)的再次損傷[28]。但有部分研究表明蛋白酶體在IRI的治療中具有重要作用。Patel等[29]通過研究蛋白酶體肽酶活性與肺IRI的功能和形態(tài)學后果之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)在肺IRI后24-72 h后，蛋白酶體失活狀態(tài)逐步解除，168 h后，蛋白酶體的活性持續(xù)增加，這表明了蛋白酶體在缺血缺氧組織的修復過程中可能具有重要作用。Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Psmb4在心肌IRI后可以通過干預NF-κB信號通路抑制心肌細胞凋亡，提示蛋白酶體在改善心肌IRI有積極意義。此外，20S蛋白酶體在急性氧化應激反應中，可以通過ATP/泛素非依賴性蛋白降解發(fā)揮作用，標記并降解氧化蛋白，減輕氧化應激的對組織器官的損害[31]。皮瓣移植術后新生血管的建立是皮瓣成活的關鍵過程。岳彩霞等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管的生成過程中，MG132可以通過抑制RhoA通路對缺氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和VEGF表達的上調(diào),來抑制腫瘤微血管的生成，從而達到治療腫瘤的目的。Ren等[33]發(fā)現(xiàn)通過抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome system，UPS）相關基因可以抑制VEGF的表達以及宮頸癌的發(fā)育，提示蛋白酶體系統(tǒng)與微血管再生之間可能有一定的聯(lián)系。蛋白酶體系統(tǒng)與炎癥反應，氧化應激反應、微血管再生有關，且前期研究表明，消腫止痛合劑可以減輕炎癥反應等對IR皮瓣的損傷，并可促進皮瓣組織微血管再生。本次實驗中通過模型組與空白組的對比，Psma2與Psma4在模型組中下調(diào)，提示IR損傷后蛋白酶體的功能被抑制，而經(jīng)過消腫止痛合劑干預后，上述靶點蛋白的表達上調(diào)，提示消腫止痛合劑可改善IR損傷皮瓣中蛋白酶體結構與功能的抑制，從而發(fā)揮抗皮瓣壞死的作用。因此，消腫止痛合劑可能通過干預蛋白酶體系統(tǒng)從而防治IRI皮瓣的壞死。

綜上所述，此次研究采用TMT蛋白質(zhì)組學技術及生物信息學分析方法分析了消腫止痛合劑對FIRI模型大鼠的皮瓣組織，結果顯示共同差異蛋白Mrpl32、Mrpl34、Psma2、Psma4、Psmb1可能是消腫止痛合劑抗FIRI的關鍵靶點蛋白；主要涉及線粒體核糖體的轉錄翻譯、20S蛋白酶體合成等生物過程；其介導的線粒體核糖體、泛素蛋白酶體系統(tǒng)等重要信號通路參與FIRI的保護過程。該研究為FIRI的中醫(yī)藥治療提供了新的靶點和研究新思路，對FIRI發(fā)病機制、新靶點藥物開發(fā)、臨床治療等具有重要指導意義。