HPLC法測定食品中脫氫乙酸含量的方法優(yōu)化

范靈慧

上海源本食品質(zhì)量檢驗有限公司（上海 200090）

脫氫乙酸，固態(tài)為白色或略微淡黃色具有結(jié)晶性的顆粒狀粉末，無臭、沒有任何氣味、熔點108～110℃，沸點270 ℃，是一種具有低毒、高效的防腐、防霉劑。在酸、堿等環(huán)境下具有一定的抗菌功能，特別是對霉菌的抑制作用最強[1]。它通常是一種有效的消毒劑。但是過量服用會對身體產(chǎn)生一定的危害。我國允許在部分食品中添加使用。GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》中脫氫乙酸的液相色譜法前處理過程較為復雜，不同基質(zhì)處理方法不同，進樣后色譜峰拖尾嚴重，此次試驗在國標基礎上進行簡化，優(yōu)化流動相比例和不同基質(zhì)的前處理方法，使實驗操作更簡單且峰型更對稱。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀Ultimate3000（賽默飛世爾科技有限公司）；電子天平BSA 423S（德國賽多利斯公司）；超聲波清洗器FXP 20M（Unisonics Australia）；渦旋震蕩混合器BE-2600（其林貝爾儀器制造有限公司）；實驗室pH計FE20[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

乙酸銨[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]；氫氧化鈉（永華化學股份有限公司）；硫酸鋅（上海凌峰化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，美國默克公司）；氨水（永華化學股份有限公司）；超純水（上海和泰儀器有限公司實驗室超純水機制得）；0.45 μm水相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；脫氫乙酸（dehydroacetic acid）標準品（BePure，純度大于99.9%）。

標準儲備液：準確稱取0.050 g脫氫乙酸標準品，用20 g/L的氫氧化鈉溶液溶解后用水定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的標準儲備液。

標準工作液：標準儲備液經(jīng)逐級稀釋后，配制成1，10.0，50.0，100和200 μg/mL標準工作液質(zhì)量濃度。檢測用食品：市場流通渠道購買。

1.2 儀器工作條件

色譜柱DikMA Silversil 5 μm C18，250 mm×4.6 mm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長293 nm；進樣時間22 min；流動相為乙酸銨溶液（0.02 mol/L）-甲醇，洗脫比例見表1。

表1 脫氫乙酸流動相梯度洗脫比例

1.3 樣品前處理

稱取2 g試樣于50 mL玻璃比色管中，加入25 mL超純水，旋渦混合1 min，超聲提取30 min以上，取出后再次渦旋混合1 min，加入5 mL的ZnSO4溶液（120 g/L），用NaOH溶液（20 g/L）調(diào)節(jié)pH 7.5，用水定容至50 mL，搖勻，用濾紙過濾，取澄清濾液，過0.45 μm的水相濾膜后上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理中蛋白沉淀劑的選擇

分別對常用的無機沉淀蛋白體系，即亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、亞鐵氰化鉀和硫酸鋅、氫氧化鈉和硫酸鋅進行加標回收試驗。結(jié)果表明，在3種沉淀體系中氫氧化鈉與硫酸鋅沉淀法的回收率最高，故試驗選用氫氧化鈉和硫酸鋅作為蛋白沉淀劑。

2.2 色譜操作條件的確定

2.2.1 檢測波長的確定

使用DAD檢測器，在3D光譜圖上讀取到脫氫乙酸吸收峰最大時候的波長分別在230 nm和293 nm處，但是在230 nm處時，雜質(zhì)干擾多，在293 nm處雜質(zhì)干擾少，故選取檢測波長293 nm，與國標方法波長一致。

2.2.2 流動相梯度洗脫比例

脫氫乙酸抗酵母菌和霉菌的效果較好，因此被廣泛應用于面包、糕點和發(fā)酵食品中，由于這些食品中經(jīng)常會同時添加各種類型的添加劑，為使樣品中性質(zhì)差異較大的組分能達到良好的分離效果，以及洗脫干凈的目的，試驗采用梯度洗脫。洗脫比例見表1。

2.2.3 流動相pH的選擇

在相同的儀器條件下，對質(zhì)量濃度50.0 μg/mL的脫氫乙酸標品進樣后對比圖譜。使用GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》中方法，0.02 mol/mL乙酸銨-甲醇9∶1（體積比）流動相進樣圖譜如圖1所示。試驗將0.02 mol/mL的乙酸銨用氨水調(diào)節(jié)pH 9.0，初始流動相比例為甲醇-0.02 mol/mL乙酸銨1∶49（體積比），并采用表1梯度洗脫，進樣圖譜如圖2所示。

圖1 0.02 mol/mL乙酸銨與甲醇9∶1（體積比）流動相進樣圖譜

圖2 用氨水調(diào)節(jié)pH的0.02 mol/mL乙酸銨與甲醇1∶49（體積比）進樣圖譜

由圖1和圖2的圖譜對比可看出，使用試驗優(yōu)化后的流動相進樣，得到的脫氫乙酸色譜峰的峰型和對稱性較好。

2.3 線性關(guān)系

標準品質(zhì)量濃度在1.0～200.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)響應值好，峰面積的線性關(guān)系良好，線性方程y=0.482 8x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。見表2。

表2 脫氫乙酸檢出限、定量限及線性方程

2.4 回收試驗

2.4.1 國標法與試驗優(yōu)化方法回收率比較

根據(jù)GB 5009.121—2016 《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》第二法液相色譜法中12.1試樣制備與提取可知，國標法對不同的基質(zhì)有不同的前處理方式。試驗簡化后的前處理方法則可統(tǒng)一處理不同基質(zhì)的樣品，選用果蔬汁、腐乳、糕點和黃油作為試驗基質(zhì)加入脫氫乙酸標準品，分別按照國標方法和試驗方法前處理后進樣，對比它們的加標回收率，結(jié)果見表3。

表3 不同基質(zhì)樣品不同前處理方法回收率

2.4.1.1 果蔬汁

按國標方法稱樣在離心管中，需要調(diào)pH后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容，置于離心管中離心取上清液調(diào)節(jié)pH后再次定容，取5 mL過固相萃取柱，收集洗脫液后上機測定，在該前處理過程中，反復的轉(zhuǎn)移和過固相萃取柱都會造成損失。而試驗優(yōu)化后的前處理直接稱樣在比色管中，加入沉淀劑后用比色管定容即可，減少反復轉(zhuǎn)移和固相萃取柱凈化的步驟，可以提高回收率。由數(shù)據(jù)結(jié)果也可得出國標方法回收率較優(yōu)化后方法低。

2.4.1.2 腐乳

按國標方法稱樣在離心管中，轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容，超聲提取后過濾上機，回收率達99%，試驗前處理優(yōu)化后回收率也達100%，在回收率相差不大的情況下，試驗的前處理過程更為簡單和方便。

2.4.1.3 糕點

按國標法稱樣溶解加入沉淀劑定容后需要轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷重復抽提后取水相層離心，取上清液過濾膜測定，若高效液相色譜分離效果不明顯，需要取上清液調(diào)節(jié)pH后過固相萃取柱，洗脫后再上機。從表3可知，通過國標法萃取后，回收率已較低，過固相萃取柱之后損失更大，而用試驗優(yōu)化后的前處理方法，回收率較好。

2.4.1.4 黃油

根據(jù)國標法需要用正己烷抽提后離心上機，若分離效果不佳再過固相萃取柱凈化，試驗國標法回收率達103%，但是過固相萃取柱之后回收率為98%，而試驗回收率為109%，雖然操作便捷，但是試驗優(yōu)化后減少去油脂的步驟，對油脂含量高的食品檢測結(jié)果影響較大，故回收效果不如國標方法。

因此，試驗優(yōu)化后的前處理方法適用于大部分的基質(zhì)樣品，進樣后分離度好，且回收率高。國標方法若是分離效果不明顯需要再次過固相萃取柱，造成較大損失。但當樣品為油類基質(zhì)時，更推薦使用國標法。

2.4.2 方法優(yōu)化后回收率與精密度

選取蔬菜汁、腐乳、糕點樣品，按定量限的3，5和10倍范圍進行加標回收，故分別在0.015 0，0.025 0和0.050 0 g/kg三水平添加脫氫乙酸，按優(yōu)化的前處理方法進行提取和測定，每個添加水平平行測定6次，計算回收率和精密度。試驗結(jié)果表明，測得的平均回收率范圍為97.1%～104.0%，SRSD在0.34%～2.32%。測定結(jié)果見表4。

表4 添加回收率和精密度（n=6）

表5 糕點中的脫氫乙酸質(zhì)控回收率數(shù)據(jù)

2.4.3 實物質(zhì)控樣

質(zhì)控樣品為糕點中的脫氫乙酸，經(jīng)過試驗的前處理步驟后，上機測定值為0.259 g/kg，折算質(zhì)控參考值0.265 g/kg，回收率達97.8%。按照試驗方法檢測結(jié)果為滿意，數(shù)據(jù)結(jié)果證實方法的準確性好。

3 結(jié)論

試驗針對食品中脫氫乙酸的提取和分析條件在國標的基礎上進行優(yōu)化，利用高效液相色譜儀對其進行有效的分離和測定，該方法具有較好的精密度和回收率，線性關(guān)系良好，針對不同基質(zhì)也可使用同樣的前處理方法，實現(xiàn)不同基質(zhì)樣品可同時處理，對檢測任務較重的第三方檢測可以節(jié)約大量時間成本和人力成本。