響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥葛根復(fù)合飲品發(fā)酵工藝

肖勇生，周杰，鐘紅英，巫小波，周震，周洋

1.江西省檢驗檢測認(rèn)證總院食品檢驗檢測研究院（宜春 336000）；2.萬載縣輝明有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司（宜春 336000）

紫山藥屬于一種高蛋白、低脂肪、高碳水化合物的植物，既可作為蔬菜，也可作為藥材，《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》均記載紫山藥具有多種生理功效，有滋肺益腎、健脾止瀉、養(yǎng)胃等藥用價值，若長期服用，可增強(qiáng)體魄，抵抗各種疾病，并且紫山藥中富含的營養(yǎng)物質(zhì)皂苷、花青素等，有降低血脂、調(diào)節(jié)血壓、抗癌癥及降低糖尿病發(fā)病率等作用[1-3]。葛根以淀粉和纖維為主，且含有豐富的人體必需氨基酸，其總氨基酸含量達(dá)5.10～6.48 g/100 g，并含鈣、鉀、鎂、磷、鐵、鋅、銅、硒等多種人體必需的礦物質(zhì)和微量元素[4-5]。關(guān)于紫山藥和葛根的報道多圍繞成分和功效展開，如：朱延勝等[6]研究紫山藥中多酚分離純化及其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；李濤等[7]研究紫山藥抗性淀粉調(diào)節(jié)高脂血癥金黃地鼠脂質(zhì)代謝的作用；王彥平等[8]研究紫山藥薯蕷皂苷元酶法提取工藝及抗氧化性作用；肖杰等[9]研究紫山藥花青素的提純及其抗氧化性；李東等[10]研究采用微波輔助萃取法提取葛根總黃酮工藝；程浩等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化葛根酸奶發(fā)酵工藝。國外，Lin等[12]研究山藥不同組織中甾族皂苷含量；Fu等[13]定量分析山藥中的尿囊素及尿囊酸組成；Hayakaw等[14]以葛根素、大豆苷元和大豆苷作為葛根質(zhì)量的評價指標(biāo)；Kinjo等[15]發(fā)現(xiàn)葛屬植物除了含有大量異黃酮化合物外，還含有少量蘆丁、棚皮素和刺槐等黃酮類化合物。利用由紫山藥開發(fā)益生菌飲料的鮮有報道，尤其是與葛根配伍的益生菌飲品還未見相關(guān)報道。

試驗以新鮮紫山藥和葛根為原料，以乳酸菌為發(fā)酵劑制備紫山藥葛根飲品，開發(fā)一種兼具紫山藥和葛根的營養(yǎng)價值及益生菌益生功能的復(fù)合飲品，進(jìn)一步改善特色高價值農(nóng)作物利用不充分的問題，從而提高特色高價值農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)加工價值和經(jīng)濟(jì)效益，在高效率利用當(dāng)?shù)靥厣魑镔Y源的同時能較好地提升企業(yè)的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫山藥、葛根（萬載縣輝明有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）BNCC BNCC185392、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA）BNCC138598（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；MRS培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；耐高溫α-淀粉酶、糖化酶（鄭州天順食品添加劑有限公司）；乙醇、聚酰胺粉、甲苯、甲醇（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HHS21-6，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；立式高壓蒸汽滅菌器（LDZH-150L，上海申安醫(yī)療器械廠）；pH計[ST3100，奧豪斯儀器（常州）有限公司]；生化培養(yǎng)箱（BSP-400，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈工作臺（BHC-1300A2，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；紫外/可見分光光度計（SP-1920，上海光譜儀器有限公司）；高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-800KDE，昆山市超聲儀器有限公司）；層析柱（青島科諾賽生物科技有限公司）；分析天平：感量分別為0.01 mg，0.000 1 g和0.001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；多頭磁力電動攪拌器（HJ-4A，上海江星儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫山藥葛根復(fù)合飲品制作流程

將紫山藥、葛根（質(zhì)量比2∶1，下同）和水按一定料水比打漿，在攪拌罐中升溫至90 ℃添加耐高α-淀粉酶（酶添加量0.2%，酶解pH 6.5）進(jìn)行液化工藝，酶解60 min后冷卻至60 ℃添加糖化酶（酶添加量0.2%，酶解pH 4.4）進(jìn)行糖化工藝，以碘比色法判斷淀粉水解是否完全[16]。酶解完全后升溫至95 ℃以上，5 min滅酶后冷卻至37 ℃制得紫山藥葛根酶解液，接種一定比例的乳酸菌，在一定的溫度下恒溫發(fā)酵一定時間后終止發(fā)酵，發(fā)酵液過濾后并進(jìn)行調(diào)配，在30 MPa下均質(zhì)后進(jìn)行超高溫瞬時滅菌灌裝，得到紫山藥葛根復(fù)合飲料成品。

1.3.2 紫山藥葛根復(fù)合飲品發(fā)酵條件單因素試驗

1.3.2.1 發(fā)酵時間的確定

將紫山藥葛根和水按1∶3（g/mL）打漿，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌按1∶1復(fù)配，以1%接種量接種至紫山藥葛根酶解液中，在38 ℃分別發(fā)酵0，12，24，36，48，60和72 h，以總黃酮和總酸作為評價指標(biāo)，確定合適的發(fā)酵時間。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度的確定

將紫山藥葛根和水按1∶3（g/mL）打漿，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌按1∶1復(fù)配，以1%接種量接種至酶解山藥漿中，分別在30，33，36，39，42，45和48℃下發(fā)酵至1.3.2.1確定的發(fā)酵時間，以總黃酮和總酸作為評價指標(biāo)，確定合適的發(fā)酵溫度。

1.3.2.3 接種量的確定

將紫山藥葛根和水按1∶3（g/mL）打漿，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌按1∶1復(fù)配，分別按0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，1.50%，1.75%和2.00%的接種量接種至紫山藥葛根酶解液中，分別在1.3.2.2確定的發(fā)酵溫度下發(fā)酵至1.3.2.1確定的發(fā)酵時間，以總黃酮和總酸作為評價指標(biāo)，確定合適的接種量。

1.3.2.4 料水比的確定

將紫山藥葛根和水分別按1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL）打漿，將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌按1∶1復(fù)配，以1.3.2.3節(jié)確定的接種量接種至紫山藥葛根酶解液中，在1.3.2.2確定的發(fā)酵溫度下發(fā)酵至1.3.2.1確定的發(fā)酵時間，以總黃酮和總酸作為評價指標(biāo)，確定合適的料水比。

1.3.3 紫山藥葛根復(fù)合飲品發(fā)酵條件響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)響應(yīng)面軟件Design-Expert組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法。以發(fā)酵液中總黃酮和總酸為響應(yīng)值，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、料水比為自變量，分別以A、B、C、D表示，并以1，0和-1分別代表自變量的高、中、低水平，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素和水平

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 總酸的測定

紫山藥葛根復(fù)合飲品的滴定酸度按照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》[17]中規(guī)定的酚酞指示劑法進(jìn)行檢測。

1.4.2 總黃酮的測定

試樣中的總黃酮經(jīng)乙醇提取、聚酰胺粉吸附、甲苯和甲醇洗脫凈化后，以蘆丁為對照樣品，采用分光光度法在360 nm波長下測定總黃酮的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量[18]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的處理分別采用Design-Expert 6.0、Microsoft Excel（Office 2007）等軟件進(jìn)行分析及繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對結(jié)果的影響

發(fā)酵時間對紫山藥葛根復(fù)合飲品總黃酮和總酸結(jié)果的影響見圖1。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，復(fù)合飲品總酸呈不斷上升趨勢，發(fā)酵時間60 h時，總酸達(dá)到峰值為8.45 g/L，爾后趨于穩(wěn)定，說明發(fā)酵時間對總酸含量有直接的影響，當(dāng)發(fā)酵時間不足時發(fā)酵不完全[19]?？傸S酮含量隨發(fā)酵時間的延長變化不顯著，呈先下降后輕微上升趨勢，可能的原因是發(fā)酵過程中黃酮類化合物與蛋白質(zhì)等組分發(fā)生作用，或吸附或沉淀或被氧化，導(dǎo)致這些化合物部分損失[20]。綜合考慮，適宜的發(fā)酵時間為60 h。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵過程中總黃酮和總酸的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對結(jié)果的影響

發(fā)酵溫度對紫山藥葛根復(fù)合飲品總黃酮和總酸結(jié)果的影響見圖2。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵溫度的提高，復(fù)合飲品總酸呈先上升后下降趨勢，發(fā)酵溫度36 ℃時，總酸達(dá)到峰值為8.13 g/L，說明益生菌生長過程受到發(fā)酵溫度的影響，從而影響發(fā)酵的速度及發(fā)酵過程中總酸的積累[21]?？傸S酮含量隨發(fā)酵溫度的提高呈逐步下降趨勢，可能的原因是發(fā)酵過程中溫度的升高對功能成分具有一定破壞作用[22]。綜合考慮，適宜的發(fā)酵溫度為36 ℃。

2.1.3 接種量對結(jié)果的影響

接種量對紫山藥葛根復(fù)合飲品總黃酮和總酸結(jié)果的影響見圖3。結(jié)果表明，隨著接種量的增加，復(fù)合飲品總酸呈不斷上升趨勢，接種量低于1.25%時，總酸上升趨勢明顯，接種量高于1.25%時，總酸呈輕微上升或保持穩(wěn)定趨勢，接種量過小，產(chǎn)酸速率慢，發(fā)酵時間延長；接種量過大，產(chǎn)酸速率快，發(fā)酵前期酸度上升過快導(dǎo)致發(fā)酵后飲料風(fēng)味變差[23]?？傸S酮含量隨發(fā)酵時間的延長變化不顯著，呈先下降后輕微上升趨勢，可能的原因是發(fā)酵過程中黃酮類化合物與蛋白質(zhì)等組分發(fā)生作用，或吸附或沉淀或被氧化，導(dǎo)致這些化合物部分損失[24]。綜合考慮，適宜的接種量為1.25%。

圖3 接種量對發(fā)酵過程中總黃酮和總酸的影響

2.1.4 料水比對結(jié)果的影響

料水比對紫山藥葛根復(fù)合飲品總黃酮和總酸結(jié)果的影響見圖4。結(jié)果表明，隨著料水比中液體占比的提高，復(fù)合飲品總黃酮和總酸均呈先上升后下降趨勢，料水比1∶3（g/mL）時，總酸達(dá)到峰值為7.6 g/L，料水比1∶4（g/mL）時，總黃酮達(dá)到峰值為0.339 g/L，這可能是由于增加接種量會導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物濃度的增加，不利于菌種的繼續(xù)生長[25]。綜合考慮，適宜的料水比為1∶3（g/mL）。

圖4 料水比對飲料發(fā)酵過程中總黃酮和總酸的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

根據(jù)表1的試驗因素與水平進(jìn)行試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和料水比（D）進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，共計29次試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 以總黃酮含量為評價指標(biāo)的響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

2.2.2 響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析

利用Design-Expert 6軟件進(jìn)行工藝數(shù)據(jù)分析，得到總黃酮Y1和總酸Y2與自變量A、B、C、D的多元回歸方程：總黃酮（Y1）=0.29+0.016A-0.003 25B+0.002 083C-0.005 833D+0.002 264 2A2-0.003 983B2+0.003 351 7C2-0.006 685 8D2-0.002 25AB-0.007 25AC+0.004AD-0.003 25BC-0.001 75BD-0.012CD；總酸（Y2）=8.70+0.64A-0.089B+0.41C+0.053D-0.51A2-0.41B2+0.22C2+0.027D2-0.022AB-0.30AC-0.32AD+0.15BC-0.33BD+0.11CD。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型決定系數(shù)R2=0.911 8，說明回歸方程有較高的擬合度和相關(guān)性，模型預(yù)測值能較好地反映實(shí)際值[26]，可對紫山藥葛根復(fù)合飲品總黃酮含量進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項A、D、交互項CD對結(jié)果影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），二次項D2、交互項AC對結(jié)果影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。各因素對總黃酮含量的影響順序分別是A（發(fā)酵時間）＞D（料水比）＞B（發(fā)酵溫度）＞C（接種量）。

由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型決定系數(shù)R2=0.922 5，說明回歸方程有較高擬合度和相關(guān)性，模型預(yù)測值能較好地反映實(shí)際值，可對紫山藥葛根復(fù)合飲品總酸含量進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項A、C、二次項A2、B2對結(jié)果影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），交互項AC、AD、BD對結(jié)果影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。各因素對總酸的影響順序分別是A（發(fā)酵時間）＞C（接種量）＞B（發(fā)酵溫度）＞D（料水比）。

表4 以總酸為評價指標(biāo)的響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

2.2.3 各因素交互作用分析

由圖5可反映各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示2個因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[27]?？梢姡l(fā)酵時間和接種量、接種量和料水比對總黃酮交互作用響應(yīng)面曲面較陡，即發(fā)酵時間和接種量的交互作用顯著、接種量和料水比的交互作用極顯著。發(fā)酵時間和接種量、發(fā)酵時間和料水比、發(fā)酵溫度和料水比對總酸交互作用響應(yīng)面曲面較陡，即發(fā)酵時間和接種量、發(fā)酵時間和料水比、發(fā)酵溫度和料水比的交互作用顯著。其余各因素對總黃酮和總酸交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對總黃酮和總酸影響的響應(yīng)面及等高線

2.2.4 驗證試驗

以總黃酮和總酸為響應(yīng)指標(biāo)，擬合出的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵時間68.26 h、發(fā)酵溫度35.48 ℃、接種量1.51%、料水比1∶4（g/mL），此條件下總黃酮能力理論值為0.312 g/L，總酸理論值為9.26 g/L。為便于實(shí)際操作，修正參數(shù)：發(fā)酵時間68 h、發(fā)酵溫度35 ℃、接種量1.5%、料水比1∶4（g/mL），在此優(yōu)化條件下連續(xù)進(jìn)行3次重復(fù)發(fā)酵試驗，總黃酮和總酸分別為0.314 g/L和9.22 g/L，與理論值相對誤差分別為0.64%和0.43%，與理論值基本一致，說明模型擬合性良好，驗證模型的有效性，可為實(shí)際發(fā)酵提供依據(jù)。

3 結(jié)論

試驗以紫山藥和葛根為主要原料制作復(fù)合益生菌飲品，以總黃酮和總酸為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，對紫山藥葛根復(fù)合飲品的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間68 h、發(fā)酵溫度35 ℃、接種量1.5%、料水比1∶4（g/mL），制得的復(fù)合飲品總黃酮和總酸分別為0.314 g/L和9.22 g/L，為紫山藥和葛根的綜合開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。