榆黃蘑菌絲生長條件優(yōu)化

巫桂芬，蘇 勁，梁劍柳，黃秋嬋，廖建杰，蘇美琪

（廣西民族師范學(xué)院 廣西崇左 532200）

榆黃蘑（Pleurotus citrinopileatus）是一種珍稀食（藥）用真菌，學(xué)名為金頂側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌門、蘑菇目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1-3]。由于其菌蓋顯草黃色或鮮黃色，所以又稱為金頂蘑或榆黃蘑，其表面光滑、呈漏斗狀，歷來有“真菌之花”的美稱。榆黃蘑味道鮮美，營養(yǎng)豐富，屬于高營養(yǎng)、低熱量的理想保健品，市場前景廣闊[4]。榆黃蘑子實體中含有豐富的活性物質(zhì)，如多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素等，長期食用，有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥用功能[5-7]，此外食用榆黃蘑還可預(yù)防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌和肺結(jié)核桿菌的感染[8-10]。榆黃蘑符合聯(lián)合國糧農(nóng)組（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）關(guān)于新食品資源的要求，是一種高營養(yǎng)、低熱量、名貴的食藥兩用真菌，是老年人心血管疾病患者和肥胖癥患者的理想保健食品[11-13]。

培養(yǎng)基中碳源、氮源、溫度、光照度、pH 值和濕度等條件對食用菌菌絲生長有一定影響[14-16]。林鈴等[17]對榆黃蘑菌絲培養(yǎng)基中碳源進(jìn)行篩選，但未對配方中的碳含量進(jìn)行優(yōu)化試驗。洪沛等[18]、Wang等[19]歸納總結(jié)了光環(huán)境三要素（光質(zhì)、光照度、光照時長）對食用菌生長發(fā)育的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制，討論了食用菌光生理研究中存在的問題。劉妮等[20]、Wu 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不同的食用菌菌絲在顏色、形態(tài)、菌絲致密程度、滿皿時間及平均生長速度等宏觀形態(tài)上有很大差異。羅瑩等[22]、Li 等[23]通過對食用菌菌絲顏色、密度、均勻度、平均生長速率和生長指數(shù)進(jìn)行比較，探討了7 種不同谷物對試驗菌株菌絲生長的影響。我國南方地區(qū)關(guān)于榆黃蘑栽培的研究不多，尤其是在廣西等地對榆黃蘑菌絲生長條件研究甚少[24]。而榆黃蘑菌絲培養(yǎng)直接影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，進(jìn)行榆黃蘑菌絲生長條件優(yōu)化尤為重要。筆者采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，并對其生長過程所需的溫度、光照時間、瓊脂質(zhì)量濃度、pH值、碳源、氮源等條件進(jìn)行優(yōu)化。采用正交試驗方法探究不同條件對榆黃蘑菌絲生長的影響，篩選出榆黃蘑菌絲生長最佳培養(yǎng)條件，以期為榆黃蘑生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為山東省平邑縣食用菌研究所提供的平頂8-31 榆黃蘑，通過組織分離純化獲得菌絲。榆黃蘑子實體菌蓋為草黃色至鮮黃色、光滑、漏斗形，邊緣內(nèi)卷，直徑3.00～10.00 cm。菌肉白色，菌褶白色、密、延生、不等長。菌柄偏生、白色、內(nèi)實，長2.00～10.00 cm，粗0.50～1.50 cm，往往基部相連。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司），光照培養(yǎng)箱（上?；厶﹥x器制造有限公司），超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司），電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

可溶性淀粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸銨、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、硝酸銨、瓊脂粉、無水乙醇、維生素B1 等試劑藥品均為分析純。

1.3 方法

試驗時間為2021 年6 月21 日至12 月21 日，地點為廣西民族師范學(xué)院崇智樓。采用完全隨機(jī)試驗設(shè)計，共設(shè)定6 個單因素處理，每個處理3 次重復(fù)，在處理后17 d 統(tǒng)計菌絲生長量，具體設(shè)計方案如下。

1.3.1 不同光照時間對菌絲生長的影響 以光照時間為單因素變量，光照時間分別為0、12、24 h。所有處理均采用PDA 培養(yǎng)基在28 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.2 不同溫度對菌絲生長的影響 以溫度為變量，分別設(shè)定為室溫（平均溫度25 ℃）、5、28、32、35 ℃。采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種完成后將各處理置于相應(yīng)的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，記錄室內(nèi)早、中、晚各時間段溫差變化，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.3 不同瓊脂質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響 以瓊脂質(zhì)量濃度為變量，利用瓊脂質(zhì)量濃度做梯度調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的凝固程度。各處理培養(yǎng)基瓊脂質(zhì)量濃度 分 別 為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 g·mL-1。將培養(yǎng)菌絲置于28 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.4 不同pH 值對菌絲生長的影響 以pH 值為變量，各處理pH 值分別為5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.50。采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用酸或堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的pH 值并置于28 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.5 不同碳源對菌絲生長的影響 以不同碳源為變量，以PDA 培養(yǎng)基為CK，CK 的碳源為馬鈴薯，其余處理碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，處理質(zhì)量濃度為0.020 g·mL-1。通過分析篩選出最適碳源，再進(jìn)行碳源梯度試驗，其梯度處理分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。各處理置于28 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.6 不同氮源對菌絲生長的影響 以PDA 培養(yǎng)基為CK，在以上優(yōu)選的碳源培養(yǎng)基中設(shè)計不同氮源作為變量，氮源分別為硝酸銨、檸檬酸銨、蛋白胨、牛肉膏，處理質(zhì)量濃度為0.020 g·mL-1。通過分析篩選出最適氮源，再進(jìn)行氮源梯度試驗，其梯度處理分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。各處理置于28 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.7 正交試驗驗證 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選擇溫度為25、28、32 ℃，瓊脂質(zhì)量濃度0.010、0.020、0.030 g·mL-1，牛 肉 膏 質(zhì) 量 濃 度 為0.010、0.015、0.020 g·mL-1，進(jìn)行3 因素3 水平的正交試驗，每個處理設(shè)置3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 計算菌絲各水平的平均生長量及其極差，采用SPSS 20.0 進(jìn)行正交試驗以及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照時間對榆黃蘑菌絲生長的影響

由表1 可知，不同光照時間對榆黃蘑菌絲生長量的影響無顯著差異；但暗環(huán)境下菌絲轉(zhuǎn)色相對較快（圖1）。榆黃蘑在接種的次日菌絲復(fù)活，在9～13 d之間菌絲生長速度最快，一般在17～19 d 長滿。暗處理的菌絲長滿較光處理的菌絲快1～2 d。其中，12 h 光處理的菌絲在9～10 d 出現(xiàn)一次爆發(fā)性增長。從菌絲生長形態(tài)看，黑暗培養(yǎng)的菌絲生長相對較密，光照時間為12 h 的菌絲生長密度中等，光照時間為24 h 的菌絲較為稀疏?？梢姽庹諘r間長短影響菌絲生長及轉(zhuǎn)色，而黑暗條件下菌絲生長快且平穩(wěn)，后期轉(zhuǎn)色快。

圖1 不同光照時間對菌絲生長的影響（部分）Fig.1 Effect of different illumination time on hyphae growth（partial）

表1 不同光照時間對菌絲生長的影響Table 1 Effect of different illumination time on hyphae growth

2.2 不同溫度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖2 可以看出，不同溫度對榆黃蘑的菌絲生長速率影響較大。試驗期間室溫日平均溫度為25 ℃；在生長前4 d 中，由于天氣降溫，室溫處理組中菌絲生長均較慢，28 ℃處理中菌絲擴(kuò)散較快，室溫處理組中菌絲相對較密，35 ℃處理中菌絲旺盛，5 ℃處理中均未有菌絲生長。隨著天氣的回暖增溫，室溫處理中的菌絲生長逐漸加快，且相對較密，但在17 d 后所有處理的菌絲停止生長，原因是使用的膠塞為實心膠塞，菌絲生長到一定時間試管內(nèi)的氧氣不足則菌絲出現(xiàn)停止生長現(xiàn)象。從整體上來看，室溫菌絲生長受環(huán)境溫度變化影響較大，在4～9 d 室溫環(huán)境中的菌絲生長狀況優(yōu)于其他溫度處理組，試驗結(jié)果表明，崇左市當(dāng)季室溫環(huán)境有利于菌絲的發(fā)菌與吃料，但總體表現(xiàn)為25～28 ℃最適合菌絲生長。

圖2 不同溫度對菌絲生長的影響（部分）Fig.2 Effect of different temperature on hyphae growth（partial）

由表2 可知，不同溫度對榆黃蘑菌絲日均生長量的影響存在極顯著差異。在室溫、28、32 ℃的培養(yǎng)溫度下榆黃蘑菌絲生長量顯著大于5 和35 ℃。室溫、28、32、35 ℃的培養(yǎng)溫度環(huán)境下榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于5 ℃。

表2 不同溫度對菌絲生長的影響Table 2 Effect of different temperature on hyphae growth

2.3 不同瓊脂質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖3 和表3 可知，不同瓊脂質(zhì)量濃度對榆黃蘑的菌絲日平均生長量及生長速率有一定的影響。不同瓊脂質(zhì)量濃度梯度試驗中，質(zhì)量濃度低則試管環(huán)境濕度大，質(zhì)量濃度高則試管相對濕度低。從各處理來看，接種后3 d，0.01～0.06 g·mL-1處理均有菌絲生長，0.07、0.08 g·mL-1未見菌絲生長，其中，0.01 g·mL-1處理組均有菌絲生長及擴(kuò)散；0.02、0.03 g·mL-1處理也有菌絲生長，但相對較慢；而0.04、0.06 g·mL-1處理中只有部分試管有菌絲生長。接種后6 d，0.04、0.05、0.06 g·mL-1處理中的菌絲生長相對較好；0.03～0.06 g·mL-1處理中接種部位菌絲生長密集形成類似球狀，其中0.03 g·mL-1處理中菌絲相對較為稀疏，0.04～0.06 g·mL-1處理中菌絲相對濃密。結(jié)果表明，試管內(nèi)的濕度對菌絲生長影響表現(xiàn)為濕度越高菌絲生長越快，菌絲稀疏；濕度越低菌絲生長越慢，菌絲濃密。

圖3 不同瓊脂濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.3 Effect of different agar concentration on hyphae growth（partial）

表3 不同瓊脂質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響Table 3 Effect of different agar concentration on hyphae growth

由表3 可知，不同瓊脂質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲日均生長量的影響呈極顯著差異。0.01～0.04 g·mL-1的瓊脂培養(yǎng)的榆黃蘑菌絲生長量顯著大于0.05～0.08 g·mL-1，0.01～0.06 g·mL-1的瓊脂培養(yǎng)的榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于0.07～0.08 g·mL-1。

2.4 不同pH值對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖4 和表4 可知，pH 值在5.00～8.50 之間對榆黃蘑菌絲生長的影響表現(xiàn)為前期影響小、后期影響變大。在制備培養(yǎng)基的過程中，pH 值越高，培養(yǎng)基中的瓊脂凝固得越快，反之則不易凝固。在接種后3 d，pH 6.00、6.50、7.00、7.50 處理中的接種部位菌絲生長較密。而在接種后12 d，pH 6.50 處理中的菌絲均已長滿培養(yǎng)基，其他處理的菌絲還未長滿。接種后15 d，pH 5.50、6.00 處理中菌絲均長滿培養(yǎng)基，pH 7.00、7.50、8.00、8.50 處理中菌絲均長滿培養(yǎng)基且長出培養(yǎng)基外。

圖4 不同pH 值對菌絲生長的影響（部分）Fig.4 Effect of different pH on hyphae growth（partial）

表4 不同pH 值對菌絲生長的影響Table 4 Effect of different pH on hyphae growth

由表4 可知，不同pH 值對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。pH 值在5.00～8.50 范圍內(nèi)，雖培養(yǎng)基瓊脂凝固程度受pH 值的影響，但對菌絲生長并無顯著影響。

2.5 不同碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響

2.5.1 碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響 由表5 和圖5 可知，不同碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。碳源為淀粉時，榆黃蘑菌絲日平均生長量最大，為0.83 cm。碳源為蔗糖時，榆黃蘑菌絲日平均生長量為0.79 cm。其次是CK、葡萄糖和麥芽糖。后續(xù)試驗選取菌絲日平均生長量最大的淀粉作為碳源的梯度試驗。

圖5 不同碳源對菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on hyphae growth

表5 不同碳源對菌絲生長的影響Table 5 Effect of different carbon sources on hyphae growth

2.5.2 淀粉質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由表6 和圖6 可知，不同淀粉質(zhì)量濃度對榆黃蘑的菌絲生長影響較小。接種后5 d，0.005 g·mL-1淀粉處理的培養(yǎng)基表面菌絲顏色淺；0.010 g·mL-1淀粉處理的培養(yǎng)基表面菌絲均變白；0.015 g·mL-1淀粉處理的菌絲顏色淺；0.020 g·mL-1淀粉處理的菌絲較為稀疏；0.025 g·mL-1淀粉處理的菌絲顏色較淺；0.030 g·mL-1淀粉處理的菌絲長勢相對較強(qiáng)；0.035 g·mL-1淀粉處理的菌絲相對較密。以上各處理菌絲長滿培養(yǎng)基后，菌絲生長情況均無明顯區(qū)別，通過單因素方差分析得知，不同淀粉質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。

圖6 不同淀粉質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.6 Effect of different starch content on hyphae growth（partial）

表6 不同淀粉質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響Table 6 Effect of different starch content on hyphae growth

2.6 不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響

2.6.1 氮源篩選 由表7 和圖7 可知，不同氮源對榆黃蘑菌絲生長有選擇性作用。培養(yǎng)基的氮源為牛肉膏時，榆黃蘑菌絲日平均生長量最大，為0.68 cm；其次是CK、蛋白胨、硝酸銨和檸檬酸銨。而檸檬酸銨對榆黃蘑菌絲生長具有抑制作用，因此，以牛肉膏作為榆黃蘑培養(yǎng)的最佳氮源。通過單因素方差分析得知，不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。

圖7 不同氮源對菌絲生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on hyphae growth

表7 不同氮源對菌絲生長的影響Table 7 Effect of different nitrogen sources on the growth of hyphae

2.6.2 牛肉膏質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響 由圖8 和表8 可知，不同牛肉膏質(zhì)量濃度影響榆黃蘑菌絲的生長。接種后2 d，牛肉膏質(zhì)量濃度由低到高的培養(yǎng)基依次陸續(xù)有菌絲長出。接種后5 d，0.020～0.035 g·mL-1牛肉膏處理中，起初生長出來的菌絲出現(xiàn)被溶解的假象。接種后9 d，0.020～0.035 g·mL-1牛肉膏處理中，再次出現(xiàn)白色菌絲，逐漸變密。接種后16 d，0.005 g·mL-1牛肉膏處理中的菌絲最早長滿培養(yǎng)基，其他依次為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。試驗結(jié)果表明，過量的氮源會抑制榆黃蘑菌絲的生長，待菌絲對生長環(huán)境調(diào)整適應(yīng)后又開始陸續(xù)生長、變密。

圖8 不同牛肉膏質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.8 Effect of different beef extract contents on hyphae growth（partial）

表8 不同牛肉膏質(zhì)量濃度對菌絲生長的影響Table 8 Effect of different beef extract contents on hyphae growth

不同牛肉膏質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在顯著差異。0.015、0.020 g·mL-1牛肉膏處理的榆黃蘑菌絲生長量顯著大于0.030、0.035 g·mL-1牛肉膏處理。0.010 g·mL-1牛肉膏處理的榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于0.035 g·mL-1牛肉膏處理，而0.005、0.025 g·mL-1牛肉膏處理均與其他處理組無顯著差異。

2.7 榆黃蘑菌絲培養(yǎng)條件正交試驗分析

由表9 可知，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇溫度 為25、28、32 ℃，瓊 脂 質(zhì) 量 濃 度0.01、0.02、0.03 g·mL-1，牛 肉 膏 質(zhì) 量 濃 度 為0.010、0.015、0.020 g·mL-1，進(jìn)行3 因素3 水平的正交試驗。根據(jù)分析可知，溫度、瓊脂質(zhì)量濃度、牛肉膏質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲的影響順序為溫度＞瓊脂質(zhì)量濃度＞牛肉膏質(zhì)量濃度。其中，榆黃蘑菌絲培養(yǎng)條件最佳組合為溫度32 ℃以及0.01 g·mL-1的瓊脂和0.015 g·mL-1的牛肉膏。

表9 菌絲生長條件正交試驗分析Table 9 Analysis of orthogonal test on hyphae growth conditions

3 討論與結(jié)論

筆者以榆黃蘑作為試驗材料，對其菌絲生長條件中光照時間、溫度、瓊脂質(zhì)量濃度、pH、碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化篩選，為榆黃蘑的生產(chǎn)與推廣提供技術(shù)支持。結(jié)果表明，光照時間、pH、碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響均不存在顯著差異，但光照時間影響菌絲轉(zhuǎn)色，光照時間越長，轉(zhuǎn)色時間越久，黑暗環(huán)境下可以加快菌絲轉(zhuǎn)色。根據(jù)馬瑋超等[25]、雷萍等[26]研究推測，榆黃蘑菌絲轉(zhuǎn)色與濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶、漆酶、多酚氧化酶活性有關(guān)，光照條件下榆黃蘑菌絲相關(guān)酶活性受到抑制，從而抑制了菌絲的轉(zhuǎn)色。pH 值試驗表明，pH 值越高瓊脂凝固越快，而pH 6.50 菌絲生長濃密程度及瓊脂凝固程度都相對較適宜。原因是瓊脂的組成成分在酸性介質(zhì)中會水解生成還原糖或低聚糖，從而弱化了瓊脂的凝固作用[27]。碳源為0.03 g·mL-1淀粉時，菌絲生長情況及濃密程度相對較適宜。碳源是微生物菌絲生長發(fā)育活動的主要能量來源，碳源豐富有利于菌絲的生長，但過量的碳源起不到促進(jìn)生長的作用。

不同溫度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。榆黃蘑菌絲在崇左市夏季和秋季的室溫及28、32、35 ℃的恒溫環(huán)境下均可生長，溫度過低抑制菌絲生長，溫度過高會出現(xiàn)溶菌的現(xiàn)象，單因素試驗結(jié)果表明，室溫（日均溫度25 ℃）為榆黃蘑菌絲生長的最適宜溫度條件。溫度過高使某些蛋白酶類發(fā)生變質(zhì)，從而出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，控制溫度可以改善菌絲的生長情況。不同瓊脂質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。在封閉試管內(nèi)瓊脂質(zhì)量濃度越低，濕度越大，菌絲生長越快，瓊脂質(zhì)量濃度越高，濕度越小，菌絲生長越慢。由于水是物質(zhì)反應(yīng)必不可少的成分，因此環(huán)境中缺水不利于菌絲的生長。

不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響呈極顯著差異，其中牛肉膏為榆黃蘑菌絲生長最佳氮源。不同牛肉膏質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長量的影響存在顯著差異。正交試驗結(jié)果表明，0.015 g·mL-1牛肉膏為最佳含量。過量的氮源會抑制榆黃蘑菌絲的生長，但缺少氮源也不利于菌絲的生長，因此，合適的氮源是種植榆黃蘑的一個關(guān)鍵因素。溫度、濕度及氮源對榆黃蘑菌絲生長有較大的影響，因此，選擇合適的溫度、濕度及氮源對提高榆黃蘑菌絲長勢有重要意義。正交試驗結(jié)果表明，溫度、瓊脂質(zhì)量濃度、牛肉膏質(zhì)量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響順序為溫度＞瓊脂質(zhì)量濃度＞牛肉膏質(zhì)量濃度。因而在榆黃蘑菌絲培養(yǎng)過程中，要認(rèn)真把握好培養(yǎng)的溫度、氮源的選擇、氮源的含量、瓊脂質(zhì)量濃度等條件，從而更有利于菌絲穩(wěn)健生長。