一株適用于苦蕎米發(fā)酵的紅曲霉菌株分離與篩選

張艷艷，孫曉康，張曉元，張林軍，袁丹丹，劉英梅，陳 勉，張秀華，劉 飛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省生物藥物重點實驗室，山東省多糖類藥物工程實驗室，多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101）

中國是苦蕎麥生產(chǎn)大國，面積和產(chǎn)量均居世界第二位，出口量居第一位?？嗍w麥中富含多種營養(yǎng)成分，具有保健功能，是一種“藥食兩用”產(chǎn)品[1]。據(jù)《本草綱目》記載，苦蕎麥具有益氣、利目、健胃等功效。苦蕎麥富含蘆丁等黃酮類化合物[2]，藥理學(xué)研究表明，苦蕎麥的初級加工品苦蕎米具有降糖降脂、抗氧化、預(yù)防心腦血管系統(tǒng)疾病等作用[3-5]，是一種頗具開發(fā)潛力的功能性食品[6]。

紅曲霉屬于真菌門，是紅曲科腐生絲狀真菌，種類豐富[7]，廣泛用于傳統(tǒng)食品加工過程。紅曲色素是安全的天然色素[8]，廣泛用于食品著色。研究表明，紅曲霉代謝產(chǎn)物有非常重要的生理活性[9]，如洛伐他汀有降低膽固醇和降血脂的功效[10-12]；γ-氨基丁酸有降血壓的作用[13-14]。然而紅曲霉的產(chǎn)物桔青霉素[18]是對人畜有害的一種真菌毒素[19]，毒性主要作用于腎臟[20]，還有誘發(fā)突變、致畸、導(dǎo)致腫瘤等潛在危險[21-23]。不同紅曲霉產(chǎn)桔青霉素的能力各不相同[24]，因此高產(chǎn)洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低產(chǎn)桔青霉素成為篩選紅曲霉菌株重要指標(biāo)。

苦蕎米產(chǎn)品深層次、細(xì)化的開發(fā)研究較少，本研究結(jié)合苦蕎米的天然屬性和紅曲霉的代謝產(chǎn)物特性，以總黃酮、紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的產(chǎn)量為綜合考察指標(biāo)，篩選合適的發(fā)酵菌株，旨在進一步深化苦蕎米開發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 材料

豆腐乳、紅曲米、苦蕎米（市售）；洛伐他汀、γ-氨基丁酸對照品（分析純，阿拉?。惶J丁對照品（分析純，純度：98 %，北京百靈威科技）；孟加拉紅固體培養(yǎng)基（青島海博）；鄰苯二醛、巰基乙醇、磷酸（分析純，國藥集團）、乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；AlCl3（分析純、天津科密歐）；玻璃纖維濾紙、桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，桔青霉素免疫親和柱（Pribolab、青島普瑞邦生物）。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、RF-20A熒光檢測器（日本島津）；Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；U-T6紫外可見分光光度計（屹譜儀器）；Legend micro 21R低溫高速離心機（美國Thermo）；BSA1245電子天平（德國賽多利斯）；KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津津騰）；S201K pH計（瑞士梅特勒）；FXB101-3電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海樹立）。

2 方法

2.1 紅曲霉菌株分離純化、鑒定

取豆腐乳50 g、紅曲米50 g，分別置入200 ml無菌生理鹽水，漩渦震蕩，無菌條件下于孟加拉紅固體平板中劃線，28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取少量菌絲接種于孟加拉紅固體平板中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)7 d，繼續(xù)挑取少量菌絲轉(zhuǎn)接純化，直至得到純菌株，30 %甘油洗脫孢子置入-80 ℃冰箱保藏備用。樣品送濟南博尚生物技術(shù)有限公司進行ITS1基因序列測序，用于菌株鑒定。

2.2 紅曲霉發(fā)酵苦蕎米樣品制備

2.2.1 苦蕎米預(yù)處理 稱取苦蕎米500 g，加入1000 ml純凈水浸泡2 h，沖洗干凈后，瀝干水分，蒸煮1 h，加入0.5 %酵母粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，4 ℃冰箱保藏備用。

2.2.2 孢子懸液制備 將-80 ℃冰箱保藏的菌株于孟加拉紅固體平板中進行活化，培養(yǎng)7 d，用無菌生理鹽水洗脫孢子，轉(zhuǎn)入帶有無菌玻璃珠的三角瓶中，150 r/min震蕩30 min，打散孢子，采用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲后，利用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整孢子數(shù)量級約為106/ml，備用。

2.2.3 紅曲霉發(fā)酵 將1 ml孢子懸液接種于200 g苦蕎米固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃靜止發(fā)酵11 d。每間隔2 d混勻一次。

2.2.4 發(fā)酵樣品后處理 將發(fā)酵結(jié)束的固體發(fā)酵物置入烘箱，65 ℃烘干6～8 h至恒重，備用。

2.3 紅曲色價的測定方法

紅曲色價的測定參照GB1886.181-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅[25]的方法進行。稱取樣品5 g，沸水100 ml溶解，搖勻，靜止放涼后，混勻過濾。取此溶液置入1 cm比色皿，分光光度計505 nm測定其吸光度值（A）。色價計算：以試樣溶液濃度為1 %，1 cm比色皿，在505 nm波長處測的A計。

2.4 總黃酮的測定方法（AlCl3法[26]）

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/ml）制備：稱取蘆丁0.0255 g，采用70 %乙醇溶液溶解后，定容至25 ml，于4 ℃冰箱保藏備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0，0.050，0.075，0.100，0.125，0.150，0.200 ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1.5 % AlCl3溶液2 ml，最終用70 %乙醇定容至10 ml，混勻后，室溫靜置30 min，于273 nm波長處測定A。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的制備：稱取苦蕎麥和發(fā)酵后樣品各50 g，采用料理機粉碎，取粉碎后樣品1 g，加入70 %乙醇10 ml，溶解2 h，于273 nm波長處測定A。

2.5 洛伐他汀的測定方法

HPLC條件[27]：色譜柱 ZORBAX SB-Aq；流動相乙腈:0.01 %磷酸（V:V）=60:40；紫外檢測器；檢測波長：238 nm；流速1 ml/min；進樣量20 μl。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取洛伐他汀對照品16 mg，溶于4 ml乙腈，逐步稀釋至濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/ml，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析，以洛伐他汀濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的制備：稱取樣品5.0 g，溶于25 ml乙腈，浸泡30 min，超聲20 min后，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

2.6 γ-氨基丁酸的測定方法

HPLC條件[28]：色譜柱 ZORBAX C18；流動相：甲醇:1 %冰乙酸水（V:V）=60:40；紫外檢測器；檢測波長：332 nm；流速1 ml/min；進樣量20 μl。

柱前衍生化：衍生試劑[29]：稱取鄰苯二醛3 mg，溶于1 ml甲醇，加10 μl巰基乙醇，用0.4 mol/L（pH 10.2）硼酸緩沖溶液定容至10 ml。取0.2 ml待測樣品與0.1 ml衍生試劑，混勻反應(yīng)1 min，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取0.2 gγ-氨基丁酸溶于70 %甲醇中，定容至10 ml，逐步稀釋至濃度為0.003，0.005，0.01，0.02，0.04 mg/ml，0.22 μm濾膜過濾，經(jīng)柱前衍生化后，HPLC進樣分析，以γ-氨基丁酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的制備：稱取樣品5 g，溶于25 ml，70 %甲醇超聲20 min，5000 r/min 離心5 min，經(jīng)柱前衍生化后，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

2.7 桔青霉素檢測的測定方法

參考國標(biāo)GB5009.222-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測定[30]，紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定方法。HPLC條件：色譜柱 ZORBAX C18；流動相：乙腈:0.1 %磷酸（V:V）=90:10；熒光檢測器；激發(fā)波長：350 nm，發(fā)射波長500 nm；流速0.8 ml/min；進樣量20 μl。

桔青霉素對照品溶液：取桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（5 μg/ml）4 μl，溶于996 μl甲醇溶液，即得20 ng/ml桔青霉素對照品溶液，逐步稀釋得到濃度5，4，2，1，0.5 ng/ml桔青霉素對照品。

樣品溶液的制備：分別稱取苦蕎米及發(fā)酵樣品各1.0 g，加入20 ml，70 %甲醇提取液，超聲提取20 min，8000 r/min離心5 min，吸取上清1 ml加入49 ml 10 mmol/L磷酸溶液（pH 7.5）稀釋，采用纖維濾紙過濾，取10 ml過桔青霉素免疫親和柱，采用甲醇:10 mmol/L磷酸溶液（pH 2.5）洗脫，0.22 μm濾膜過濾，液相色譜檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅曲霉分離純化、鑒定

紅曲霉在孟加拉紅固體培養(yǎng)基生長會產(chǎn)生紅色素，基于此分離純化得到25株疑似菌株，經(jīng)濟南博尚生物技術(shù)有限公司鑒定，22株為紅曲霉，優(yōu)選長勢較快的5株菌株，編號為MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23，此5株菌在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d（見圖1），其中MZ1、MZ7和MZ18紅曲霉菌絲體呈黃色，MZ20和MZ23的菌絲體猶如白色毛毯狀。成熟后均具有皺褶，呈紅色。針對5株菌的ITS1基因序列，采用軟件MEGA11.0進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），結(jié)果表明，各菌株均屬紅曲霉種。

圖1 5株紅曲霉菌株形態(tài)

圖2 基于ITS1基因序列建立的紅曲霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 發(fā)酵后樣品色價分析

經(jīng)MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23紅曲霉菌株發(fā)酵苦蕎米的樣品，分別命名為MY1、MY7、MY18、MY20和MY23，其色價測定結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，不同紅曲霉菌株發(fā)酵的苦蕎米樣品色價均有所不同，其中樣品MY20的顏色最深，色價最高，樣品濃度為1 %、1 cm比色皿，在505 nm波長處測得A為0.395±0.008。

圖3 各樣品色價

3.3 總黃酮測定結(jié)果

以蘆丁為對照品測定總黃酮的含量，測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0332X+0.001，R2=0.9998，蘆丁在0～25 μg/ml濃度范圍內(nèi)與A呈良好的線性關(guān)系。以此方法測定苦蕎米及發(fā)酵后各樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見圖4。苦蕎米的總黃酮含量為6.49±1.61 mg/g，發(fā)酵后樣品的總黃酮含量均有不同程度的提高，其中樣品MY20的總黃酮含量最高，可達29.03±4.39 mg/g，是發(fā)酵之前的4.47倍。

3.4 洛伐他汀測定結(jié)果

以洛伐他汀對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=27 910 846.6667X+16 856.9778，R2=0.9978，洛伐他汀在10～60 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用此方法測定苦蕎米及發(fā)酵后各樣品中洛伐他汀的含量，結(jié)果見圖5?？嗍w米中洛伐他汀含量為零，不同紅曲霉菌株發(fā)酵后的洛伐他汀含量相差較大，其中樣品MY20的洛伐他汀含量最高，可達0.52±0.04 μg/g。

圖5 樣品中洛伐他汀含量

3.5 γ-氨基丁酸測定結(jié)果

以γ-氨基丁酸對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=47 319 479.1394X-10 311.0746，R2=0.9997，γ-氨基丁酸在3～40 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系?？嗍w米及發(fā)酵各樣品中的γ-氨基丁酸含量見圖6?？嗍w米中γ-氨基丁酸含量為41.06±6.58 μg/g，發(fā)酵后樣品γ-氨基丁酸含量均高于苦蕎米，MY7、MY20和MY23的γ-氨基丁酸含量分別為139.45±6.10，135.89±7.22，135.31±5.83 μg/g。

圖6 樣品中γ-氨基丁酸含量

3.6 桔青霉素測定結(jié)果

歐盟規(guī)定在紅曲霉發(fā)酵大米的食品補充劑中桔青霉素的最大限量值為 2.0 mg/kg[31]，日本規(guī)定在紅曲色素中桔青霉素的最大限量值 0.2 mg/kg[32]，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.181-2016對食品添加劑紅曲紅色素中的桔青霉素含量限定為40 μg/kg，輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2847-2007對功能性紅曲米（粉）桔青霉素含量限定為50 μg/kg。

以桔青霉素對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=105 397X-7599.3，R2=0.9909，桔青霉素在0.5～5 ng/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系?？嗍w米及發(fā)酵各樣品中的桔青霉素含量見圖7。發(fā)酵后樣品的桔青霉素均不高于國家標(biāo)準(zhǔn)和輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本研究中通過分離純化鑒定，優(yōu)選5株紅曲霉菌株，經(jīng)發(fā)酵苦蕎米，檢測發(fā)酵后樣品的色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的含量，結(jié)果顯示紅曲霉菌株MZ20發(fā)酵樣品MY20的色價、總黃酮和洛伐他汀的含量最高，樣品MY7的γ-氨基丁酸含量最高，所有樣品桔青霉素含量均不高于40 μg/kg。綜合上述實驗結(jié)果選擇紅曲霉菌株MZ20作為苦蕎米的發(fā)酵菌株。后續(xù)的實驗計劃優(yōu)化發(fā)酵條件提高色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸的含量，降低桔青霉素含量。